用於產生誘導多能幹細胞(iPS)的細胞類型及其製備方法和應用的製作方法

2023-06-16 19:44:36 5

專利名稱：用於產生誘導多能幹細胞(iPS)的細胞類型及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及細胞領域，特別涉及四種可誘導產生誘導多能幹細胞(iPS)並具有異 體移植前景的細胞類型及其製備方法和應用。
背景技術：
幹細胞(stem cells)是人體及其各種組織細胞的初始來源，其最顯著的生物學特 徵是既有自我更新和不斷增殖的能力，又有多向分化的潛能。幹細胞根據不同的來源分為 成體幹細胞(somaticstem cells)和胚胎幹細胞(embryonic stem cells, ES細胞)。成 體幹細胞包括骨髓間充質幹細胞、胰腺幹細胞、神經幹細胞等，在成體組織中存在的。1981年，ES細胞的分離和培養首先在小鼠中獲得成功，是至今研究最廣泛、最成 熟的幹細胞體系。而人的幹細胞的代始於1998年，美國威斯康辛大學(University of Wisconsin)科學家湯姆森(James A. Thomson)帶領研究團隊首次從人類胚胎組織中提 取培養出胚胎幹細胞(Embryonic Stem Cell, ES Cell)株，並且證實此株細胞具有全能 幹細胞特徵，此項研究論文發表在1998年11月6日出版的頂級學術期刊Science上面。 (詳見Thomson, J. Α. , J. Itskovitz-Eldor, S. S. Shapiro, Μ. Α. Waknitz, J. J. Swiergiel, V. S. Marshall, and J. Μ. Jones. " Embryonicstem cell lines derived from human blastocysts. 〃 Science 282(1998) :1145_1147。Thomson 等人，從人胚泡中獲取胚胎幹細 胞系，科學，282 (1998) :1145-1147。)這篇論文標誌著一個時代的到來，而湯姆森也被人稱 作〃幹細胞研究之父〃。hES(人胚胎幹細胞)細胞研究的應用前景主要是再生醫學領域，在組織工程學領 域中以hES細胞作為種子細胞，可為臨床上細胞、組織或器官的移植治療提供大量的材料。 通過控制hES細胞分化培養環境、轉染能夠促進ES細胞定向分化的關鍵分子基因等體外誘 導分化策略，可獲得特異性的組織細胞類型。這類細胞用於移植治療，將給糖尿病、帕金森 氏病、脊髓損傷、白血病、心肌損傷、腎衰竭、肝硬化等疾病的治療帶來新的希望。然而，一直以來，hES細胞研究面臨著許多難題和爭議，主要包括以下幾個方面 (1)供體卵母細胞的來源困難，hES細胞建系效率低。此外，SCNT技術的不成熟必將需要 進一步耗費更多的人類卵母細胞，故而其來源難以得到保證。(2)免疫排斥反應，除非採用 SCNT技術，否則患者對hES細胞分化而來的各種細胞和組織仍然存在免疫排斥反應。(3) hES細胞具有成瘤性，移植到受體的體內後有發展為腫瘤的可能性，即使採用SCNT技術、給 移植細胞設置自殺基因等應對措施，也不一定能夠很好地解決這個問題(4)體外保持hES 風險。同樣，慢病毒轉染技術可能也存在類似的風險。為避開hES細胞和治療性克隆研究的倫理學爭論，需要找到一種替代途徑，以便 將人類的體細胞直接轉化為多潛能幹細胞，為患者提供「個性化」的自體幹細胞。2003年， Gurdon研究小組發現，將已完全分化的小鼠胸腺細胞或成人外周血淋巴細胞的細胞核注入 爪蟾卵母細胞後，哺乳動物細胞核的分化標誌物喪失，而哺乳動物幹細胞中最具特徵性的
3標誌物0ct4則呈高表達，提示哺乳動物細胞核可直接被兩棲動物卵母細胞核泡所重構從 而表達 0ct4 (Byrne JA 等人，Nucleiof adult mammalian somatic cells are directly reprogrammed to oct_4 stem cell geneexpression by amphibian oocytes.Curr Biol 2003 ；13 :1206-1213)o Byrne JA等人，成年哺乳動物體細胞核可直接被兩棲動物卵母細胞 核泡所重構從而表達0ct4.當代生物學，2003 ；13 :1206-1213)。2006年，日本京都大學Yamanaka研究小組採用體外基因轉染技術，從24個因子中 篩選出0ct4、Sox2、c-Myc、Klf4等4個轉錄因子，通過逆轉錄病毒將上述4個轉錄因子導 入胚胎小鼠成纖維細胞或成年小鼠尾部皮膚成纖維細胞，在小鼠ES細胞的培養條件下獲 得了 Fbxl5+的多潛能幹細胞系，該細胞系在細胞形態、生長特性、表面標誌物、形成畸胎瘤 等方面與小鼠ES細胞非常相似，而在基因表達譜、DNA甲基化方式及形成嵌合體動物方面 卻不同於小鼠ES細胞，故將其命名為誘導的多能性幹細胞(iPS細胞)。Yamanaka研究小組利用相同的技術，將上述同樣的4個轉錄因子導入到人皮膚成 纖維細胞中，也成功獲得了 iPS細胞。原代人類成纖維細胞樣滑膜細胞和源自新生兒成纖 維細胞的細胞系同樣也可被重構成為iPS細胞。這類iPS細胞在細胞形態、增殖能力、表 面抗原標誌、基因表達譜、多潛能幹細胞特異性基因的表觀遺傳學狀態、端粒酶活性等方面 與hES細胞相似，並且在體外培養時和在小鼠體內畸胎瘤形成中均可分化為3個胚層的不 同細胞類型(Takahashi K et al, Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 2007 ;131 :861_872。 Takahashi K ·入， 利用特定因子誘導成人成纖維細胞到多能幹細胞，細胞，2007 ;131 :861-872)。與此同時， 威斯康辛大學Thomson研究小組也報導了成功誘導胎兒成纖維細胞轉化為具有hES細胞基 本特徵的人類iPS細胞，所不同的是他們使用慢病毒作為載體，並在14個候選基因中選擇 了 0ct4、Sox2、Nanog、Lin28 等 4 個基因進行轉導(Yu J et al, Induced pluripotentstem cell lines derived from human somatic cells. Science 2007 ;318 :1917_1920o俞君英 等人，從人的體細胞誘導成為多能幹細胞系，科學，2007 ;318 :1917-1920)。這一被學界稱 為生物科學「裡程碑」的重大突破有望幫助科學家繞過克隆技術的倫理、道德紛爭，為醫學 應用打開大門。Park IH 等人(Reprogramming of human somatic cells to pluripotency withdefined factors. Nature 2008;451:141-146。利用特定因子將人的體細胞重編程 為多潛能細胞，自然，2008 ；451 141-146)利用來自胎兒、新生兒及成人的皮膚或肺部的 原代成纖維細胞，其中包括來自1名健康男性皮膚活檢得到的成纖維細胞，採用Yamanaka 研究小組的策略也獲得了相同的結果。他們還發現0ct4和Sox2在誘導重構為iPS細胞 過程中是必需的，正是這兩個轉錄因子維持了人類iPS細胞的多潛能性，而Klf4和c-Myc 的作用是改變染色質的結構，從而有利於0ct4和Sox2的結合，以提高誘導的效率。此 外，這項研究的重要意義在於將取自皮膚活檢的成纖維細胞誘導為iPS細胞。上述研究 表明，從活檢人類皮膚組織中提取體細胞後進行誘導以製備患者特異性的幹細胞是可 行的，因而有望克服細胞移植治療中存在的免疫排斥反應。2008年10月，Juan Carlos IzpisiiaBelmonte 令頁導的/J、組(Juan Carlos Izpisiia Belmonte et al. Efficient and rapidgeneration of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. NatureBiotechnology. 2008. 26 :1276-1284 ；胡安·卡洛斯·伊茲皮索阿·貝爾蒙特等人，人的角質細胞可被高效快速地誘導為多能幹細胞，自然_生物技術，2008. 26 1276-1284) 利用一根頭髮上的角質細胞成功高效誘導出iPS細胞，大大推動了 iPS的醫學應用進程。鑑於導入C-MyC基因可使嵌合體小鼠的腫瘤發生率高達20%，可能會阻礙其未來 的臨床應用。因此，Yamanaka研究小組新近報導，小鼠和人類皮膚成纖維細胞轉染c-Myc以 外的其餘3個基因，在調整培養條件後也可得到iPS細胞。去除c-Myc基因儘管可使未來 臨床應用的安全性顯著提高，但形成iPS細胞的效率卻明顯降低。雖然嵌合體小鼠在100 天內沒有腫瘤發生，但逆轉錄病毒的再激活仍有導致腫瘤發生的潛在風險。同樣，慢病毒轉 染技術可能也存在類似的風險。針對這一風險，科學家一直在努力尋找一種可以表達外源基因但外源基因非整合 到基因組上的方法。2009年3月5日，Cell報導Rudolf Jaenisch研究小組利用Cre-重 組酶系統使誘導成功的帕金森病人iPS細胞無外源因子，使iPS的臨床應用又推進了一步， 但是這種方法的缺點是仍有載體存留在基因組中(Rudolf Jaenisch等人，帕金森病人來源 的誘導多能幹細胞無外源因子.細胞.2009. 136 964-977)。隨後這一缺陷被另一組科學家 克服。2009年3月26日，Science即出現俞君英等通過一種非整合質粒Episomal Vector 成功誘導出無外源基因也無載體整合到基因組上的iPS(俞君英等人，無載體也無外源基 因序列的人的誘導多能幹細胞.科學.2009. 324:797-801)。他們用一種叫做核轉染的方 法將這些質粒介入到人包皮細胞中，在質粒中的基因所表達的蛋白質會將細胞重新編程並 使其成為iPS細胞。這些iPS細胞在接著的幾輪細胞分裂中會開始失去這些質粒，這樣研 究人員就可以分離出不含質粒的細胞。這一發現非常重要，它是人們向iPS細胞的臨床應 用邁出了關鍵性的一步。這一方法雖然臨床應用的安全性大大提高，但是重編程過程中培 養條件有待優化。不同的細胞類型在重編程效率不同，相同的細胞類型在不同的培養條件 下重編程效率也不同。重編程效率太低，在以後的研究中有待克服。儘管已經證明了病毒轉導一系列外源因子可以使得人的成纖維細胞的後生和轉 錄狀態重置成多能胚胎幹細胞(ES細胞)的狀態(Takahashi K，Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by definedfactors. Cell. 2007 ;131 :861_8720 Yu Junying, James A. Thomson et al, Science. 2007 ；318 1917-1920 ；)，並且隨著科學的發展，無外源因子整合到基因組和既無載體也無外源因子整 合的基因組的人iPS技術出現(Rudolf Jaenisch等人，帕金森病人來源的誘導多能幹細胞 無外源因子，《細胞》，2009. 136 :964-977)，但是由人成纖維細胞得到的iPS細胞效率極低， 整合型外源因子得到的iPS細胞的效率約0. 01-0. 02% ；非整合型如俞君英最新的報導無 外源因子也無載體序列插入基因組得到的iPS的效率更低，約百萬分之三到六。於是人們 開始尋找具有更高重編程能力的細胞類型，2008年10月，Juan Carlos Izpistia Belmonte 領導的小組利用一根頭髮上的角質細胞成功高效誘導出iPS細胞，報導稱其效率較成纖維 細胞提高約100倍。

發明內容
本發明的第一個目的在於提供具有異體移植前景的細胞類型，本發明提供的該細 胞類型共有四種，為羊水細胞和三種胎盤來源的間充質細胞——羊膜間充質細胞，絨毛膜 間充質細胞及臍帶間充質細胞。
本發明的第二個目的在於提供既具有異體移植前景的，又能相對高效產生誘導多 能幹細胞(iPS)的細胞類型，該細胞類型為胎盤來源的絨毛膜間充質細胞。同時，提供其誘 導重編程方法，包括如下步驟(a)將包含多能性幹細胞因子的cDNA分別導入胎盤來源的三種間充質細胞；(b)在適宜步驟(a)中所述的胎盤來源細胞生長的培養基上進行培養。上述誘導重編程方法，還可以包括如下步驟(C)初步鑑定多能性幹細胞克隆。優選的，上述步驟(a)中的cDNA通過病毒載體感染所述胎盤來源的三種間充質細 胞。優選的，所述病毒載體為逆轉錄病毒載體。更優選的，所述逆轉錄病毒載體為pMX。優選的，上述步驟(a)中的多能性幹細胞因子包括Sox2、0ct4和Klf4。更優選的，上述步驟(a)中的多能性幹細胞因子為SOX2、0Ct4、C-myC和Klf4。優選的，所述羊水細胞和胎盤來源的三種間充質細胞(羊膜間充質細胞、絨毛膜 間充質細胞及臍帶間充質細胞)為人的羊水細胞和人的胎盤來源的細胞。上述過程中應用的培養基有兩種情況一種是以含有特級胎牛血清(Defined Fetal Boyine Serum,D-FBS)的人胚胎幹細胞培養基為基礎，加入抗氧化劑(Antioxidant， A)，也可以再加上丙戊酸(valproic acid, VPA)，適用於絨毛膜間充質細胞；另一種是以 血清替代品(Knockout SerumReplacement, KSR)為基礎，加入鹼性成纖維細胞生長因子 (basic FibroblastGrowth Factor, bFGF)，也可以再加上丙戊酸。該情況適用於所有的三 種細胞類型。其中，優選的，所述抗氧化劑包括維生素Bi、維生素C、還原型穀胱甘肽或亞硒酸 鈉，或者前三者，或者僅含維生素C。本發明的第三個目的在於，提供四種具有異體移植前景並可產生誘導多能幹細胞 (iPS)的細胞類型在經誘導重編程獲得多能性幹細胞後的用途。上述多能性因子可以是任何來源的，優選為人的多能性因子以及其變體，如 Sox2, NCBI 登錄號為 NM_003106. 2(SEQ ID NO 1) ；0ct4, NCBI 登錄號為 NM_002701. 4 (SEQ ID NO 2) ；Klf4, NCBI 登錄號為 NM_004235. 4 (SEQ ID NO 3) ；c-Myc, NCBI 登錄號為 NM_002467. 3(SEQ ID NO 4)。與現有技術公開的其它可以被誘導為iPS的細胞不同，胎盤組織來源的細胞不僅 可以誘導形成iPS，而且絨毛膜間充質細胞誘導重編程的效率大於成纖維細胞，該細胞類型 在轉錄人的四個外源因子Sox2，0ct4, Klf4，c-Myc後，在DFBS+A+VPA培養基上後可以高效 誘導為iPS細胞，效率約為2. 3%左右，與成纖維細胞相比效率提高超過100倍，略高於角質 細胞；而且產生的這些誘導多能性幹細胞多能性標記物的表達水平與人胚胎幹細胞相近， 同時外源因子沉默。這對於今後通過使用誘導的多能性細胞，而非直接從人體提取的胚胎 幹細胞，利用組織再生醫學建立疾病模型，進行藥物篩選，控制定向分化提供了更加有效且 更加具有針對性的手段。本發明發現略高於已報導的角質細胞。本申請的發明點在於用於誘導iPS的細胞——羊水細胞、絨毛膜間充質細胞、羊膜 間充質細胞和臍帶間充質細胞。所述的四種細胞，其中三種來自人的胎盤組織，另外一種細 胞是來源羊水的羊水細胞。胎盤組織和羊水都容易得到，易於處理，不需要侵入性操作，對
6其研究不會涉及倫理道德問題，因此目前已成為尋找人類幹細胞來源的研究熱點。胎盤(placenta)是後獸類和真獸類哺乳動物妊娠期間由胚胎的胚膜和母體子宮 內膜聯合長成的母子間交換物質的過渡性器官。胎兒在子宮中發育，依靠胎盤從母體取得 營養，而雙方保持相當的獨立性。胎盤還產生多種維持妊娠的激素，是一個重要的內分泌器 官。人類胎盤是胎兒與母體之間進行物質交換的器官。由羊膜、葉狀絨毛膜(也稱叢密絨 毛膜)和底蛻膜構成。1.羊膜構成胎盤的胎兒部分，是胎盤的最內層。羊膜光滑醫學教育網，無血管、神 經及淋巴，具有一定的彈性。2.葉狀絨毛膜構成胎盤的胎兒部分，是胎盤的主要部分。胚胎發育至13 21日 時，胎盤的主要結構_絨毛逐漸形成。約在受精後第3周，當絨毛內血管形成時，建立起胎 兒胎盤循環。多數絨毛呈游離狀態，浸浴在血池的母血之中，少數絨毛與底蛻膜融合起固定作 用。絨毛由中軸的間質和被覆的滋養層形成，在絨毛間質中含有豐富的毛細血管，它們與臍 動脈及臍靜肪相連，是屬於胎兒血循環系統。由於母血與兒血之間間隔著毛細血管壁、絨毛 間質以及絨毛表面的滋養層細胞，因此正常情況下母血與兒血不能直接相通。當胎兒與母 體血液進行物質交換時，這些物質也必須透過這幾層結構。正常足月妊娠時胎盤重約500 克，呈扁圓形，一面光滑，附有臍帶與胎兒相連，另一面粗糙，和母體的子宮內膜相連。胎盤 是維持胎兒生長發育的重要器官，有很重要的生理功能。通過胎盤絨毛間隙內母子血液間 的物質交換，供應胎兒所需要的營養物質如氧、葡萄糖、胺基酸、脂肪酸、維生素、無機鹽及 水分等，運走胎兒不需要的代謝廢物如二氧化碳、尿酸及肌酐等。胎盤也是重要的內分泌器 官，可分泌多種激素，主要有絨毛膜促性腺激素、胎盤促生長激素、雌激素和孕激素等。培養的胎盤來源的三種間充質細胞的形態學特徵和骨髓基質細胞相近，均呈梭形 錐形及多角形，為典型的成纖維細胞樣，並呈漩渦狀生長。胎盤來源的間充質細胞與骨髓基 質細胞類似，均表達CD9、CD29、CD44、CD105、CD106、人類白細胞抗原ABC (human leucocyte antigen ABC, HLA-ABC)，不表達⑶34、⑶40L和HLA-DR ；但與骨髓基質細胞相比，胎盤來 源的間充質細胞還階段特異表達的胚胎抗原1 (stage-specific embryonic antigen 1， SSEA-1)、SSEA-3、SSEA-4、腫瘤排斥抗原(tumor rejection autigen，TRA)-1-60、TRA-1-81 表達更高。近年來，產前診斷的技術發展迅速，取材來源更趨於多樣化，研究發現在孕中期運 用羊水細胞學檢查進行產前診斷是比較具有臨床價值的。從羊水細胞染色體核型可以判斷 染色體是否異常，從而了解孕中期異常核型出現的頻率，類型及與各種產前診斷指徵之間 的關係。事實上，研究證實羊水細胞具有了很大的治療性應用前景。2003年，奧地利學者首 先從羊水中分離出幹細胞)，這些細胞除了表達人幹細胞標記分子之一 0ct4以外，還表達 幹細胞相關標記vimentin和alkaline phosphatase。2004年，研究人員報導羊水細胞還 表達神經幹細胞的表面標記和端粒酶及Oct-4、等多能幹細胞的表面標記。隨後，羊水幹細 胞被發現也表達間充質幹細胞相同的表面標記。2007年，美國研究人員從人和鼠的羊水中 分離出多能幹細胞(這些幹細胞可以分化為多種類型的細胞)。羊水中分離出有胚胎幹細 胞和成體幹細胞表達標誌物的羊水幹細胞(AmnioticFluid-derived Stem-cell, AFS)，發 現羊水幹細胞具有良好的多能性。通過逆轉錄病毒標記的複製人體細胞系可以被誘導分化
7成胚胎各胚層的細胞類型，包括脂肪細胞、骨細胞、肌細胞、內皮細胞、神經元細胞和肝細胞 系。人羊水幹細胞來源的分化細胞表現出特定的功能，包括神經元細胞系可分泌神經遞質， 肝細胞系產生尿素，骨細胞系可形成組織工程骨骼。這項研究表明羊水幹細胞界於胚胎幹 細胞和成體幹細胞之間，同時也證實了羊水幹細胞具有很大的治療潛力，是幹細胞研究的 一大突破。另外，羊水細胞通過羊水穿刺獲取的簡易途徑，以及羊水幹細胞表現出相對低的 免疫原性，使其被認為是獲取幹細胞提供了第三種路徑，也被認為其將更有利於進行同種 異體之間的移植，具有很大的治療性應用前景。一些使用羊水幹細胞開展的人體組織試驗 性研究也正在進行中。日前，瑞士學者在美國心臟學會(AHA)科學年會上報告，他們從羊水 中提取幹細胞，並用其成功培育出人類心臟瓣膜。由於該瓣膜來源於胎兒的自體細胞，因此 移植後不會產生排斥反應，而且瓣膜還可以和機體同步生長，基本上與自體瓣膜無異。這項 研究結果提示，將來或許可以在先天性瓣膜疾病胎兒出生前就利用其幹細胞預製出心臟瓣 膜，在其出生時直接進行瓣膜移植以徹底治癒疾病。不過，這種組織工程心臟瓣膜尚處於研 究起步階段，離真正的臨床應用尚有差距。由於人們仍不能確定羊水幹細胞到底能培育出 多少種類型的細胞，而且研究還在初步階段，廣泛開展臨床試驗可能還需要數年時間。


圖1是顯微鏡下觀察三種胎盤組織來源的間充質細胞(A =AMCs, B =CMCs, C UBCs)、羊水細胞(D =Amniocytes)及其誘導得到的hES樣克隆形態圖；放大倍數100倍。圖2是三種胎盤組織來源的iPS細胞AP染色結果及其中絨毛膜間充質細胞在兩 種不同培養基中(DFBS+A，0. 4% ；DFBS+A+VPA, 2. 3% )誘導iPS細胞效率計算；圖3是三種胎盤組織來源iPS hES標誌物表達水平鑑定及外源因子表達水平檢測 結果圖。
具體實施例方式1.定義和技術除非另外指明，本發明的實踐將使用分子生物學、微生物學、細胞生物學、免疫學 和重組DNA的傳統技術，其屬於本領域技術範圍。參見分子克隆實驗指南，第3版(2002)， Sambrook, Fritsch和Maniatis編著；現代分子生物學實驗方法(F. M. Ausubel等人編著 (1987))；酶學方法(Academic Press, Inc.) ；PCR2 實用方法，Μ· J. MacPherson，B. D. Hames 和G.R. Taylor編著，(1995)；抗體，Harlow和Lane編著，(1988)；動物細胞培養實驗室手 冊，R. I. Freshney 編著，(1987)；幹細胞手冊，卷 2，W. FrenchAnderson 等人編著。本文中使用的一些術語具有下列定義的含義。在說明書和權利要求書中使用的，單數型「一個」，和「這個」包括複數參考，除非上 下文另有清楚的表述。例如，術語「(一個)細胞」包括複數的細胞，包括其混合物。所有的數字標識，例如pH、溫度、時間、濃度和分子量，包括範圍，都是近似值，其以 0. 1的增量變動(+)或(_)。要了解，雖然不總是明確的敘述所有的數字標識之前都加上術 語「約」。也要了解，雖然不總是明確的敘述，本文中描述的試劑僅僅是示例，其等價物是本 領域已知的。本文所述的「誘導的多能性幹細胞(iPS細胞)」是這樣的細胞，其在ES細胞培養條件下，與ES細胞在細胞形態、生長特性、表面標誌物表達、移植到皮下可形成包含3個胚 層組織細胞結構的畸胎瘤等方面與人ES細胞非常相似，而且在DNA甲基化方式、基因表達 譜、染色質狀態等方面也與人ES細胞幾乎完全相似。本文所述的胎盤組織來源的三種間充質細胞來源於人，通過產婦分娩後廢棄物中 分離得到。而羊水細胞則是通過對懷孕18-22周的孕婦進行羊水穿刺獲取。本文所述的術語「誘導重編程」是指將體細胞去分化為多能性幹細胞的過程。優 選地，通過將維持幹細胞多能性所需的多能性因子cDNA導入體細胞可以誘導體細胞去分 化成為多能性幹細胞(Takahashi K和Yamanaka S等人，利用特定因子誘導成人成纖維細 胞到多能幹細胞.細胞2007 ；131 861-872 ；俞君英等人，從人的體細胞誘導成為多能幹細 胞系·科學· 2007 ；318 1917-1920)。其中，優選地，所述的多能性因子包括0ct4、Sox2、 C-myc,以及Klf4。具體地，所述多能性因子為Sox2, NCBI登錄號為NM_003106. 2 ；0ct4, NCBI 登錄號為 NM_002701. 4 ；Klf4, NCBI 登錄號為 NM_004235. 4 ；c-Myc, NCBI 登錄號為 NM_002467. 3。將所述多能性因子cDNA導入體細胞的方法可以是本領域技術人員熟知的多種技 術，包括病毒感染、脂質體轉染、電穿孔、粒子轟擊等各種將DNA轉入細胞的方法。優選地， 使用包含cDNA的病毒載體進行轉染，所述病毒載體包括慢病毒載體、逆轉錄病毒載體等多 種病毒載體。優選地逆轉錄病毒載體(例如PMX載體)，如實施例中所述的。本文所述的「適宜被導入多能性幹細胞因子cDNA的胎盤來源的三種細胞和羊水 細胞的生長條件」是本領域的常規幹細胞培養條件，並且包括一些適宜各個具體細胞系，但 是不影響細胞基本性質的修飾，培養方法以及培養條件參見W. French Anderson等人，幹細 胞手冊，卷2。本文所述的抗氧化劑及工作濃度優選為維生素C 50ug/ml ；還原型穀胱甘肽 IOuM ；亞硒酸鈉20nM。本發明用人胎盤組織來源的三種間充質細胞和羊水細胞生成誘導的多能性幹細 胞的方案優選實施例的過程如下，圖1為胎盤來源的三種細胞及其誘導得到的hES樣克隆 形態；圖2為為胎盤來源的三種細胞誘導獲得的iPS細胞AP染色結果及誘導iPS細胞效率 計算；圖3為通過Real-Time的方法檢測胎盤來源的iPS hES標誌物表達水平鑑定及外源 因子表達水平。2.實施例為使本發明更加容易理解，下面將進一步闡述本發明的具體實施例。下列實施例舉例了發明人的標準實驗室實踐，用於示例本發明的模式，而不應將 本發明理解為限定於這些實施例的範圍。這些實施例，根據本文公開和本領域技術人員的 普遍水平，技術人員將理解下列僅用於示例，可以在不超過本發明的範圍內進行各種變動、 修飾和改造。其中所涉及的技術，除非特別說明，均是本領域技術人員熟知的分子生物學、 細胞生物學、生物化學等各個領域的常規技術。實施例1.細胞的製備和培養對於羊水細胞，通過對進行產檢的孕婦進行羊水穿刺獲取一定量的羊水。將其離 心後獲得沉澱物重懸於羊水培養基進行培養3-4天後，換新鮮羊水培養基繼續培養。
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對於胎盤來源的三種細胞，在無菌條件下取正常足月剖腹產廢棄物中分離得到的 胎盤組織和臍帶，IXPBS洗滌若干次，用鑷子將羊膜和絨毛膜剝離開並分開放置於PBS中， 然後用外科手術剪將羊膜和絨毛膜分別剪成約Imm3的小組織塊。(1)為了得到羊膜間充 質細胞，在羊膜碎片中加入胰酶37°C消化30-45分鐘，共3次，然後加入終濃度1. 2U/ml Dispase，37°C消化60分鐘，在體視鏡下用鑷子將羊膜上皮層和羊膜間充質層分開。取羊膜 間充質層，加入終濃度為2mg/ml的I型膠原酶，37°C消化30-45分鐘，收集細胞平鋪於60mm 或IOOmm培養皿中[用0. 的明膠(Gelatin)預包被處理]，用含10%胎牛血清(FBS， HyClone公司)、成纖維生長因子(8ng/ml)、青黴素(100U/ml)和鏈黴素(100yg/ml)的高 葡萄糖 DMEM (Dulbcco' s Modifed Eagle Medium)混合 F12 培養基(HyClone 公司)進行 培養和純化，所得到的細胞即羊膜間充質細胞。(2)為了得到絨毛膜間充質細胞，在絨毛膜 碎片中加入終濃度為2. 4U/ml的Dispase，37°C消化10-15分鐘，然後加入終濃度為2mg/ml 的I型膠原酶，37°C消化30分鐘，再加入胰酶，37°C消化15分鐘，通過40微米的細胞濾膜 收集細胞，用上述培養羊膜間充質細胞的培養基進行培養和純化，所獲得的細胞即絨毛膜 間充質細胞。(3)為了得到臍帶間充質細胞，先將2釐米長的臍帶在幹的培養皿裡剪成盡可 能小的碎末，加入終濃度為2mg/ml的I型膠原酶，37°C消化4小時，再加入終濃度為lmg/ml 的I型DNA聚合酶，37°C消化10-20分鐘，再加入胰酶，37°C消化10-15分鐘，通過40微米 的細胞濾膜收集細胞，用上述培養基進行培養和純化，所獲得的細胞即臍帶間充質細胞。在多能幹細胞誘導過程中使用DFBS培養基、DFBS+A培養基、或者DFBS+A+VPA培 養基。所述的DFBS+A培養基包含高葡萄糖DMEM培養基(4. 5g/L的葡萄糖，HyClone公 司)，20%特級胎牛血清(FBS Defined, Gibco),4ng/ml鹼性成纖維細胞生長因子(WGF， Invitrogen)、青黴素/鏈黴素、L-穀氨醯胺(Gibco)、0. ImM β -巰基乙醇(Sigma)和 1 %非必需胺基酸(Gibco)；所述的DFBS+A培養基為在DFBS基礎上添加如下組分，50ug/ml 維生素C，IOuM還原型穀胱甘肽，20nM亞硒酸鈉。將人胚胎幹細胞(hES)和用於擴增的誘導的多能幹細胞(induced pluripotentstem cells，iPS細胞)培養在用絲裂黴素(10 μ g/ml)處理的MEF(小鼠胚胎 成纖維細胞)上，並且培養在KSR培養基中DMEM F12(Gibco公司)，20%血清替代物(KSR， Gibco公司)，8ng/ml鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF，Invitrogen)、青黴素/鏈黴素、
L-穀氨醯胺(Gibco),0. ImM β-巰基乙醇(Sigma)和非必需胺基酸(Gibco) 0在純化RNA或DNA之前，去除滋養層細胞，在Matrigel上傳2代，此過程用 mTeSR l (StemCell 公司)培養。實施例2.病毒載體感染胎盤組織來源的三種細胞和羊水細胞根據實施例1所述的方法，在p6孔培養板中分別按每孔約4X IO4個細胞接種人 的胎盤來源的三種細胞，對於羊水細胞則按每孔約8X104個細胞接種，在37°C、5% CO2的 常規培養條件下培養過夜(如圖1)，用收集的病毒上清液分別感染培養的胎盤來源的三種 細胞和羊水細胞。所述病毒上清液是通過用包含人0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc的cDNA的 反轉錄病毒PMX載體(Addgene公司)按常規方法轉染293T細胞(Lipofectamine 2000， Invitrogen公司)獲得的(參見Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆實驗指南，第3 版(2002))。
實施例3.感染細胞的繼續培養和克隆篩選在感染後第2天，將感染後的胎盤來源的三種細胞和羊水細胞的培養基，替換為 實施例1中所述的DFBS培養基，在37°C、5% CO2的常規培養條件下培養4天，每天更換一 次培養基，用0. 25%胰蛋白酶-EDTA (Gibco)於37°C消化為單細胞懸液，將消化後的細胞按 每培養皿約10000個細胞的密度接種到IOOmm培養皿中，所述培養皿按實施例1中描述的 方法，預先用滋養層細胞包被。接種後的細胞在37°C、5% CO2的常規培養條件下培養15-30 天之間，顯微鏡檢可見ES樣克隆(如圖2所示為絨毛膜間充質細胞在感染SKOM後28天在 滋養層上形成典型的hES樣克隆形態)。hES樣克隆挑取至新的滋養層上傳代擴增仍保持 很好的hES樣形態，如圖1為傳代3-4代後的形態，使用KSR培養基(AMCs，羊膜間充質細 胞；CMCs，絨毛膜間充質細胞；UBCs，臍帶間充質細胞；Amniocytes，羊水細胞)。使用玻璃針分割邊緣光滑，細胞核清晰，人胚胎幹細胞樣的單個克隆(見圖1)，然 後用玻璃管吸取這些分割開的克隆接種到12孔板的單個孔中，每個孔接種一個ES樣克隆， 一共挑取12個。所述12孔板按實施例1中描述的方法，預先用滋養層細胞包被。接種後 的細胞在KSR培養基中，37°C、5% CO2的常規培養條件下培養。這些挑取出的克隆具有典型的hES緻密形態，在12孔板培養一周後，每孔選擇部 分克隆進行AP染色，結果為100% AP染色陽性(圖2，以絨毛膜間充質細胞為例，未顯示所 有細胞類型的克隆)。其中，A，B圖是絨毛膜間充質細胞感染SKOM 28天後分別在DFBS+A 和DFBS+A+VPA培養基形成hES樣克隆(100mm培養皿)，AP染色陽性。A，，B，為光鏡下的 hES樣克隆形態；A」，B」為A』，B』中所示同一克隆AP染色陽性圖。計數IOOmm培養皿絨毛 膜間充質細胞形成的AP陽性克隆數目在DFBS+A和DFBS+A+VPA培養基分別為50個和230 個，根據第6天時向IOOmm培養皿共種下10000個SKOM感染的絨毛膜間充質細胞，計算誘 導iPS細胞效率分別為50/10000 = 0. 5%和230/10000 = 2. 3%0因此，與傳統用成纖維細 胞KSR培養基培養的0. 01 0. 02%的效率相比超過100倍，與角質細胞得到的效率相近。 C和D分別為羊膜間充質細胞和臍帶間充質細胞感染SKOM 34天後的AP染色形態。在所述 的各種細胞類型的iPS克隆候選中，我們各選擇了 2-4個克隆候選進行進一步分析鑑定。實施例4實時定量Real-Time PCR鑑定iPS中hES標誌物的表達使用Trizol (Takara公司)試劑，按照製造商說明提取總RNA。用M-MLV (Takara 公司)試劑盒進行逆轉錄，並使用SYBR Premix Ex Taq 試劑盒(Takara公司)，ABI 7300螢光定量PCR儀(ABI公司)進行Real-Time PCR0所有上述PCR條件均使用常規PCR 條件，按照製造商說明進行。其中鑑定hES各標誌物使用引物列表如表1所示，表1為鑑定 hES標誌物表達Real-Time PCR所用引物。表權利要求
四種可用來誘導產生誘導多能幹細胞(iPS)的細胞類型，其特徵在於細胞來源於胎盤組織和羊水細胞。目前多數的臨床治療都需要考慮移植後的免疫排斥問題，因此多數研究致力於尋求自體移植的方法，而上述四種細胞根據其細胞特性，具有廣泛臨床異體移植應用的前景，所述來源胎盤組織的細胞為羊膜間充質細胞、絨毛膜間充質細胞和臍帶間充質細胞。
2.一種誘導產生誘導多能幹細胞的誘導重編程方法，其特徵在於，包括如下步驟(a)將包含多能性幹細胞因子的cDNA分別導入羊水細胞或胎盤組織來源的三種間充 質細胞中的任一種；(b)在適宜步驟(a)中所述的羊水細胞或胎盤來源的間充質細胞生長的培養基上進行培養。
3.如權利要求2所述的誘導重編程方法，其特徵在於，還包括如下步驟(c)初步鑑定多能性幹細胞克隆。
4.如權利要求2所述的誘導重編程方法，其特徵在於，所述步驟(a)中的cDNA通過病 毒載體分別導入所述四種細胞。
5.如權利要求4所述的誘導重編程方法，其特徵在於，所述病毒載體為逆轉錄病毒載體。
6.如權利要求5所述的誘導重編程方法，其特徵在於，所述逆轉錄病毒載體為pMX。
7 如權利要求2所述的誘導重編程方法，其特徵在於，所述步驟(a)中的多能性幹細胞 因子包括Sox2、0ct4和Klf40
8.如權利要求2所述的誘導重編程方法，其特徵在於，所述步驟(a)中的多能性幹細胞 因子為 Sox2、0ct4、Klf4 和 C-myc。
9.如權利要求2所述的誘導重編程方法，其使用的相關培養基如下，(a)對於羊膜間充質細胞，所述培養基為KSR；(b)對於絨毛膜間充質細胞，所述培養基為DFBS+A，或DFBS+A+VPA，或KSR+VPA；(c)對於臍帶間充質細胞，所述培養基為KSR；(d)對於羊水細胞，所述培養基為DFBS+A+VPA。
10.如權利要求9所述的誘導重編程方法使用的培養基，其特徵在於，所述培養基中含 有抗氧化劑(A)是(a)包含四種成分維生素B1、維生素C、還原型穀胱甘肽和亞硒酸鈉；(b)包含(a)中的前三種成分；(c)僅含有維生素C。
全文摘要
本發明公開了四種具有廣泛異體移植應用前景並能有效被誘導成誘導多能幹細胞(iPS)的細胞類型，其中三種細胞類型為均為胎盤組織來源的細胞，分別是羊膜間充質細胞、絨毛膜間充質細胞和臍帶間充質細胞；另外一種是羊水細胞。此外，還公開了高效誘導產生誘導多能幹細胞(iPS)的細胞類型的誘導重編程方法，包括如下步驟將包含多能性幹細胞因子的cDNA分別導入上述四種原代培養的細胞；在適宜培養基上分別進行被cDNA導入的四種原代細胞的培養，在獲得初步的iPS後在適宜的培養基上優化iPS的質量，還可初步鑑定多能性幹細胞克隆。本發明中，三種胎盤來源的間充質細胞及羊水細胞均可誘導形成iPS，其中絨毛膜間充質細胞與成纖維細胞相比，誘導重編程的效率提高超過100倍，效率約為2.3％左右，略高於角質細胞；為建立疾病模型，進行藥物篩選，控制定向分化提供了更加有效且更加具有針對性的手段。
文檔編號C12N5/10GK101984050SQ200910042329
公開日2011年3月9日 申請日期2009年9月1日 優先權日2009年9月1日
發明者李雯, 秦大江, 米蓋爾·埃斯特班, 蔡景蕾, 裴端卿 申請人:中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院