人二倍體細胞狂犬病疫苗病毒液製備方法
2023-06-17 07:26:21 1
專利名稱：人二倍體細胞狂犬病疫苗病毒液製備方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別是利用狂犬病毒PM株在人二倍體細胞上製備病毒液的方法。
背景技術：
狂犬病在100多個國家均有流行。全世界超過33億人居住在狂犬病流行地區，尤其是亞洲和非洲。人類感染狂犬病病毒後，一旦出現臨床症狀幾乎100%死亡，99%的死亡由犬狂犬病造成，除家犬外很多肉食動物和蝙蝠也可以向人類傳播狂犬病病毒。亞洲是狂犬病高發地區，約佔全球因犬傷所致人狂犬病死亡病例的90%。2000年，在亞洲15個狂犬病流行國家生活的31.1億人口中，約37000人死於狂犬病。大多數人由於暴露於狂犬病病毒潛在感染，而沒有接受治療或者注射任何疫苗而導致死亡。衛生部2009年、2010年全國法定傳染病報告發病、死亡統計表中，狂犬病的死亡率第一，死亡數第三，狂犬病已成為我國最嚴重的公共衛生問題之一。
根據我國人用狂犬病疫苗的使用量每年被動物傷害的人數超過1000萬人。為滿足我國國內市場的需求，國內很多廠家都在生產狂犬疫苗，主要包括原代地鼠腎細胞、原代雞胚細胞和Veix)傳代細胞疫苗。這些疫苗都存在異源蛋白，外源因子，DNA汙染等各種不同的風險因素。另外原代細胞培養需每批疫苗須檢查培養器官源的雜質(細菌、支原體、病毒)，並且動物器官的可用量是限制工業化生產的因素；而Veix)細胞屬於猴源細胞，宿主 DNA殘留比較高，存在致瘤風險。國外生產的人二倍體細胞狂犬病疫苗，如美國Wyeth廠，法國Sanofi Pasteur廠和德國Behring廠生產的二倍體疫苗,具有高免疫原性和良好的耐受性，和無異源蛋白的不良影響，目前在美國、加拿大、大多數歐洲國家和幾個亞洲國家使用。
因目前國內人用二倍體狂犬病疫苗所使用的MRC-5細胞基質來源於ATCC，而ATCC 明確指出僅供研究用，考慮到未來狂犬病疫苗工業化生產，故本研究所使用的MRC-5細胞來源於Sanofi Pasteur的細胞生產庫,Sanof i Pasteur的細胞生產庫是從NIBSC得到早代細胞建立而成的，狂犬病毒PM株亦購買於Sanofi Pasteur的病毒生產庫，MRC-5細胞和PM 病毒籤訂協議允許可用於狂犬病疫苗的生產。為本發明的大規模生產提供了有力的保障。
發明內容
本發明的目的在於提供一種人二倍體細胞狂犬病疫苗病毒液製備方法。
本發明提供一種人二倍體細胞狂犬病疫苗病毒液製備方法，是在人用二倍體細胞上接種狂犬病毒PM株，培養病毒感染的人用二倍體細胞得到狂犬病毒液，所用的人用二倍體細胞是MRC-5。
本發明的人二倍體細胞狂犬病疫苗病毒液製備方法，包括如下步驟
( I) MRC-5細胞的復甦與擴培；
(2 )在MRC-5細胞上接種狂犬病病毒PM株；
(3)接種PM毒株後的MRC-5細胞繼續傳代擴培；
(4)衝洗細胞，之後加入病毒培養液
(5)收穫病毒液。
其中，步驟(I)的MRC-5細胞在15 25°C的水浴中復甦，5 9h後更換細胞培養液。
其中步驟(I)細胞擴增按照1:2 1:4的比例傳代擴增培養，得到細胞懸液。
其中，步驟(2)按照O. 05-0.1MOI接種狂犬病毒至細胞懸液，36°C _38°C水浴保溫 13-17min，之後繼續培養。
步驟(2)按照1:2 1:4的比例分種36 38°C培養20-25h後，調溫至33 36 °C繼續培養。
其中，步驟(3)的方法是先用PBS溶液洗滌細胞面，再用胰酶消化細胞，用細胞培養液重懸細胞，製成病毒細胞懸液。按照1:2 1:4的比例分種。
本發明的製備方法中，步驟(I)、(2)、(3)中MRC-5細胞培養液為含10°/Γ20%胎牛血清的BME培養液，pH值為6. 90 7. 20，滲透壓為30(T340mosm/kg，不含抗生素。
進一步地，步驟(I)、(2)、(3)細胞培養溫度為33 38°C。
進一步地，步驟(4)、(5)細胞培養溫度為33 36°C。
其中，步驟(4)中使用的衝洗液為BME液，pH值為6. 80^7. 10，滲透壓為 290-320mosm/kg,不含抗生素。
本發明方法步驟(4 )衝洗細胞分兩步，目的在於去除牛血清白蛋白，第一次衝洗細胞面，先用衝洗液衝洗表面，然後加入人白培養液培養細胞16_20h後，進行第二次衝洗，用衝洗液衝洗細胞表面之後，加入病毒培養液培養3 4d,所述人白培養液為含O. 2%" . 5%人血白蛋白的BME液，pH值為6. 80-7. 10，滲透壓為290-320mosm/kg，不含抗生素。
本發明的製備方法中，步驟(4)中病毒培養液為含O. 29ΓΟ. 5%人血白蛋白的BME培養液，PH值為7. 30 8. 00，滲透壓為31(T350mosm/kg，不含抗生素。
本發明的步驟(5)中病毒液收穫是指經過增殖收穫病毒細胞的上清液。單次收穫後，繼續補加O. 6-0. 9ml/cm2的病毒培養液繼續33°C _36°C培養。可連續收穫3至5次。
本發明提供的人二倍體細胞狂犬病疫苗病毒液製備方法，還包括病毒液收穫後進行濃縮的步驟。
其中，本發明的實施例中使用IOKB超濾膜包超濾進行濃縮，濃縮倍數為 10. (Γ20. O倍。濃縮後的濃縮液過濾後存放於2 8°C保存，不超過30天。
本發明方法中，步驟(5)中病毒液的滴度不低於6. 51gCCID5(l/ml，濃縮後病毒液的滴度不低於7. 51gCCID50/ml且效價不低於4. 0IU/ml。
本發明提供的在人用二倍體細胞MRC-5上接種狂犬病毒PM株，培養病毒感染的人用二倍體細胞得到狂犬病毒液的方法適合大規模工業化生產 ，病毒液滴度穩定。本發明的製備方法由於採用帶毒細胞連續傳代的工藝，延長了細胞的帶毒時間，提高了病毒液中病毒的收穫量，短時間內達到希望的病毒量，從而縮短了製備工藝的時間，節省了狂犬病毒PM 株毒種的用量。另外，本發明製備得到的病毒液抗原含量高，病毒效價、滴度高，達到了本領域內對人二倍體狂犬病疫苗病毒液質量標準和效果的要求。本發明方法適合推廣使用。
具體實施方式
以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明的範圍。
若未特別指明，實施例中所用的化學試劑均為常規市售，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
實施例1人二倍體細胞狂犬病疫苗病毒液製備方法(I)
取含有MRC-5細胞的凍存管，迅速放入20°C水浴中融化，然後加入到預溫至25°C 的含20%胎牛血清細胞培養液(BME培養液，pH值為6. 90，滲透壓為300mosm/kg，不含抗生素)中，置於37°C培養，連續擴增至細胞長成緻密的單層細胞。將單層細胞製備為細胞懸液，將狂犬病毒PM毒種按照O. 07M0I接種，37°C水浴保溫15分鐘後分裝按照1:3比例分裝培養22小時，然後調溫至35°C繼續培養，待病毒細胞長成單層後，先用PBS溶液洗滌細胞面，再用O. 01%胰酶消化細胞，消化病毒細胞製備成病毒細胞終懸液，按照1:2比列分裝 37°C培養23小時，然後調溫至35°C繼續培養48小時用衝洗液(BME液，pH值為7. 10，滲透壓為320mosm/kg，不含抗生素)第一次衝洗細胞面，加入人白培養液(含O. 5%人血白蛋白的 BME液，pH值為7. 00，滲透壓為300mosm/kg，不含抗生素)35°C培養19小時，再進行第二次細胞面衝洗，加入病毒培養液(含O. 5%人血白蛋白的BME培養液，pH值為7. 60，滲透壓為 320mOsm/kg，不含抗生素)35°C培養。病毒經過4d增殖收集病毒細胞上清液.收集的病毒細胞上清液即為狂犬病毒液。
按以上方法，將狂犬病毒PM株連續在MRC-5細胞上傳7代，將病毒液做10倍系列稀釋至10_2後，再5倍系列稀釋，取12-14g的小鼠接種，每個稀釋度腹腔接種(IP)小鼠10 只，每隻接種O.1ml ;每個稀釋度腦腔接種(IC)小鼠10隻，每隻接種O. 03ml。逐日觀察， 觀察14天。計算IC滴度LD5Q/0. 03ml和IP滴度LD5(l/0.1ml的比值，IC/IP比值應不低於 1000。
將病毒液系列稀釋，在96孔微量培養板中和一定濃度的BHK21細胞共培養一段時間後，通過異硫氰酸螢光素標記的抗狂犬糖蛋白的單克隆抗體檢測每孔中是否存在病毒， 通過螢光顯微鏡觀察，以計算病毒對細胞的半數感染劑量，用IgCCID5ciAil表示。
表I不同PM株代次傳代結果
權利要求
1.一種人二倍體細胞狂犬病疫苗病毒液製備方法，其特徵在於，在人用二倍體細胞上接種狂犬病毒PM株，培養病毒感染的人用二倍體細胞得到狂犬病毒液，所述的人用二倍體細胞是MRC-5。
2.如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟(1)MRC-5細胞的復甦與擴培；(2)在MRC-5細胞上接種狂犬病病毒PM株；(3)接種PM毒株後的MRC-5細胞繼續傳代擴培；(4)衝洗細胞，之後加入病毒培養液(5)收穫病毒液。
3.如權利要求2所述的製備方法，其特徵在於，步驟(I)的MRC-5細胞在15-25°C的水浴中復甦，5_9h後更換細胞培養液。
4.如權利要求2所述的製備方法，其特徵在於，步驟(2)按照O.05-0.1MOI接種狂犬病毒至細胞懸液，36°C _38°C水浴保溫13-17min，之後繼續培養。
5.如權利要求2所述的製備方法，其特徵在於，步驟(3)的方法是先用PBS溶液洗滌細胞面，再用胰酶消化細胞，用細胞培養液重懸細胞，製成病毒細胞懸液，培養2 3d。
6.如權利要求2所述的製備方法，其特徵在於，步驟(I)、(2)、(3)中MRC-5細胞的培養液為含10% 20%胎牛血清的BME培養液，pH值為6. 90-7. 20，滲透壓為300-340mosm/kg， 不含抗生素。
7.如權利要求2所述的製備方法，其特徵在於，步驟(4)中病毒培養液為含O.29ΓΟ. 5% 人血白蛋白的BME培養液，pH值為7. 30-8. 00，滲透壓為310-350mosm/kg，不含抗生素。
8.如權利要求2所述的製備方法，其特徵在於，步驟(4)衝洗細胞的方法為先用衝洗液衝洗細胞表面，所述衝洗液為BME液，pH值為6. 8(Γ7. 10，滲透壓為290-320mOsm/kg，不含抗生素；然後加入人白培養液培養16_20h，所述人白培養液為含O. 29ΓΟ. 5%人血白蛋白的BME液，pH值為6. 80-7. 10，滲透壓為290-320mosm/kg，不含抗生素；用衝洗液進行第二次細胞面的衝洗，之後加入病毒培養液培養3 4d。
9.如權利要求2所述的製備方法，其特徵在於，還包括病毒液收穫後進行濃縮的步驟。
10.如權利要求9所述的製備方法，其特徵在於，步驟5)中病毒液的滴度不低於.6.5LgCCID5Q/ml，濃縮後病毒液的滴度不低於7. 5LgCCID50/ml且效價不低於4. 0IU/ml。
全文摘要
本發明提供了一種人二倍體細胞狂犬病疫苗病毒液製備方法，涉及生物技術領域，是利用狂犬病毒固定毒PM-1503-3M株接種於MRC-5細胞，生產人二倍體細胞狂犬病疫苗病毒液。本發明方法工藝簡單，節約成本，製得的病毒液抗原含量高，病毒效價和滴度高，適合於大規模工業化生產，且可滿足國內外市場對人二倍體狂犬病疫苗的需求。
文檔編號C12N7/00GK103060276SQ20131000968
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月10日 優先權日2013年1月10日
發明者左靜, 高正倫, 劉海文, 方群, 季振濤, 鄭森遠, 張騫, 劉勇, 張芮銘, 代凡, 吳淞, 張雪, 戴會忠, 劉雅靜, 王雲達, 樊鵬 申請人:北京民海生物科技有限公司