一種溶解池塘甲藻的蠟樣芽孢桿菌JZBC1的工業化液體發酵方法與流程
2023-06-17 08:45:06 3
本發明屬於微生物製劑技術領域，具體涉及一種溶解池塘甲藻的蠟樣芽孢桿菌JZBC1的工業化液體發酵方法。
背景技術：
近年來水域環境的甲藻赤潮頻發，養殖水源環境的汙染日趨惡化，這嚴重影響了池塘養殖生產的健康發展。有研究表明當池塘水體形成以甲藻、藍藻等有害微藻為優勢時，養殖水質惡化，養殖對蝦的生長和健康水平受到嚴重影響(劉孝竹,2011)；當甲藻濃度升高到104cells/L時，致使對蝦行為異常並逐漸死亡(Linares,2009)。而南方海水或鹹淡水池塘在養殖前中期容易形成以甲藻為優勢的微藻群落結構，在此環境下養殖對蝦極易發生病害，嚴重影響了養殖效益(彭聰聰,2011；劉孝竹,2009)。所以，嚴格控制甲藻的生態優勢，穩定養護以綠藻或硅藻為優勢的微藻環境，對保障池塘養殖生產順利開展具有重要的現實意義。目前在甲藻防控領域的研究主要集中在對海灣赤潮(Mayali,2007；Rooney,2005)及相關有害藻特性與治理(謝志浩,2008)，以及相應溶藻菌的分離篩選與溶藻機制分析等(Yang et al,2013；Shi et al,2013)。養殖池塘環境與上述水環境差異巨大，有關利用溶藻菌防控池塘甲藻優勢並維護優良微藻藻相的研究及應用還少見報導。近年來報導的微藻溶藻菌種類主要有：芽孢桿菌、海洋桿菌、屈撓細菌、假單胞菌、弧菌、噬胞菌、黃桿菌、節桿菌、葡萄球菌、鞘氨醇單胞菌等。史榮君(2013)、Yang(2013)等從赤潮環境中篩選了可有效溶解赤潮硅藻和甲藻的溶藻菌菌株，它們屬於芽孢桿菌、海洋桿菌等多個菌種。
本申請中的溶藻菌株JZBC1為蠟樣芽孢桿菌(保藏名稱為蠟樣芽孢桿菌JZBC1，保藏單位：中國典型培養物保藏中心，地址：中國武漢，保藏日期：2016年3月3日，保藏號：CCTCC M 2016081，申請號：201610209371.X)，它僅對池塘優勢甲藻——錐狀斯氏藻具有溶解消除作用，對小球藻、柵藻、小環藻等優良綠藻和硅藻無不良影響。
蠟樣芽孢桿菌廣泛存在於環境中，為革蘭氏陽性菌，其非毒性菌株可淨化養殖水質，促進養殖生物健康生長，已被應用於醫藥、農業生產等領域(李煜等，2012；李俠等，2001)。曹煜成等在養殖池塘施用蠟樣芽孢桿菌CZBC1菌劑，有效控制了顫藻、微囊藻等有害藍藻，而對養殖對蝦和水體其他優良綠藻和硅藻沒有影響(曹煜成等，ZL201310 203745.3)；陽鋼等使用蠟樣芽孢桿菌BC-1有效提高了刺參的生長速度(陽鋼等，2012)；何鑑堯等研究發現蠟樣芽孢桿菌L7和L8對螺旋鞘絲藻有顯著地控制效果(何鑑堯等，2008)。王善龍研究指出雖然對蝦養殖水體中也存在蠟樣芽孢桿菌，但只有施用了蠟樣芽孢桿菌CZBC1的養殖水環境中的藍藻數量才得到有效控制(王善龍，2015)。可見，即使是同屬於蠟樣芽孢桿菌，但不同來源的菌株其生態功能特性存在較大的差異。
雖然就芽孢桿菌發酵工藝、溶藻菌發酵條件優化等已有報導(王海雲等，一株蠟樣芽胞桿菌及其製備方法應用，申請號201410223612.7；朱傑等，芽孢桿菌屬溶藻菌的固體發酵與應用，申請號201210308126.6；孫梅等，一種巨大芽孢桿菌及其固體發酵製備菌劑的方法和應用，申請號201310413693.2；榮小軍等，一種蠟樣芽孢桿菌及其製劑和應用，申請號201010602326.3；葉姜瑜等，響應曲面法優化溶藻細菌發酵條件的研究，2011；許珂等，溶藻細菌W5培養條件優化及發酵培養)。但目前針對蠟樣芽孢桿菌JZBC1菌劑的工業化發酵生產方法還未見報導。由於蠟樣芽孢桿菌不是所有菌株都具有溶解池塘甲藻的特性，而上述研究中的溶藻菌也非本申請中的蠟樣芽孢桿菌或類似的溶藻菌株，也未見相關菌劑的工業化生產產品。所以，本申請擬在溶解池塘優勢甲藻—錐狀斯氏藻的蠟樣芽孢桿菌菌株JZBC1的工業化液體發酵方法方面進行研究。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種溶解池塘甲藻的蠟樣芽孢桿菌JZBC1的工業化液體發酵方法，該方法通過研究蠟樣芽孢桿菌JZBC1的發酵培養基和發酵參數，建立了將菌劑從菌種到產品的工業化規模生產的相關工藝。
本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的：一種溶解池塘甲藻的蠟樣芽孢桿菌JZBC1的工業化液體發酵方法，包括以下步驟：
(1)確定蠟樣芽孢桿菌JZBC1的工業化發酵罐培養的發酵培養基；
(2)種子液培養：選取蠟樣芽孢桿菌JZBC1，在恆溫振蕩條件下進行活化培養，獲得發酵種子液；
(3)工業化發酵罐培養：依照50L—500L—5000L的發酵罐規模，將發酵種子液接入發酵培養基中逐級進行擴大發酵，獲得發酵液，其中，50L和500L發酵罐的發酵菌濃度均達到5.0×108～109cfu/mL以上，5000L發酵罐的最終菌濃度達到5.0×109～1010cfu/mL以上，芽孢獲得率90～95％以上；
(4)菌泥後處理與包裝：採用離心機除去步驟(3)所得發酵液中的多餘水分，獲得菌泥，將菌泥與載體混勻，經包括乾燥、粉碎和包裝工序處理後，獲得溶解池塘甲藻的蠟樣芽孢桿菌JZBC1製劑。
在上述溶解池塘甲藻的蠟樣芽孢桿菌JZBC1的工業化液體發酵方法中：
步驟(1)中所述的發酵培養基為：1L水中含有玉米漿18.5～24.5g、大豆蛋白12～20g、NaCl 0.8～1.5g、KH2PO4 0.15～0.4g、MgSO4 0.15～0.4g、CaCl2 0.1～0.3g、質量百分含量為3％的MnSO4溶液1mL。
進一步的，步驟(1)中所述的發酵培養基為：1L水中含有玉米漿20g、大豆蛋白13.5g、NaCl 1g、KH2PO4 0.2g、MgSO4 0.2g、CaCl2 0.1g，質量百分含量為3％的MnSO4溶液1mL。
在此條件下菌株的生長、芽孢形成率和發酵菌體的甲藻溶藻效率最佳。
步驟(2)中的蠟樣芽孢桿菌JZBC1，該菌株為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)，保藏名稱為蠟樣芽孢桿菌JZBC1，保藏單位：中國典型培養物保藏中心，地址：中國武漢，保藏日期：2016年3月3日，保藏編號：CCTCC No：M 2016081。具體內容可參閱申請號為201610209371.X的專利申請。
步驟(2)在恆溫振蕩條件下進行活化培養時，活化培養基為營養肉湯培養基(優選是營養肉湯液體培養基，市售產品，本申請購自廣東環凱微生物科技有限公司，此處僅為列舉，並非限定)，培養條件優選為：pH 6.00～7.50，170～240rpm，28～32℃恆溫振蕩培養18～30h。
步驟(3)中各發酵罐使用前經滅菌處理，發酵培養基的體積佔各發酵罐總容積的60～75％。
滅菌處理時，優選開啟加熱設備對發酵罐及管道系統進行滅菌(溫度121℃，時間18～24min)，待罐體冷卻至28～30℃，在50L發酵罐中接種入JZBC1發酵種子液。
步驟(3)中首先將發酵種子液接種入50L發酵罐中，發酵種子液的接種量佔發酵培養基總體積的2.5～5.5％，再依照50L發酵罐—500L發酵罐—5000L發酵罐的流程，進行逐級放大發酵，發酵條件為pH 6.8～7.5，溫度28～32℃，轉速450～700rpm，通氣量20～60L/min，發酵培養16～28h。每級發酵時的條件均保持基本一致。
其中500L發酵罐發酵時，將50L發酵罐中的發酵液全部接種入500L發酵罐中，5000L發酵罐發酵時，將500L發酵罐中的發酵液全部接種入5000L發酵罐。
50L發酵罐—500L發酵罐發酵結束後，對發酵液取樣進行顯微鏡檢測，保證發酵液未受到汙染，菌量達到5.0×108cfu/mL～109cfu/mL以上。
步驟(3)中依照50L—500L—5000L的發酵規模，進行逐級擴大發酵，各級發酵的操作要求同上所述，5000L發酵罐的最終菌濃度達到5.0×109cfu/mL～1010cfu/mL以上，芽孢獲得率90％～95％以上。
對步驟(3)的最終發酵液進行抽檢，檢測發酵菌體的甲藻溶藻效率，以池塘優勢甲藻—錐狀斯氏藻為測試藻，藻液的初始藻細胞濃度設為1.0×104cell/mL，依照105cfu/mL的菌濃度將發酵菌體添加至藻液中，當錐狀斯氏藻5d內的死亡率達到90％以上時視為甲藻溶藻性能合格，保證發酵獲得的菌體保持良好的甲藻溶藻特性。
步驟(4)中優選按單機單次裝載量為3～6kg將發酵液引入離心機，設定離心機轉速設為10000～14000rpm，離心40～50min，獲得菌量超過1010cfu/mL的菌泥。
步驟(4)中所述載體優選為麩皮，菌泥和麩皮的質量份配比為1：3～5，乾燥在63～75℃下用流化床乾燥，使得物料的水分含量達到8％以下。
最後以孔徑80～120目的規格用粉碎機進行粉碎，再按濃度109個/g用真空密封包裝。然後隨機抽取包裝好的菌劑產品，進行甲藻溶藻功效複查，複查程序和溶藻指標要求同上文所述，確保菌泥後處理加工過程對菌株的生長及溶藻特性無不良影響。
步驟(4)中對獲得的獲得溶解池塘甲藻的蠟樣芽孢桿菌JZBC1製劑進行隨機抽檢，抽檢芽孢含量、菌體生長情況和甲藻溶藻情況，製劑中菌濃度達到5.0×109～1010cfu/mL以上，芽孢獲得率達到90～95％以上，以池塘優勢甲藻—錐狀斯氏藻為測試藻，藻液的初始藻細胞濃度設為1.0×104cell/mL，依照105cfu/mL的菌濃度將發酵菌體添加至藻液中，當錐狀斯氏藻5d內的死亡率達到90％以上時，視為合格產品，確保蠟樣芽孢桿菌JZBC1經過各項工序處理後仍然保持良好的生長性能和甲藻溶藻特性。
與現有技術相比，本發明具有如下優點：
(1)本發明方法實現了對優選水產養殖池塘甲藻溶藻菌——蠟樣芽孢桿菌JZBC1的工業化液體發酵生產，建立了將菌劑從菌種到產品的工業化規模生產的相關工藝，實現了甲藻溶藻菌在水產養殖業的產業化應用；
(2)本發明針對發酵環節實行多次抽樣檢測，在保證發酵菌體保持甲藻溶藻性能的前提下，獲得高純度的發酵菌劑，並且菌劑僅對池塘優勢甲藻具有溶解專一性，對養殖對蝦和水體中的優良綠藻和硅藻無不良影響，可安全用於池塘養殖生產應用。
附圖說明
圖1是JZBC1菌劑在滅菌池塘水體的生長曲線。
具體實施方式
以下實施例用於闡明與實施本發明，屬於發明的保護範圍，本技術領域的普通技術人員根據以上公開的內容均可實現本發明的目的。
實施例1
菌劑的工業化液體發酵參數的確立
利用50L發酵罐系統平臺研究確立菌劑工業化液體發酵工藝參數。以蠟樣芽孢桿菌JZBC1的生長速率、芽孢形成率、發酵菌劑的溶藻效率為評估指標，建立和優化發酵參數。所獲得的相關發酵參數即可應用於50L-500L-5000L的逐級發酵系統平臺進行JZBC1菌株的工業化擴大發酵培養。
首先，利用單因素試驗方法，在基礎發酵培養基的基礎上，選取不同的碳源(蔗糖、葡萄糖+蔗糖、可溶性澱粉、糖蜜、玉米漿、麩皮、麩皮+糖蜜、可溶性澱粉+玉米漿)等量替代基礎培養基中的葡萄糖；再以不同的氮源(酵母膏、蛋白腖+酵母膏、硫酸銨、豆粕、大豆蛋白、豆粕+大豆蛋白)等量替代基礎培養基中的蛋白腖，分析不同種類的培養基配方對蠟樣芽孢桿菌JZBC1的影響，並結合工業化發酵生產的具體要求建立優化培養基配方。
其次，在單因素試驗的基礎上，將玉米漿(碳源)、大豆蛋白(氮源)、pH、接種量、轉速、溫度、裝液量等7個因素作為測試變量，測試次數設為12，進行參數優化分析。
結果表明，1L水中含有玉米漿18.5～24.5g、大豆蛋白12～20g、NaCl 0.8～1.5g、KH2PO4 0.15～0.4g、MgSO4 0.15～0.4g、CaCl2 0.1～0.3g、質量百分含量為3％的MnSO4溶液1mL時，尤其是在1L水中含有玉米漿20g，大豆蛋白13.5g，NaCl 1g，KH2PO4 0.2g，MgSO40.2g，CaCl2 0.1g，質量濃度3％的MnSO4溶液1mL時，發酵16～28h得到的菌濃度達到5.0×109cfu/mL～1010cfu/mL以上，芽孢獲得率90％～95％以上，以105cfu/mL的用菌濃度，錐狀斯氏藻(初始密度104cells/mL)5d內的死亡率達到90％以上。
表1-表3的結果表明，培養基最佳為：1L水中含有玉米漿20g、大豆蛋白13.5g、NaCl 1g、KH2PO4 0.2g、MgSO4 0.2g、CaCl2 0.1g，質量百分含量為3％的MnSO4溶液1mL。
表1不同碳源對蠟樣芽孢桿菌JZBC1的影響
表2不同氮源對蠟樣芽孢桿菌JZBC1的影響
表3不同因素的數量水平對蠟樣芽孢桿菌JZBC1的影響貢獻
實施例2
在廣州市花都區中國水產科學研究院南海水產研究所花都微生物工業發酵實驗工廠進行了蠟樣芽孢桿菌JZBC1工業化液體發酵生產應用，發酵系統為50L—500L—5000L的工業化液體發酵系統。
(1)蠟樣芽孢桿菌JZBC1菌種用營養肉湯培養基液體培養基進行活化製備種子液，pH6.00～7.50，200～240rpm，28～32℃恆溫振蕩培養20～30h。
(2)發酵培養基配方為在1L水中含有玉米漿20g，大豆蛋白13.5g，NaCl 1g，KH2PO40.2g，MgSO4 0.2g，CaCl2 0.1g，質量百分含量為3％的MnSO4溶液1mL，依照以上配方按70％的裝液量在發酵罐配製所需的培養基。
(3)開啟加熱設備對發酵罐進行滅菌(溫度121℃，時間18～24min)，待罐體冷卻至28～30℃，在50L發酵罐中接種合格的JZBC1種子液，種子液的接種體積佔發酵培養基總體積的3％，發酵條件設定為pH 7.0，溫度30℃，轉速500rpm，通氣量45L/min，發酵培養16～28h，對發酵液取樣進行顯微鏡檢測，菌量達到5.0×108cfu/mL～109cfu/mL以上，依照50L——500L——5000L的規模發酵流程，進行逐級擴大發酵，各級發酵的操作要求基本一致，5000L發酵罐的最終菌濃度為5.0×109cfu/mL～1010cfu/mL以上，芽孢獲得率95％以上。
(4)對5000L發酵罐的發酵液進行抽檢，以池塘優勢甲藻—錐狀斯氏藻為測試藻，藻液的初始藻細胞濃度設為1.0×104cell/mL，以105cfu/mL的菌濃度將菌體添加至藻液中，當錐狀斯氏藻5d內的死亡率達到90％以上時視為甲藻溶藻性能合格。
(5)將5000L發酵罐的發酵菌液去除多餘水分，按單機單次裝載量為3～6kg引入離心機，轉速設為10000～14000rpm，離心40～50min，獲得菌量超過1010cfu/mL的菌泥；菌泥和麩皮按質量比1:3～1:5的比例進行攪拌混勻，在63～75℃下用流化床乾燥，使得水分含量達到8％以下；最後以孔徑80～120目的規格用粉碎機進行粉碎，再按109個/g濃度用真空密封包裝。
(6)隨機抽取包裝好的菌劑產品，進行芽孢含量、菌體生長情況、甲藻溶藻功效等檢測，製劑中菌濃度達到5.0×109～1010cfu/mL以上，芽孢獲得率達到90～95％以上，以池塘優勢甲藻—錐狀斯氏藻為測試藻，藻液的初始藻細胞濃度設為1.0×104cell/mL，依照105cfu/mL的菌濃度將發酵菌體添加至藻液中，當錐狀斯氏藻5d內的死亡率達到90％以上時，視為合格產品，確保蠟樣芽孢桿菌JZBC1經過各項加工過程後仍然保持良好的生長性能和甲藻溶藻特性。
結果顯示，菌劑中的芽孢在滅菌池塘水體環境能萌發復活生長(圖1)。其次，在加入菌劑的微藻培養系統中，錐狀斯氏藻的藻細胞數量在第6天時減少了98.3％，而未加菌的對照組錐狀斯氏藻數量則增加了1.1倍；而在小環藻培養液中，加菌組的小環藻數量由4.7×105cell/mL下降到4.1×105cell/mL，僅減少了12.8％；加菌組的小球藻數量則由3.3×106cell/mL上升到2.9×107cell/mL，增加了7.8倍。可見，JZBC1菌在經過一系列發酵培養及後處理工藝製備成菌劑，它依然保持了對池塘優勢甲藻—錐狀斯氏藻的溶藻專一性，對綠藻和硅藻等有益微藻無明顯影響。
實施例3
與實施例2不同的是，發酵培養基的配方為：1L水中含有玉米漿18.5g、大豆蛋白0g、NaCl 0.8g、KH2PO4 0.4g、MgSO4 0.15g、CaCl2 0.3g、質量百分含量為3％的MnSO4溶液1mL。
實施例4
與實施例2不同的是，發酵培養基的配方為：1L水中含有玉米漿24.5g、大豆蛋白12g、NaCl 1.5g、KH2PO4 0.15g、MgSO4 0.4g、CaCl2 0.1g、質量百分含量為3％的MnSO4溶液1mL。
實施例5
以汕頭養殖實驗基地對蝦養殖初期的池塘水體為本底，利用純培養的錐狀斯氏藻、蛋白核小球藻、條紋小環藻的藻液，調配養殖水體的微藻群落結構，使得上述各種微藻細胞的初始濃度穩定在104cell/mL的數量水平。其中，加菌組JZBC1菌劑(實施例2製備獲得)的初始添加濃度設定為104cfu/mL～105cfu/mL，對照組養殖水體不施加JZBC1。自然條件下培養14d，各培養桶的水體容積為100L，每組設4個平行，培養過程中以充氣方式為水體增氧，光照強度2000～7800lx。每24h取樣以顯微鏡檢測水體中的錐狀斯氏藻、蛋白核小球藻、條紋小環藻的數量。結果表明，JZBC1加菌組2～3d內可令水體中的錐狀斯氏藻數量由初始的104cell/mL大幅減少至32～50，測試結束時水體中蛋白核小球藻的數量則明顯升高至106cell/mL～107cell/mL，條紋小環藻的數量無明顯變化，而對照組中的錐狀斯氏藻數量始終維持在104cell/mL～105cell/mL數量水平。可見，JZBC1可有效去除錐狀斯氏藻，促進水體形成以蛋白核小球藻、條紋小環藻等優良綠藻和硅藻為優勢的微藻環境。
表4測試結束時各試驗組的微藻數量 單位(cells/mL)
本發明不局限於上述特定的實施方案範圍內，上述實施方案僅僅是為了能夠對本發明的使用過程進行詳細地說明，而且有相等功能的生產方法和技術細節也屬於本發明內容的一部分。事實上，本領域技術人員根據前文的描述，就能夠根據各自需要找到不同的調整方案，這些調整都應在所附的權利要求書的範圍內。