改進的dna亞硫酸氫鹽轉化的製作方法

2023-06-16 18:32:01 2

專利名稱：改進的dna亞硫酸氫鹽轉化的製作方法
背景技術：
本發明涉及DNA中胞嘧啶甲基化的檢測方法。5-甲基胞嘧啶是真核細胞DNA中最常見的共價修飾鹼基。例如，它在轉錄調控、遺傳印記和腫瘤發生中起作用(綜述參見Millar等人Five not fourHistory andsignificance of the fifth base.在S.Beck和A.Olek，eds.TheEpigenome.Wiley-VCH Verlag Weinheim 2003，S.3-20)。因此5-甲基胞嘧啶作為遺傳信息組分的鑑定是非常有意義的。但是不能通過測序鑑定5-甲基胞嘧啶的位置，原因是5-甲基胞嘧啶與胞嘧啶有相同的鹼基配對行為。此外，在PCR擴增時，5-甲基胞嘧啶攜帶的後生信息(epigenetic information)完全丟失。
對甲基化分析的通常方法基本上依據兩個不同的原理操作。或者使用甲基化特異的限制酶，或者對未甲基化的胞嘧啶進行選擇性的化學轉化(亞硫酸氫鹽處理)成尿嘧啶。然後對經過酶學或者化學預處理的DNA進行擴增，可以用不同的方法進行分析(綜述參見Fraga和EstellerDNA MethylationA Profile of Methods and Applications.Biotechniques 33632-649，Sept.2002).WO 02/072880 pp.1ff)。
因為甲基化特異的酶的使用只限於含有被所述酶識別的限制位點的某些序列，所以對於大多數應用進行的是亞硫酸氫鹽處理(綜述參見US 10/311,661)。
根據本發明「亞硫酸氫鹽反應」、「亞硫酸氫鹽處理」或者「亞硫酸氫鹽方法」指的是在亞硫酸氫根離子存在的條件下將核酸中的胞嘧啶鹼基轉化為尿嘧啶鹼基的反應，而5-甲基胞嘧啶基本上沒有轉化。亞硫酸氫鹽反應含有脫氨基步驟以及脫磺酸基步驟，這兩步可以分別或者同時進行(在EP1394172A1中描述了進一步的細節並且顯示了反應方案，該文獻的全部在此引用作為參考)。有各種不同的文獻討論了亞硫酸氫鹽反應的特殊方面，包括Hayatsu等人，Biochemistry 9(1970)2858-28659；Slae和Shapiro，J.Org.Chem.43(1978)4197-4200；Paulin等人，Nucl.Acids Res.26(1998)5009-5010；Raizis等人，Anal Biochem.226(1995)，161-1666；Wang等人Nucleic Acids Res.8(1980)4777-4790。這些文獻在EP 1394172A1中給予總結(在此引用其全部作為參考)。
亞硫酸氫鹽處理通常按照以下的方式進行分離基因組DNA，用機械或者酶學方法使其片段化，氫氧化鈉變性，使用濃亞硫酸氫鹽溶液轉化幾個小時，最後脫磺酸基和脫鹽(例如Frommer等人A genomicsequencing protocol that yields a positive display of5-methylcytosine residues in individual DNA strands.Proc NatlAcad Sci USA.1992 Mar 1；89(5)1827-31；在此引用其全部作為參考)。
最近開發出了亞硫酸氫鹽方法的幾種技術改進。瓊脂糖小珠法將研究的DNA加入到瓊脂糖基質中，這樣防止了DNA的擴散和復性(亞硫酸氫鹽只與單鏈的DNA反應)，並且所有的沉澱和純化步驟被快速透析所替代(Olek A.等人A modified and improved method for bisulphitebased cytosine methylation analysis，Nucl.Acids Res.1996，24，5064-5066)。在專利申請WO01/98528(＝DE 100 29 915；＝US申請10/311,661)中，描述了亞硫酸氫鹽轉化，其中在變性劑和/或溶劑以及至少一種清除劑(scavenger)存在下，DNA樣品與濃度範圍在0.1mol/L到6mol/L的亞硫酸氫鹽溶液共同溫育。在所述的專利申請中描述了幾種適宜的變性劑和清除劑(文獻的全部在這裡引用作為參考)。在專利申請WO 03/038121(＝DE 101 54 317；＝10/416,624)中，公開了在亞硫酸氫鹽處理過程中將要被分析的DNA結合到固相表面的方法。因此有助於純化和洗滌步驟的進行。在專利申請EP1394173A1和EP1394172A1(其整體在這裡引用作為參考)中描述了進一步的改進。
但是亞硫酸氫鹽處理中的主要問題是需要長的反應時間，以確保完全轉化並且排除假陽性結果。但是由於長的反應時間，這同時導致DNA的降解。更高的反應溫度的確產生更高轉化率，但是也產生更為強烈的DNA降解。最近對溫度、反應時間、轉化率以及降解之間的相互作用進行了系統的研究。這樣能夠表明最高的轉化率在溫度為55℃(反應時間在4到18小時之間)和95℃(反應時間為1小時)時獲得。但是一個嚴重的問題時在這一過程中DNA的降解。在反應溫度為55℃時，84-96％的DNA被分解。95℃時降解實際上更高(Grunau等人Bisulfitegenomic sequencingsystematic investigation of criticalexperimental parameters.Nucleic Acids Res.2001 Jul 1；29(13)E65-5；其全部在這裡引用作為參考)。因此，大多數作者使用的反應溫度是大約50℃(參見Frommer等人，在上述引文中1992，p.1827；Olek等人，在上述引文中1996，p.5065；RaizisetalA bisulfitemethodof 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation.Anal Biochem.1995 Mar 20；226(1)161-6，162)。
除了高的DNA降解率，在傳統的亞硫酸氫鹽方法中還有另外一個問題，即至今還沒有描述對轉化後DNA的強有力的純化方法。許多作者使用沉澱(參見Grunau等人，在上述引文中)。也已經有通過DNA結合表面進行的純化(參見Kawakami等人Hypermethylated APC DNA inplasma and prognosis of patients with esophageal adenocarcinoma.Journal of the National Cancer Institute，Vol.92，No.22，2000，pp.1805-11)。但是這些純化的產率有限。
由於傳統亞硫酸氫鹽處理中DNA的大量損失，如果研究中需要進行分析的DNA只有有限量，使用這些方法進行研究是有問題的。但是甲基化分析的一個特別有趣的領域是，通過對來自體液例如血液或者尿的DNA進行分析，診斷與甲基化狀態改變相關的癌症疾病或者其他病症。但是DNA只是以很小的濃度存在於體液中，使得甲基化分析的應用受到傳統亞硫酸氫鹽處理的低產量的限制。
因此，基於甲基化分析的特殊重要性以及所描述的傳統方法學的缺點，對亞硫酸氫鹽轉化的改進方法有急切的技術上的需要。
現在發現加入某些變性溶劑，以出人意料的、令人驚奇的方式提高亞硫酸氫鹽反應的轉化率。同時，降低了所需的反應時間因此降解率也降低。儘管在本領域中已經知道使用變性溶劑，但是本領域內的技術人員還是不能預料在本發明中選擇的溶劑能夠產生如此強烈的效果。除了明顯提高的轉化率和降低的降解率以外，使用所述的溶劑產生另一個重要的優點通常亞硫酸氫鹽處理是在高濃度亞硫酸氫鹽的條件下進行的(Fraga和Esteller推薦的最終濃度是5mol/l；參見以上，p.642，左欄，第二段)。但是如此高的鹽濃度導致高的降解，並且使接下來的純化和擴增中產生問題。根據本發明，與已知的變性溶劑相比，使用正烷撐二醇(n-alkylenglycol)作為變性劑的另一個優點是這些溶劑具有更高的水溶性。所以反應化合物包括清除劑可以在更廣的濃度範圍下進行應用。將這些新型溶劑與優化的反應條件和新型純化方法相組合，轉化效率可以進一步提高。對組織或者體液進行敏感的DNA甲基化分析就變得可能了。
發明描述本發明的一個實施方案是DNA的亞硫酸氫鹽轉化方法，其中DNA與亞硫酸氫鹽試劑反應，其特徵在於所述的反應在選自二烷、其衍生物之一以及類似的脂肪族環醚的化合物的存在下進行。
本發明的另一個實施方案是DNA的亞硫酸氫鹽轉化方法，其中DNA與亞硫酸氫鹽試劑反應，其特徵在於所述的反應在具有下式的化合物存在下進行 n＝1-35000m＝1-3R1＝H，Me，Et，Pr，BuR2＝H，Me，Et，Pr，Bu因此優選的是正烷撐二醇化合物，特別是其二烷基醚，特別是二甘醇二甲醚(DME)。
對於兩個實施方案，研究的DNA可以來自不同的來源，這取決於是診斷還是科學研究的目的。對於診斷研究，優選使用組織樣品作為原料，但是體液，特別是血清或者血漿也可以使用。也可以使用來自痰、糞便、尿或者腦脊液的DNA。優選地，DNA從生物樣本中分離。根據標準的方法，例如使用Qiagen UltraSens DNA提取試劑盒從血液中提取DNA。其他純化DNA的方法對本領域內的技術人員是已知的。
接下來可以對分離的DNA進行片段化，例如通過與限制酶進行反應。反應條件和使用的酶對於本領域內的技術人員是已知的，且來自例如生產商提供的實驗方案。
可以根據以上所示的已知的實驗方案進行亞硫酸氫鹽轉化。反應可在溶液中進行，也可以在結合在固相上的DNA上進行。優選地，使用sodium disulfite(＝亞硫酸氫鈉/焦亞硫酸鈉)，原因是它在水中比亞硫酸鈉更易溶。在水溶液中，disulfite鹽與胞嘧啶轉化所需的亞硫酸氫根(hydrogen sulfite)陰離子不成比例。在以下討論亞硫酸氫鹽的濃度時，這指的是在反應溶液中亞硫酸氫根和亞硫酸根陰離子的濃度。對於根據本發明的方法，可能的濃度範圍是0.1-6mol/L(參見上面)。特別優選的是濃度範圍是1-6mol/L，最特別優選的是2-4mol/L。但是，在使用二烷時，能夠使用的亞硫酸氫鹽最大濃度更低(參見以下)。在選擇亞硫酸氫鹽濃度時，必須要考慮高濃度的亞硫酸氫鹽產生高的轉化，但是由於更低的pH，也導致高的分解率。
可以使用不同濃度的二烷。優選地，二烷的濃度從10％到35％(體積/體積)，特別優選的是20-30％，最特別優選的是22-28％，特別是25％。高於35％的二烷濃度是有問題的，因為這會使反應溶液中產生兩相。在使用濃度22-28％的二烷的特別優選的實施方案中，最終的優選亞硫酸氫鹽濃度是3.3-3.6mol/L，在使用濃度25％的二烷的最特別優選的實施方案中，最終的優選亞硫酸氫鹽濃度是3.5mol/L(參見實施例)。
可以在不同濃度範圍內使用根據本發明的正烷撐二醇混合物。優選使用的DME濃度是1-35％(體積/體積)。優選為5-25％，最優選是10％DME。
根據本發明使用的優選清除劑是色烷(chromane)衍生物，例如6-羥基-2，5，7，8-四甲基色烷2-羧酸(也被稱為Trolox-CTM)。在專利申請WO01/98528(＝DE 100 29 915；＝US 申請 10/311,661；其整體在這裡引用作為參考)中列出了其他的清除劑。
可以在0-95℃攝氏度的廣闊溫度範圍內進行亞硫酸氫鹽轉化(參見以上)。但是由於在更高溫度下DNA的轉化和分解率都提高，在優選的實施方案中反應溫度在30-70℃。特別優選的範圍是45-60℃。最特別優選的是50-55℃。亞硫酸氫鹽處理最佳的反應時間取決於反應的溫度。反應時間一般是1到18小時(參見Grunau等人2001，在上述引文中)。對於50℃的反應溫度，反應時間一般是4-6小時。
在根據本發明的方法的特別優選的實施方案中，亞硫酸氫鹽轉化在溫和的反應溫度下進行，其中在反應進行的過程中，反應溫度至少一次明顯地短暫升高。這樣，亞硫酸氫鹽的轉化效率可以被令人驚奇地明顯升高。短暫持續的溫度升高在以下被稱為「熱尖峰(thermospikes)」。在熱類峰以外的標準反應溫度定義為基礎反應溫度。如以上所描述的，基礎反應溫度為0-80℃，優選在30-70℃，最優選在45-55℃。在熱尖峰中，通過至少一次熱尖峰使反應溫度升高到85℃以上。最佳的熱尖峰數目是基礎溫度的函數。最佳熱尖峰數目越多，基礎溫度越低。在每個情況下至少需要一個熱尖峰。另一方面，原則上任何數目的熱尖峰都是可能的。當然必須考慮到溫度多次提高，DNA的分解速率也提高，就不能再保證最佳的轉化。因此優選的熱尖峰數目是每次1到10個熱尖峰，這取決於基礎反應溫度。因此特別優選的熱尖峰數目是2到5個。熱尖峰使反應溫度優選升高到85-100℃，特別優選升高到90-98℃，最優選升高到94-96℃。
熱尖峰的持續時間也取決於反應批次的體積。必須確保溫度在整個反應溶液中均勻升高。在使用熱循環儀時，對於20μl的反應批次，持續時間在15秒到1.5分鐘，特別地優選持續時間為20到50秒。在一個特別優選的實施方案中持續時間是30秒。對100μl的體積進行操作時優選的範圍在30秒到5分鐘之間，特別是在1到3分鐘之間。特別優選是1.5分鐘。對於600μl的體積，優選的持續時間是1到6分鐘，特別是2到4分鐘。特別優選的持續時間是3分鐘。本領域內的技術人員能夠很容易地根據各種不同的反應體積確定適宜的熱尖峰持續時間。
在亞硫酸氫鹽轉化反應中，即使沒有使用以上描述的變性溶劑，以上描述的使用熱尖峰產生了顯著更好的轉化率。根據本發明，DNA的亞硫酸氫鹽轉化方法特徵在於基礎反應溫度在0-80℃，在轉化過程中，反應溫度至少一次短暫升高到85℃以上。可以根據以上的描述處理原料。
優選的溫度範圍、熱尖峰的數目以及它們的持續時間與以上描述的範圍一致。因此基礎反應溫度在0-80℃，優選在30-70℃，最優選在45-55℃。通過至少一次熱尖峰使反應溫度升高到85℃以上。優選的熱尖峰數目是1到10個熱尖峰，這取決於基礎反應溫度。特別優選的熱尖峰數目是2到5個。在熱尖峰中，反應溫度優選升高到85-100℃，特別優選升高到90-98℃，最優選升高到94-96℃。
溫度升高的持續時間也取決於反應批次的體積(參見以上)。
完成亞硫酸氫鹽轉化後，將DNA去磺酸基並純化。已知對於這個目的有不同的方法(例如參見DE 101 54 317 A1＝US 10/416,624；Grunau等人2001，在上述引文中)。一般地，首先使用氫氧化鈉處理反應溶液。接下來進行DNA的中和以及乙醇沉澱。在根據本發明的上述實施方案的優選實施方案中，通過凝膠過濾例如使用Sephadex-G25柱進行純化。這樣可以非常有效地除去亞硫酸氫鹽，不需要進一步的洗滌步驟。在另一個優選的實施方案中，通過DNA結合表面例如通過Promega的Wizard DNA純化樹脂(參見Kawakami等人，在上述引文中)進行純化。第三個優選的實施方案使用磁性顆粒用於純化，例如使用Magna-Pure方法。這些純化方法與根據本發明的正烷撐二醇化合物組合，特別是與DME組合，產生特別好的結果。根據生產商的說明進行純化。本領域內的技術人員還知道通過使用標準的實驗，改變生產商的說明產量可能得到進一步提高。因此，經過優化的實驗方案也是本發明的一部分。通過凝膠過濾、DNA結合表面以及磁性顆粒純化核酸的進一步技術說明是本領域的技術人員已知的，並且在例如生產商的說明中提供。在最特別優選的實施方案中，使用超濾方式進行純化。這一方法具有幾個技術優勢，並且使轉化後的DNA被令人驚奇地成功純化。轉化後的DNA回收率非常高(大於85％，參見實施例6)。這對於高分子量的DNA以及片段化的DNA如體液中發現的DNA都是如此。相反，分離亞硫酸氫鹽處理的DNA的通常方法，其回收率只有大約25％。超濾還有其他優點。例如，就使用的樣品體積而言，純化是非常靈活的。此外，亞硫酸氫鹽可以幾乎完全除去。而且，去磺酸基可以在濾膜上進行，這進一步節約了時間。本領域內技術人員知道不同的商品化的超濾系統，可以在根據本發明的方法中使用它們。在一個優選的實施方案中，使用了Millipore的MicroconTM柱。這樣純化可以根據修改後的生產商的實驗方案進行。為此將亞硫酸氫鹽反應溶液與水混和，加到超濾膜上。接下來離心超濾溶液大約15分鐘，然後使用1×TE緩衝液洗滌。在這一處理中，DNA留在了膜上。接下來進行去磺酸基。為此加入0.2mol/L氫氧化鈉，並將DNA溫育10分鐘。然後進行另一次離心(10分鐘)，接下來使用1×TE緩衝液洗滌。接下來洗脫DNA。為此，用50μl溫的1×TE緩衝液(50℃)與膜混和10分鐘。根據生產商的說明將膜反過來，重複離心，這樣將DNA從膜上移下來。現在可以直接使用洗脫物用於計劃中的檢測反應。本領域內的技術人員已知使用其他超濾系統時可能涉及其他的步驟，也可以通過改變以上提到的條件得到良好的產量。相應的實施方案也是本發明的部分。
在不使用以上描述的變性溶劑或者在不使用熱尖峰進行轉化時，使用以上描述的超濾也促進了亞硫酸氫鹽轉化後的DNA純化的顯著改善。因此，根據本發明，DNA的亞硫酸氫鹽轉化的方法特徵在於轉化後的DNA的純化通過超濾方式進行。這樣可以根據以上的描述處理原料。也可以使用熱尖峰。優選的溫度範圍、熱尖峰的數目以及它們的持續時間與以上描述的範圍一致(參見以上)。而且，超濾優選地根據以上描述進行。因此，可以使用不同的超濾系統。在優選的實施方案中，使用Millipore的MicroconTM柱。純化優選根據修改的生產商的實驗方案按照以上的描述進行。本領域內的技術人員已知使用其他超濾系統時可能涉及其他的步驟，也可以通過改變以上提到的條件得到進一步提高的產量。相應的實施方案也是本發明的部分。
通過以上描述的不同實施方案經過轉化和純化的DNA，現在可以用不同方式進行分析了。非常優選地首先通過聚合酶鏈式反應擴增DNA。這樣，可以通過不同的方法，例如通過所謂的「重甲基(HeavyMethyl)」方法(綜述參見Cottrell等人；A real-time PCR assay for DNA-methylation using methylation-specific blockers.Nucleic AcidsRes.2004 Jan 13；32(1)e10.WO02/072880)或者所謂的「甲基化敏感PCR」(″MSP″；參見Herman等人Methylation-specific PCRanovel PCR assay for methylation status of CpG islands.Proc NatlAcad Sci USA.1996 Sep 3；93(18)9821-6)確保對原來甲基化或者非甲基化的DNA進行選擇性的擴增。可以通過常規方法例如引物延伸反應(″MsSNuPE″；參見例如DE 100 10 280＝US 10/220,090)或者與寡聚體陣列雜交(參見例如Adorjan等人，Tumour class predictionand discovery by microarray-based DNA methylation analysis.Nucleic Acids Res.2002 Mar 1；30(5)e21)對得到的擴增產物進行檢測。在另一個特別優選的實施方案中，使用實時PCR的變異方法(參見US 6,331,393″Methyl Light″)對擴增產物進行分析。因此優選的變異方法是「Taqman」以及「Lightcycler」方法。
這裡公開的方法優選地用於患者或者個體的有害事件的診斷和/或預後，其中這些有害事件屬於以下的種類的至少一種不希望的藥物相互作用；癌症疾病；CNS機能障礙、損傷和疾病；攻擊症狀或者行為障礙；腦損傷的臨床、心理以及社會的後果；精神障礙和性格疾患；痴呆和/或相關的症候群；心血管疾病、功能障礙和損傷；胃腸道功能障礙、損傷或者疾病；呼吸系統功能障礙、損傷或者疾病；損傷、發炎、感染、免疫性和/或恢復期；由於發育過程異常產生的身體的功能障礙、損傷或者疾病；皮膚、肌肉結締組織或者骨骼的功能障礙、損傷或者疾病；內分泌和代謝功能障礙、損傷或者疾病；頭痛或者性功能障礙。
新方法還以特別優選的方式區分細胞類型、組織或者研究細胞分化。
新方法還以特別優選的方式用於分析患者對藥物治療的反應。
本發明的對象還是試劑盒，試劑盒含有含亞硫酸氫鹽的試劑、變性劑或者溶劑以及清除劑，用於產生擴增產物的引物以及選擇地，超濾管或者進行檢測的說明。
實施例以下的實施例解釋了本發明。
實施例1自動進行的亞硫酸氫鹽反應本實施例描述了檢測基因組DNA樣品中因子VIII基因的胞嘧啶甲基化狀態的方法的應用，根據生產商的說明DNA樣品使用限制性核酸內切酶處理。該方法基於具有四個分開的、垂直可移動的適配器的用於可交換的吸頭的自動化移液系統(MWG RoboSeq 4204)的應用，這樣避免交叉汙染。移液系統可使100μl(等分試樣)移液誤差小於±2μl。自動化移液系統的操作臺配有六個用於移液吸頭的架子以及八個移液位置(其中兩個可以被冷卻)，可以冷卻的試劑架，可以堆放10個微量滴定平板的堆垛系統(stacking system)，移液吸頭清洗站以及將移液吸頭從適配器上分開的裝置。
自動移液系統通過連續的界面與計算機相連，通過軟體程序被控制，軟體程序可以對本發明方法的應用所需的所有移液步驟進行自由編程。
在本方法的第一步中，手動將DNA樣品的等分試樣置於微量滴定板96個可自由選擇的位置中的一個。然後使用Eppendorf MasterCycler將微量滴定板加熱到96℃，使預處理的DNA樣品變性。然後將微量滴定板轉移到自動移液系統中。將變性劑(二烷)、3.3M亞硫酸氫鈉溶液以及溶於所使用變性劑中的清除劑溶液的等分試樣以程控的方式一個接一個從試劑架上移液到所有含有DNA的位置中。然後微量滴定板在Eppendorf Mastercycler中溫育，使DNA樣品中所有未甲基化的胞嘧啶殘基在亞硫酸氫鈉的作用下轉化為亞硫酸氫鹽的加合物。
在亞硫酸氫鹽處理以後，將微量滴定板從熱循環儀中轉移到自動移液系統中。然後裝上相同類型的第二微量滴定板。首先將鹼性的Tris-HCl緩衝液(pH9.5)然後將亞硫酸氫鹽處理的DNA等分試樣轉移到在所有室(chamber)內的第二塊微量滴定板上的相應位置中(它們在第一塊平板上的相應的位置處含有亞硫酸氫鹽處理的DNA樣品)。在鹼性溶液中未甲基化的胞嘧啶殘基的亞硫酸氫鹽加合物被轉化為尿嘧啶殘基。
通過聚合酶鏈式反應(PCR)進行亞硫酸氫鹽處理的DNA的一條鏈(在本實施例中是有義鏈)的靶向擴增。使用了一對類型1引物(AGG GAGTTT TTT TTA GGG AAT AGA GGG A(SEQ.ID1)和TAA TCC CAA AAC CTCTCC ACT ACA ACA A(SEQ ID2)，這使被亞硫酸氫鹽成功處理的DNA鏈被特異地擴增，而未甲基化的胞嘧啶殘基沒有被轉化或者被完全轉化為尿嘧啶殘基的DNA鏈則不能被擴增。將第三個相同類型的微量滴定板置於自動移液系統中進行PCR反應。在所有的室中(其在第一塊平板上的相應的位置含有亞硫酸氫鹽處理的DNA樣品)首先自動移入含有PCR緩衝液、DNA聚合酶以及類型1引物的儲液的等分試樣。然後將稀釋後的亞硫酸氫鹽處理的DNA的等分試樣從第二塊微量滴定板的每一個位置自動轉移到第三塊微量滴定板的相應位置上，之後將第三塊平板轉移到循環儀中進行PCR反應。使用瓊脂糖凝膠電泳以及接下來溴乙啶染色鑑定PCR產物(

圖1)。圖1顯示了PCR擴增的亞硫酸氫鹽處理的DNA鏈的凝膠圖像(左側分子量標誌，右側PCR產物)。
實施例2通過加入二烷對亞硫酸氫鹽轉化進行優化，用於檢測血漿樣品中的DNA
將會顯示優化的亞硫酸氫鹽方法可對來自體液的DNA進行敏感甲基化分析。為了這個目的，將1毫升人血漿與特異量的人DNA混和。使用Magna Pure方法(Roche)根據生產商的說明從血漿樣品中分離DNA。純化得到的100μl洗脫物完全用於以下的亞硫酸氫鹽反應中。根據標準方法(Frommer等人，在上述引文中)進行轉化作為對照。根據本發明的方法的步驟如下洗脫物與354μl亞硫酸氫鹽溶液(5.89mol/L)以及146μl含有自由基清除劑(6-羥基-2，5，7，8-四甲基色烷2-羧酸，98.6毫克溶於2.5毫升二烷)的二烷混和。反應混合物在99℃變性3分鐘，接下來在以下的溫度程序中溫育，共5小時50℃30分鐘；一次熱尖峰(99.9℃)3分鐘；50℃ 1.5小時；一次熱尖峰(99.9℃)3分鐘；50℃3小時。接下來通過超濾使用Millipore的MicroconTM柱純化對照和根據本發明的方法的反應混合物。純化基本上根據生產商的說明進行。為此將反應混合物與300μl水混和，加到超濾膜上，離心15分鐘，然後使用1×TE緩衝液洗滌。在這一處理中，DNA留在了膜上。接下來進行脫磺酸基。為此加入0.2mol/L氫氧化鈉，並溫育10分鐘。然後進行離心(10分鐘)，接下來使用1×TE緩衝液洗滌。這以後洗脫DNA。為此，用50μl溫的1×TE緩衝液(50℃)與膜混和10分鐘。根據生產商的說明將膜反過來。接下來重複離心，這樣將DNA從膜上移下來。使用10μl洗脫物用於以下的Lightcycler實時PCR。對人β-肌動蛋白的一部分進行分析(參見MiyamotoNucleotide sequence of thehuman beta-actin promoter 5′flanking region；Nucleic Acids Res.15(21)，9095(1987))。使用以下的引物和探針正向引物TGG TGA TGGAGG AGG TTT AGT AAG T(SEQ ID 3)；反向引物AAC CAA TAA AAC CTACTC CTC CCT TAA(SEQ ID 4)；供體探針TTG TGA ATT TGT GTT TGTTAT TGT GTG TTG-flou(SEQ ID 5)；受體探針LC Red640-TGG TGGTTA TTT TTT TTA TTA GGT TGT GGT-Phos(SEQ ID 6)。通過亞硫酸氫鹽特異的試驗進行擴增。使用Lightcycle軟體對螢光信號進行檢測和計算。可以與標準曲線進行比較對轉化的並且分離的DNA定量。優化的方法產生的DNA濃度是133.21ng/100μl，而傳統的方法產生的DNA濃度是41.03ng/100μl。因此根據本發明的方法能使DNA產量比傳統方法高3倍。
實施例3通過加入DME優化亞硫酸氫鹽轉化，用於檢測血漿樣品中的DNA將會顯示優化的亞硫酸氫鹽方法可對來自體液的DNA進行敏感甲基化分析。為了這個目的，將1毫升人血漿與特異量的人DNA混和。使用Magna Pure方法(Roche)根據生產商的說明從血漿樣品中分離DNA。純化得到的100μl洗脫物完全用於以下亞硫酸氫鹽反應中。根據標準方法(Frommer等人，在上述引文中)進行的轉化作為對照。根據本發明的方法的步驟如下洗脫物與354μl亞硫酸氫鹽溶液(5.89mol/L)以及46μl含有自由基清除劑(6-羥基-2，5，7，8-四甲基色烷2-羧酸，98.6毫克溶於787μl的DME)的DME混和。反應混合物在99℃變性3分鐘，接下來在以下的溫度程序中溫育，共5小時50℃30分鐘；一次熱尖峰(99.9℃)3分鐘；50℃ 1.5小時；一次熱尖峰(99.9℃)3分鐘；50℃ 3小時。接下來通過超濾使用Millipore的MicroconTM柱純化對照和根據本發明的方法的反應混合物。純化基本上根據生產商的說明進行。為此將反應混合物與300μl水混和，加到超濾膜上，離心15分鐘，然後使用1×TE緩衝液洗滌。在這一處理中，DNA留在了膜上。接下來進行脫磺酸基。為此在DNA中加入0.2mol/L氫氧化鈉，溫育10分鐘。然後進行離心(10分鐘)，接下來使用1×TE緩衝液洗滌。這以後洗脫DNA。為此，用50μl溫的1×TE緩衝液(50℃)與膜混和10分鐘。根據生產商的說明將膜反過來。接下來重複離心，這樣將DNA從膜上移下來。使用10μl洗脫物用於以下的Lightcycler實時PCR。通過使用實施例2中所述的引物和探針對人β-肌動蛋白區域進行分析。通過亞硫酸氫鹽特異的試驗進行擴增。使用Lightcycler軟體計算的結果在圖2中示出。左側的曲線對應於優化的方法，而右側的曲線對應於傳統方法。顯示即使使用小的循環數目，優化後的方法也產生了顯著的螢光信號。因此DNA產量比傳統方法高。可以與標準曲線進行比較對轉化的DNA定量。優化的方法產生的DNA濃度是133.27ng/100μl，而傳統的方法產生的DNA濃度是41.03ng/100μl。因此根據本發明的方法能使DNA產量比傳統方法高3倍。
實施例4在熱尖峰的幫助下進行亞硫酸氫鹽轉化向1μl MssI酶切的高純度人DNA(Promega；160ng)中加入2μlddH2O。樣品在96℃下變性10分鐘。然後加入大約10μl亞硫酸氫鹽溶液(5.85mol/L)和7μl自由基消除劑/二烷混合物(5μl二烷和2μl清除劑)。這以後取出第一個樣品(0小時)置於冰上。反應混合物在96℃溫育30秒然後在50℃溫育59.5分鐘。取出第二個樣品(1小時)置於冰上。第三個樣品(2小時)再次在96℃孵育30秒然後在50℃育59.5分鐘。然後該樣品也置於冰上。第四個樣品(3小時)再次在96℃溫育30秒然後在50℃溫育59.5分鐘，接下來冷卻。向樣品中加入30μl ddH2O。通過G25 Sephadex柱純化反應混合物。洗脫物與50μl100mmol/L Tris-HCl(pH9.5)混和在96℃下脫磺酸基20分鐘。每個PCR反應使用2μl該溶液。在PCR中每次擴增兩個亞硫酸氫鹽特異的片段、兩個非特異的片段以及一個基因組片段。隨著亞硫酸氫鹽轉化進行，亞硫酸氫鹽特異的片段被更為強烈地擴增出來。非特異片段的擴增與亞硫酸氫鹽轉化無關，它提供了DNA降解的指示。只有沒有被亞硫酸氫鹽轉化的基因組DNA仍然存在才有基因組片段被擴增。因此基團組DNA擴增是不完全亞硫酸氫鹽轉化的測量。在瓊脂糖凝酸中分離的擴增產物可參見圖3。這裡顯示在根據本發明的方法中即使在1小時以後大部分的DNA都已經被轉化。最晚3小時以後已經不能再檢測出基因組DNA了，即亞硫酸氫鹽的轉化是完全的。在傳統的亞硫酸氫鹽處理中，相應的數值最早也要在5小時以後(參見下面)才產生。
實施例5使用熱尖峰的亞硫酸氫鹽處理與沒有熱尖峰的亞硫酸氫鹽處理的比較如實施例4中進行處理的樣品溫育3或者5小時的反應時間，具有兩次熱尖峰。對照反應沒有熱尖峰。根據以上的描述進行純化和PCR。擴增了兩個亞硫酸氫鹽特異的片段。其中一個片段富含胞嘧啶。這樣需要相對較長的反應時間以獲得完全的轉化。相反，另一個片段具有少量的胞嘧啶因此在相對較短的時間之後即被完全轉化。擴增的結果示於圖4中。在左圖中可以看到傳統的亞硫酸氫鹽轉化，而在右圖中可以看到使用熱尖峰的優化的轉化。每一幅圖內富含胞嘧啶的片段都示於左側，而含少量胞嘧啶的片段示於右側。圖中顯示根據本發明的方法能進行明顯更靈敏的檢測。因此，使用熱尖峰處理，即使在3小時以後，富含胞嘧啶的片段也可以被明確地檢測出來，而使用傳統的方法即使在5小時反應時間之後，富含胞嘧啶的片段也不能被檢測出來。
實施例6在根據本發明的方法中DNA的回收率將會顯示根據本發明的方法能非常有效地進行亞硫酸氫鹽轉化和純化。為了這個目的，將不同量的M13-DNA和人DNA溶於100μl水中。DNA溶液與354μl亞硫酸氫鹽溶液(5.89mol/L)以及146μl含有自由基清除劑(6-羥基-2，5，7，8-四甲基色烷2-羧酸，98.6毫克溶於2.5毫升二烷)的二烷混和。反應混合物在99℃變性3分鐘，接下來在以下的溫度程序中溫育，共5小時50℃30分鐘；一次熱尖峰(99.9℃)3分鐘；50℃1.5小時；一次熱尖峰(99.9℃)3分鐘；50℃3小時。接下來使用Millipore的MicroconTM柱通過超濾純化反應混合物。純化基本上根據生產商的說明進行。為此，將反應混合物與300μl水混和，加到超濾膜上，離心15分鐘，然後使用1×TE緩衝液洗滌。在這一處理中，DNA留在了膜上。接下來進行脫磺酸基。為此加入0.2mol/L氫氧化鈉，溫育10分鐘。然後進行離心(10分鐘)，接下來使用1×TE緩衝液洗滌。這以後洗脫DNA。為此，用50μl溫的1×TE緩衝液(50℃)與膜混和10分鐘。根據生產商的說明將膜反過來。接下來重複離心，這樣將DNA從膜上移下來。然後螢光測定法測定DNA的濃度(橄欖綠)。數據示於表1中。DNA的回收率至少為75％。相反，在已知的DNA亞硫酸氫鹽轉化和純化的方法中，DNA的回收率低於25％。
表1
附圖的簡要描述圖1顯示了實施例1的結果。顯示了PCR擴增的亞硫酸氫鹽處理的DNA鏈的凝膠圖形(左側分子量標誌，右側PCR產物)。
圖2顯示了實施例3的結果(使用DME)。從血漿樣品中分離DNA，使用亞硫酸氫鹽處理並且通過Lightcycler PCR的方式擴增。Y軸顯示了每次循環中測量的螢光信號。X軸表示了循環數目。左側顯示了根據本發明的方法的曲線，右側顯示的是根據傳統方法的曲線。圖中顯示，即使使用小的循環數目，優化的方法產生了明顯的螢光信號。DNA產量比傳統方法高。
圖3顯示了實施例4的結果。顯示了PCR擴增後的電泳凝膠。每一次擴增兩個不同的亞硫酸氫鹽特異的片段、兩個非特異片段以及一個基因組片段。最上面的圖片顯示了零值(反應時間＝0小時)。從上面數的第二幅圖片顯示具有一次熱尖峰、總反應時間為1小時的反應。從上面數的第三幅圖片對應的是具有兩次熱尖峰、總反應時間為2小時的反應。最下面的圖片顯示了具有三次熱尖峰、反應時間為3小時的反應。使用根據本發明的方法，即使在1小時之後大部分的DNA被轉化了(從上面數的第二幅圖片)。最晚在3小時以後，已經不能再檢測出基因組DNA了(最下面的圖片)。
圖4顯示了實施例5的結果。顯示了PCR擴增後的凝膠電泳。擴增了兩種不同的亞硫酸氫鹽特異擴增產物。左側的圖片顯示了傳統亞硫酸氫鹽處理，而右側的圖片顯示了根據本發明的方法。上面顯示的是3小時的反應時間，下面顯示的是5小時的反應時間。使用根據本發明的方法(熱尖峰)顯然可以得到更為敏感的檢測。因此，左側泳道顯示的片段在3小時的反應時間之後可以被檢測出來，而來自傳統方法的片段即使在5小時的溫育之後也不能被檢測出來。
序列表110Epigenomics AG120改進的DNA亞硫酸氫鹽轉化1606210121128212DNA213人工序列220
223引物4001agggagtttt ttttagggaa tagaggga28210221128212DNA213人工序列220
223引物4002taatcccaaa acctctccac tacaacaa28210321125212DNA213人工序列220
223引物4003tggtgatgga ggaggtttag taagt 25210421127212DNA213人工序列220
223引物4004aaccaataaa acctactcct cccttaa 27210521130212DNA213人工序列220
223檢測探針
4005ttgtgaattt gtgtttgtta ttgtgtgttg 30210621130212DNA213人工序列220
223檢測探針4006tggtggttattttttttatt aggttgtggt 30
權利要求
1.DNA亞硫酸氫鹽轉化的方法，其中基因組DNA與亞硫酸氫鹽試劑反應，該方法的特徵在於所述的反應在選自二烷、其衍生物之一以及類似的脂肪族環醚存在下進行。
2.根據權利要求1的方法，其進一步特徵在於所述化合物的濃度是10-35％體積。
3.根據權利要求1的方法，其進一步特徵在於所述化合物的濃度是20-30％體積。
4.DNA亞硫酸氫鹽轉化的方法，其中基因組DNA與亞硫酸氫鹽試劑反應，其特徵在於所述的反應在具有下式的化合物存在下進行 n＝1-35000m＝1-3R1＝H，Me，Et，Pr，BuR2＝H，Me，Et，Pr，Bu。
5.根據權利要求4的方法，其進一步特徵在於所述化合物包括正烷撐二醇化合物。
6.根據權利要求5的方法，其進一步特徵在於所述化合物包括二烷基醚。
7.根據權利要求6的方法，其進一步特徵在於所述化合物包括二甘醇二甲醚(DME)。
8.根據權利要求4的方法，其進一步特徵在於所述化合物以1-35％體積濃度存在。
9.根據權利要求4的方法，其進一步特徵在於所述化合物以5-25％體積濃度存在。
10.DNA亞硫酸氫鹽轉化的方法，其中分離的基因組DNA與亞硫酸氫鹽試劑反應，該方法特徵在於反應在0-80℃的溫度範圍內進行，在轉化過程中，反應的溫度短暫升高到85-100℃的範圍(熱尖峰)。
11.根據權利要求10的方法，其進一步特徵在於短暫的溫度升高(熱尖峰)的次數是2到5次。
12.根據權利要求10的方法，其進一步特徵在於在短暫的溫度升高(熱尖峰)中反應溫度升高到85-100℃。
13.根據權利要求12的方法，其進一步特徵在於短暫的溫度升高(熱尖峰)使反應溫度升高到90-98℃。
14.根據權利要求10的方法，其進一步特徵在於通過磁性顆粒純化被轉化的DNA。
15.DNA亞硫酸氫鹽轉化的方法，其特徵在於通過超濾純化被轉化的DNA。
16.根據權利要求1、4、10或者15的方法，其進一步特徵在於通過以下方法之一對被轉化的DNA進行分析MSP，Heavy Methyl，MsSNuPE，Methyl Light。
17.根據權利要求1、4、10或者15的方法，其進一步特徵在於研究組織樣品或者體液的DNA。
18.根據權利要求1、4、10或者15的方法用於患者或者個體的有害事件的診斷和/或預後的用途，其中這些有害事件屬於以下的種類的至少一種不希望的藥物相互作用；癌症疾病；CNS機能障礙、損傷或疾病；攻擊症狀或者行為障礙；腦損傷的臨床、心理以及社會後果；精神障礙和性格疾患；痴呆和/或相關的症候群；心血管疾病、功能障礙和損傷；胃腸道功能障礙、損傷或者疾病；呼吸系統功能障礙、損傷或者疾病；損傷、炎症、感染、免疫性和/或恢復期；由於發育過程異常產生的身體的功能障礙、損傷或者疾病；皮膚、肌肉、結締組織或者骨骼的功能障礙、損傷或者疾病；內分泌和代謝功能障礙、損傷或者疾病；頭痛或者性功能障礙。
19.根據權利要求1、4、10或者15的方法用於區分細胞類型、組織或者研究細胞分化的用途。
20.試劑盒，其由含有亞硫酸氫鹽的試劑、變性劑或者溶劑以及清除劑，用於產生擴增產物的引物組成以及選擇地，含有超濾管或者用於進行根據前面權利要求中的一項進行檢測的使用說明。
全文摘要
本發明涉及DNA亞硫酸氫鹽轉化的改進方法。將變性溶劑、新的反應條件以及新的純化方法組合在一起，亞硫酸氫鹽轉化的效果得到了明顯提高。接下來可以通過不同的方法分析被轉化的DNA。本發明有助於對胞嘧啶甲基化的分析。
文檔編號C12Q1/68GK1863929SQ200480029442
公開日2006年11月15日 申請日期2004年10月11日 優先權日2003年10月9日
發明者K·博林, M·保豪瑟, K·卡頓 申請人:Epi基因組股份公司