一種用於培養胰腺幹細胞的試劑盒的製作方法
2023-06-17 01:29:26 1
本發明屬於生物設備技術領域，尤其涉及一種用於培養胰腺幹細胞的試劑盒。
背景技術：
近年來，糖尿病患病率在全球呈現快速增長的趨勢，我國人口患病率已達3％，該病給患者和社會帶來了巨大負擔。胰島和幹細胞的深入研究，為糖尿病治療提出新的材料來源。
胰腺幹細胞是幹細胞的一個研究分支，幹細胞是一類具有自我複製和多向分化能力的細胞，它們可以不斷地自我更新，並在特定條件下轉變成為一種或多種構成人體組織或器官的細胞。幹細胞是機體的起源細胞，是形成人體各種組織器官的始祖細胞。
胰腺組織存在一類具有多向分化潛力的細胞，即胰腺幹細胞。胰腺幹細胞具有較高的分化潛能。為滿足科學研究的需求，大量培養胰腺幹細胞成為主要的研究課題，目前專門用於培養胰腺幹細胞的試劑盒較少，而試驗人員進行分離培養胰腺幹細胞的方式，培養用的各種試劑不盡相同，造成了培養的胰腺幹細胞數量和質量無法達到試驗的要求，並且現有技術有公開一些培養其他幹細胞的試劑盒，例如CN104928238A公開的試劑盒，又如CN106047702公開的用於培養幹細胞的試劑盒，以上試劑盒在培養胰腺幹細胞時，其存在安全性、穩定性不高，細胞存活率和增殖率低等問題，為此，人們急需一種專門用於穩定的大量擴增培養胰腺幹細胞的試劑盒。
技術實現要素：
為了解決上述技術問題，本發明提供一種用於培養胰腺幹細胞的試劑盒，由該試劑盒培養的胰腺幹細胞具有穩定性、活性高、增殖倍數顯著提高等優點。
本發明具體技術方案如下：
本發明提供一種用於培養胰腺幹細胞的試劑盒，該試劑盒包括保存液、培養液、培養液添加劑，所述保存液為含有5-10μg/mL雙抗的L-DMEM培養基水溶液，所述雙抗為重量份數比為1:1的青黴素和鏈黴素的混合物，所述培養液為L-DMEM培養基水溶液。
進一步的改進，試劑盒還包括生長因子a、生長因子b、第一組織分解液、第二組織分解液、細胞消化液、洗滌液和凍存液，所述第一組織分解液為含1-3mg/mL膠原酶IV型的PBS緩衝液或基礎培養基，所述第二組織分解液為含1-3mg/mL膠原酶V型的PBS緩衝液或基礎培養基，所述細胞消化液為含0.25-0.5mg/mL胰酶和0.02-0.05mg/mL乙二胺四乙酸的PBS緩衝液，所述洗滌液為PBS緩衝液。
本發明的培養液、培養液添加劑、生長因子a、生長因子b組成的溶液成為全培養液，配置方法為：將生長因子a、生長因子b和培養基添加劑溶於培養液中配置成全培養液，其中，生長因子a、生長因子b和培養基添加劑的濃度分別為10ng/mL、10ng/mL和50mg/mL。
本發明所指的L-DMEM培養基水溶液中L-DMEM培養基的濃度為10-20mg/mL。
本發明進一步為培養胰腺幹細胞提供一種試劑盒，該試劑盒能夠培養大量的胰腺幹細胞，並且培養過程中能夠保持胰腺幹細胞的存活率和活性。
進一步的改進，所述凍存液主要由35-45％的L-DMEM培養基水溶液，40-60％的人血白蛋白水溶液和5-15％的DMSO組成。
進一步的改進，所述保存液中還含有15-30μg/mL的原花青素和10-15μg/mL的維生素C。
在保存液中加入原花青素和維生素C可以逆轉分離的胰腺幹細胞對青黴素和鏈黴素的耐藥性，進而提高整個保存液的抗菌性能，保證胰腺幹細胞的活性。
進一步的改進，所述保存液中還含有1-3μg/mL的羥乙基-β-環糊精和5-10μg/mL的氯化鈉。
在保存液中加入乙基-β-環糊精和氯化鈉的混合物，可以有效提高保存液的穩定性，避免保存液產生沉澱、分層和變色等問題。
進一步的改進，所述培養液添加劑包括如下重量份數的成分：木犀草素1-3份、小檗鹼0.5-1份和枸櫞酸鈉5-10份。
在培養基添加劑中添加木犀草素、小檗鹼和枸櫞酸鈉可以有效提高配置培養液的防止細菌、真菌和病毒感染的能力。
進一步的改進，所述培養液添加劑還包括重量份數如下的成分：β-胡蘿蔔素0.5-1份、氯化硒2-5份、白藜蘆醇1-3份、聚甲基丙烯酸甲酯2-3份、麥芽糖醇1.3-2.5份和的穀氨醯胺2-3份。
在培養液添加劑中加入以上成分，可以提高培養液培養胰腺幹細胞的增殖效率和擴增倍數。
進一步的改進，所述凍存液內含5-10μg/mL的聚丙烯葡聚糖、1-3μg/mL的月桂醯肌氨酸和0.2-0.5μg/mL的果膠。
在凍存液中加入上述成分可以使凍存性能更好好，胰腺幹細胞復甦後存活率高，而且更利於胰腺幹細胞凍存前後細胞形態的維持和穩定
進一步的改進，所述第一組織分解液和第二組織分解液內均含有1-3mg/mL透明質酸酶和0.3-0.5mg/mL透明質酸。
在第一組織分解液和第二組織分解液內加入透明質酸酶和透明質酸可顯著縮短組織分解時間，提高分解效率，可以分解時間降低到8min以內。
進一步的改進，所述生長因子a為鹼性成纖維細胞生長因子，所述生長因子b為表皮細胞生長因子。
通過對試劑盒結構的改變，使得該試劑盒結構簡單，操作方便。
本發明另一方面還提供一種培養胰腺幹細胞的方法，包括如下步驟：
(1)將離體的胰腺，放入盛裝有保存液的試劑瓶，4℃保存；
(2)將生長因子a、生長因子b和培養基添加劑溶於培養液中配置成全培養液，其中，生長因子a、生長因子b和培養基添加劑的濃度分別為10ng/mL、10ng/mL和50mg/mL，配好的全培養液放置在4℃的冰箱中保存；
(3)用75％的酒精清洗胰腺3遍，加入3倍含10％雙抗的洗滌液清洗3遍；
(4)用眼科鑷子分離出胰腺組織；
(5)用洗滌液反覆清洗；
(6)將所述胰腺組織用眼科剪剪成1-2mm3大小的胰腺碎塊；
(7)將步驟(6)獲得的所述胰腺碎塊加入所述第一組織分解液和第二組織分解液中，水浴震蕩，每3-5min震蕩一次，持續20min，再加入步驟(2)配置的所述全培養液終止分解，過篩，離心；
(8)棄掉上層清液，得胰腺幹細胞單細胞懸液，記為P0代胰腺幹細胞，用步驟(2)配置的所述全培養液將P0代胰腺幹細胞重懸，再按照1-2×106個/ml的密度接種在培養瓶中，將培養瓶放入37℃、5％CO2的CO2培養箱中，培養，每個三天換全培養液一次；
(9)將步驟(8)所得每三天更換全培養基一次，通過顯微鏡觀察到胰腺幹細胞生長面積達到80％左右時，先用所述洗滌液清洗2次，然後加入所述細胞消化液，適當震蕩搖晃培養瓶，使所述細胞消化液與細胞充分接觸，再放入培養箱中消化30-60s，最後加入步驟(2)配置的所述全培養基終止消化，所得胰腺幹細胞記為P1代胰腺幹細胞，取出一部分P1代胰腺幹細胞放入所述凍存液中進行凍存，凍存密度為3-5×106個/ml凍存液，剩餘P1代胰腺幹細胞按照1：3比例進行傳代；
(10)重複步驟(9)，將胰腺幹細胞進行多次的培養和傳代。
本發明提供的試劑盒為提供胰腺幹細胞分離培養，擴增，傳代，凍存一體的試劑盒，該試劑盒可在維持多能性和表面性同時減少的批量差異，並且節約時間和精力，可以更快得獲得大量的胰腺幹細胞，解決了胰腺幹細胞分離數量少且純度低、培養存活率低、培養效率不高、凍存復活率不理想等問題，使胰腺幹細胞在理想營養平衡狀態下進行多代擴增培養，為利用胰腺幹細胞進行進一步實驗研究提供了豐富的來源。
具體實施方式
實施例1
一種用於培養胰腺幹細胞的試劑盒，該試劑盒包括保存液、培養液、培養液添加劑，所述保存液為含有5μg/mL雙抗的L-DMEM培養基水溶液，所述雙抗為重量份數比為1:1的青黴素和鏈黴素的混合物，所述培養液為L-DMEM培養基水溶液。
實施例2
一種用於培養胰腺幹細胞的試劑盒，該試劑盒包括保存液、培養液、培養液添加劑、生長因子a、生長因子b、第一組織分解液、第二組織分解液、細胞消化液、洗滌液和凍存液，所述保存液為含有5μg/mL雙抗的L-DMEM培養基水溶液，所述雙抗為重量份數比為1:1的青黴素和鏈黴素的混合物，所述培養液為L-DMEM培養基水溶液；所述生長因子a為鹼性成纖維細胞生長因子，所述生長因子b為表皮細胞生長因子，所述第一組織分解液為含1mg/mL膠原酶IV型的PBS緩衝液或基礎培養基，所述第二組織分解液為含1mg/mL膠原酶V型的PBS緩衝液或基礎培養基，所述細胞消化液為含0.25mg/mL胰酶和0.02mg/mL乙二胺四乙酸的PBS緩衝液，所述洗滌液為PBS緩衝液，所述凍存液由40％的L-DMEM培養基水溶液、50％的人血白蛋白水溶液和10％的DMSO組成。
實施例3
一種用於培養胰腺幹細胞的試劑盒，該試劑盒包括保存液、培養液、培養液添加劑、生長因子a、生長因子b、第一組織分解液、第二組織分解液、細胞消化液、洗滌液和凍存液，所述保存液為含有10μg/mL雙抗的L-DMEM培養基水溶液，所述雙抗為重量份數比為1:1的青黴素和鏈黴素的混合物，所述培養液為L-DMEM培養基水溶液；所述生長因子a為鹼性成纖維細胞生長因子，所述生長因子b為表皮細胞生長因子，所述第一組織分解液為含3mg/mL膠原酶IV型的PBS緩衝液或基礎培養基，所述第二組織分解液為含3mg/mL膠原酶V型的PBS緩衝液或基礎培養基，所述細胞消化液為含0.5mg/mL胰酶和0.05mg/mL乙二胺四乙酸的PBS緩衝液，所述洗滌液為PBS緩衝液，所述凍存液由40％的L-DMEM培養基水溶液、50％的人血白蛋白水溶液和10％的DMS O組成。
實施例4
一種用於培養胰腺幹細胞的試劑盒，與實施例1不同的是：所述保存液中還含有30μg/mL的原花青素和15μg/mL的維生素C。
實施例5
一種用於培養胰腺幹細胞的試劑盒，與實施例2不同的是：所述保存液中還含有15μg/mL的原花青素和10μg/mL的維生素C。
實施例6
一種用於培養胰腺幹細胞的試劑盒，與實施例4不同的是：所述保存液中還含有3μg/mL的羥乙基-β-環糊精和10μg/mL的氯化鈉。
實施例7
一種用於培養胰腺幹細胞的試劑盒，與實施例5不同的是：所述保存液中還含有1μg/mL的羥乙基-β-環糊精和5μg/mL的氯化鈉。
實施例8
一種用於培養胰腺幹細胞的試劑盒，與實施例1不同的是：所述培養液添加劑包括如下重量份數的成分：木犀草素1份、小檗鹼0.5份和枸櫞酸鈉5份。
實施例9
一種用於培養胰腺幹細胞的試劑盒，與實施例4不同的是：所述培養液添加劑包括如下重量份數的成分：木犀草素3份、小檗鹼1份和枸櫞酸鈉10份。
實施例10
一種用於培養胰腺幹細胞的試劑盒，與實施例8不同的是：所述培養液添加劑還包括重量份數如下的成分：0.5份的β-胡蘿蔔素、2份的氯化硒、1份的白藜蘆醇、2份的聚甲基丙烯酸甲酯、1.3份的麥芽糖醇和2份的穀氨醯胺。
實施例11
一種用於培養胰腺幹細胞的試劑盒，與實施例9不同的是：所述培養液添加劑還包括重量份數如下的成分：1份的β-胡蘿蔔素、5份的氯化硒、3份的白藜蘆醇、3份的聚甲基丙烯酸甲酯、2.5份的麥芽糖醇和3份的穀氨醯胺。
實施例12
一種用於培養胰腺幹細胞的試劑盒，與實施例2不同的是：所述凍存液內含5μg/mL的聚丙烯葡聚糖、1μg/mL的月桂醯肌氨酸和0.2μg/mL的果膠。
實施例13
一種用於培養胰腺幹細胞的試劑盒，與實施例2不同的是：所述凍存液內含10μg/mL的聚丙烯葡聚糖、3μg/mL的月桂醯肌氨酸和0.5μg/mL的果膠。
實施例14
一種用於培養胰腺幹細胞的試劑盒，與實施例2不同的是：所述第一組織分解液和第二組織分解液內均含有1mg/mL透明質酸酶和0.5mg/mL透明質酸。
實施例15
一種用於培養胰腺幹細胞的試劑盒，該試劑盒包括保存液、培養液、培養液添加劑、生長因子a、生長因子b、第一組織分解液、第二組織分解液、細胞消化液、洗滌液和凍存液，所述保存液為含有7.5μg/mL雙抗、20μg/mL原花青素、12μg/mL維生素C、2μg/mL羥乙基-β-環糊精和7.5μg/mL氯化鈉的L-DMEM培養基水溶液，所述雙抗為重量份數比為1:1的青黴素和鏈黴素的混合物，所述培養液為L-DMEM培養基水溶液；所述培養液添加劑包括如下重量份數的成分：木犀草素2份、小檗鹼0.75份、枸櫞酸鈉6份、β-胡蘿蔔素0.8份、氯化硒3份、白藜蘆醇2份、聚甲基丙烯酸甲酯2.5份、麥芽糖醇2份和穀氨醯胺2.5份；所述生長因子a為鹼性成纖維細胞生長因子，所述生長因子b為表皮細胞生長因子，所述第一組織分解液為含2mg/mL膠原酶IV型、2mg/mL透明質酸酶和0.4mg/mL透明質酸的PBS緩衝液，所述第二組織分解液為含2mg/mL膠原酶V型、2mg/mL透明質酸酶和0.4mg/mL透明質酸的PBS緩衝液，所述細胞消化液為含0.25mg/mL胰酶和0.02mg/mL乙二胺四乙酸的PBS緩衝液，所述洗滌液為PBS緩衝液，所述凍存液由含7μg/mL聚丙烯葡聚糖、2μg/mL月桂醯肌氨酸和0.4μg/mL果膠且40％的L-DMEM培養基水溶液、50％的人血白蛋白水溶液和10％的DMSO組成。
對照例1
一種用於培養胰腺幹細胞的試劑盒，與實施例2不同的是：所述保存液中還含有30μg/mL的原花青素。
對照例2
一種用於培養胰腺幹細胞的試劑盒，與實施例2不同的是：所述保存液中還含有30μg/mL的原花青素和15μg/mL的維生素E。
對照例3
一種用於培養胰腺幹細胞的試劑盒，與實施例4不同的是：所述保存液中還含有3μg/mL的羥乙基-β-環糊精和10μg/mL的抗壞血酸鈉。
對照例4
一種用於培養胰腺幹細胞的試劑盒，與實施例1不同的是：所述培養液添加劑包括如下重量份數的成分：小檗鹼0.5份和枸櫞酸鈉5份。
對照例5
一種用於培養胰腺幹細胞的試劑盒，與實施例1不同的是：所述培養液添加劑包括如下重量份數的成分：青黴素1份、小檗鹼0.5份和枸櫞酸鈉5份。
對照例6
一種用於培養胰腺幹細胞的試劑盒，與實施例8不同的是：所述培養液添加劑還包括重量份數如下的成分：2份的氯化硒、1份的白藜蘆醇、1.3份的麥芽糖醇和2份的穀氨醯胺。
對照例7
一種用於培養胰腺幹細胞的試劑盒，與實施例8不同的是：所述培養液添加劑還包括重量份數如下的成分：0.5份的β-胡蘿蔔素、2份的氯化鉀、1份的甘露醇、2份的聚甲基丙烯酸甲酯、1.3份的葡萄糖和2份的穀氨醯胺。
對照例8
一種用於培養胰腺幹細胞的試劑盒，與實施例2不同的是：所述凍存液內含5μg/mL的聚丙烯葡聚糖和0.2μg/mL的果膠。
對照例9
一種用於培養胰腺幹細胞的試劑盒，與實施例2不同的是：所述凍存液內含5μg/mL的聚丙烯酸樹脂、1μg/mL的月桂醯肌氨酸和0.2μg/mL的果膠。
試劑盒中保存液抗菌性能評價
取實施例1、實施例4、實施例15、對照例1-2的試劑盒中的保存液，均在溫度40℃±2℃下，相對溼度為75％±5％的條件下放置24個月，在試驗期間1個月、3個月、6個月、12個月、24個月分別取樣一次，檢測保存液中細菌、真菌和病毒的感染情況，檢驗結果見表1。
表1保存液抗菌性能評價結果
其中：「-」表示「沒有」，「√」表示「有」。
比較實施例4、實施例15、對照例1-2的試劑盒中的保存液內的細菌、真菌和病毒的感染狀況可知，在保存液中添加原花青素和維生素C可以有效提高保存液防止細菌、真菌和病毒感染的能力，減少其中一個成分，或變化其中一個成分，不但不會提高抗菌效果，還會導致保存液抗細菌、真菌和病毒感染的能力減弱。
試劑盒中保存液對胰腺幹細胞存活率評價
將相同數量的胰腺幹細胞分別放入實施例1、實施例4、對照例1、對照例2的試劑盒和CN 106047702的試劑盒的保存液中，在4℃下保存240小時，期間分別於第12h、24h、48h、96h、240h時觀察胰腺幹細胞形態，並用臺盼蘭染色計數胰腺幹細胞存活率，試驗結果見表2。
表2保存液對胰腺幹細胞存活率的評價結果
其中：A表示細胞分散度好、大小均勻、形態不變、輪廓清晰；
B表示細胞體積變大、大小不等、輪廓模糊、出現橢圓或不規則等異常形態。
上述試驗結果表明，採用本發明提供的保存液保存胰腺幹細胞的效果與對比試驗1-2的保存液和CN106047702的胰腺保存液相比，其保存的胰腺幹細胞存活率明顯較高，且胰腺幹細胞的形態也保持得更好，由此可知本發明提供的的保存液可以有效保持胰腺幹細胞活性、提高胰腺幹細胞存活率。
試劑盒中保存液穩定性評價
取實施例1、實施例6、實施例15、對照例3的試劑盒，均在溫度40℃±2℃下，相對溼度為75％±5％的條件下放置24個月，在試驗期間1個月、3個月、6個月、12個月和24個月末分別取樣一次，檢測保存有胰腺幹細胞的保存液的性狀和色澤，試驗結果見表3。
表3保存液穩定性評價結果
其中：「-」表示沒有，「√」表示有。
比較實施例6與實施例15和對照例3的試劑盒內的保存液的穩定性狀況可知，在保存液中添加羥乙基-β-環糊精和氯化鈉可以有效提高保存液的穩定性，避免保存液產生沉澱、分層和變色等問題，減少其中一個成分，或變化其中一個成分，不但不會提高穩定性，還會使保存液的穩定性減弱。
試劑盒中全培養液抗菌性能的評價
取實施例8、對照例4和對照例5的試劑盒，分別將其中的培養液、培養基添加劑、生長因子a和生長因子b配置成全培養液，將上述全培養液均在溫度-4℃±2℃下，相對溼度為60％±5％的條件下放置24個月後，檢測全培養液中細菌數量，檢測結果見表4。
表4保存液抗菌性能評價結果
由上述試驗結果可知，在培養基添加劑中增加木犀草素、小檗鹼和枸櫞酸鈉可以有效提高全培養基防止細菌的能力，減少其中一個成分，或變化其中一個成分，都會導致配置的全培養夜抗細菌能力減弱。
試劑盒對胰腺幹細胞增殖能力的評價
取實施例8、實施例10、對照例6、對照例7和CN106047702的試劑盒，培養胰腺幹細胞，採用臺盼藍經典染色法對細胞進行計數，分別統計原代、第3代、第6代和第9代活胰腺幹細胞的數量，結果見表5。
表5胰腺幹細胞體外培養擴增效果評價
由上述結果可以得出，採用本發明提供的培養基添加劑配置的全培養液培養胰腺幹細胞的增殖速度明顯高於CN106047702的細胞培養液，也優於採用對照例6和對照例7的培養基添加劑配置的全培養液。
試劑盒對胰腺幹細胞凍存性能的評價
收集實施例10培養得到的P3代胰腺幹細胞，將細胞重懸混勻後，進行細胞計數，將所需的細胞懸液分裝至離心管中離心去除上清液，收集細胞沉澱，分別加入1.5mL實施例2、實施例12、對照例8-9的凍存液和CN106047702的凍存液中，並控制細胞數量為1×106個/mL；迅速將凍存液轉移至已加好異丙醇的細胞程序降溫盒中，放入-80℃超低溫冰箱2～3天後，將凍存液轉移至液氮保存；一個月後進行細胞復甦，將保存於液氮中的凍存液取出，轉移至37℃水浴鍋中迅速解凍，用移液管將細胞轉入之前預溫好的10mL按照本發明公開的方法配置的全培養液中，取0.5mL細胞懸液檢測細胞存活率和細胞形態變化情況，結果見表6。
表6試劑盒對胰腺幹細胞凍存性能的影響
將實施例2、實施例12的試劑盒的凍存性能與對照例8、對照例9和CN104928238A的試劑盒的凍存性能相比，可以得出本發明提供的試劑盒的凍存性能相對更好，胰腺幹細胞復甦後存活率較高，而且更利於胰腺幹細胞凍存前後細胞形態的維持和穩定。
最後應說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和範圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求範圍當中。