用於受控的卵巢刺激的組合物的製作方法

2023-06-17 02:17:26 1

用於受控的卵巢刺激的組合物的製作方法
【專利摘要】本發明公開了包含FSH、例如重組FSH的製劑，其用於治療不孕。
【專利說明】用於受控的卵巢刺激的組合物[0001 ] 本發明涉及用於治療不孕的組合物和藥物產品。
[0002]輔助生殖技術(ART)技術如體外授精(IVF)是公知的。這些ART技術通常需要受控的卵巢刺激(COS)的步驟，其中一組卵泡被刺激至完全成熟。標準COS方案包括單獨施用促性腺激素類如促卵泡激素(FSH)或結合黃體生成激素(LH)活性以刺激卵泡發育，通常在刺激之前和/或期間施用GnRH類似物以防止未成熟的LH湧出。常用於COS的藥物組合物包括重組促卵泡激素(rFSH)，來源於尿的FSH，重組FSH+LH製劑，來源於尿的促卵泡激素(menotiOphin)[人絕經期促性腺激素(hMG)]和高度純化的人絕經期促性腺激素(HP-hMG)。IVF可以與嚴重時可能危及生命的卵巢過度刺激症候群(OHSS)的風險相關。
[0003]預測女性對受控的卵巢刺激(COS)的響應潛能的能力可以允許開發出個體化的COS方案。這可以例如降低在被預測為對刺激具有過度響應的女性中OHSS的風險，和/或改善被歸類為不良響應者的女性的妊娠結果。目前，抗米勒管激素(ant1-MilIIerianhormone) (AMH)的血清濃度被確定為卵巢儲備的可靠標記物。降低的AMH水平與COS期間降低的卵巢對促性腺激素的響應相關。此外，高的AMH水平是過度卵巢響應的良好預測物，並且是OHSS風險的指示物。
[0004]在進行ART的35歲以下女性的 初步研究中，使用CONSORT用藥算法(結合基礎FSH、BM1、年齡和AFC)來預測在處於發展OHSS的風險的女性中COS的最佳FSH起始劑量(Olivennes等，2009)。個性化劑量確實導致足夠的卵母細胞產量和良好的妊娠率。然而，由於不充分的響應，在低劑量組(75IU FSH)中存在高的取消比率，並且OHSS的確在顯著比例的患者中發生。
[0005]因此需要用於個體化COS方案的組合物，所述組合物提供對刺激的充分響應，和/或降低的OHSS風險。
[0006]如上所述，標準COS方案可以包括施用FSH。FSH是由腦垂腺前葉天然分泌的並且具有支持卵泡發育和排卵的功能。FSH包含對於其他糖蛋白激素LH和CG也是共有的92個胺基酸的α亞基，以及給予所述激素生物學特異性的僅FSH具有的111個胺基酸的β亞基(Pierce和Parsons, 1981)。各亞基通過添加複合碳水化合物殘基被翻譯後修飾。這兩個亞基都帶有用於N-連接聚糖結合的2個位點，α亞基位於胺基酸52和78處和β亞基位於氛基酸殘基 7 和 24 處(Rathnam 和 Saxena, 1975, Saxena 和 Rathnam, 1976)。FSH 因此被糖基化為約30質量%(Dias和Van Roey.2001.Fox等2001)。
[0007]多年來，純化自絕經期後人尿的FSH已被用於不孕治療；以促進自然生育中的排卵並且為輔助生殖技術提供卵母細胞。目前批准的用於卵巢刺激的重組FSH(rFSH)產品如促卵泡激素 a (follitropin alfa) (G0NAL-F, Merck Serono/EMD Serono)和促卵泡激素β (follitropin beta) (PUREG0N/F0LLISTIM,MSD/Schering-Plough)來源於中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系。目前，沒有市售的來源於人細胞系的rFSH產品。
[0008]存在與FSH製劑相關的相當的異質性，其與存在的多種同工型的量的差異有關。單獨的FSH同工型展示相同的胺基酸序列，但是區別在於其翻譯後修飾的程度；特別的同工型表徵為碳水化合物分支結構的異質性和唾液酸(末端糖)結合的不同的量，兩者都表現為影響具體同工型生物活性。
[0009]天然FSH的糖基化是高度複雜的。天然來源的垂體FSH中的聚糖可以包含各種各樣的結構，所述結構可以包括一 _，二 _，三-和四-觸角聚糖的組合(Pierce和Parsons,1981.Ryan等，1987.Baenziger和Green, 1988)。聚糖可以具有其他修飾:核巖藻糖基化，截開型(bisecting)葡糖胺，利用乙醯乳糖胺延伸的鏈，部分或完全唾液酸化，具有α2，3和α 2，6連接的唾液酸化，以及代替半乳糖的硫酸化的半乳糖胺(Dalpathado等,2006)。此外，聚糖結構在各糖基化位點處的分布之間存在差異。在來源於個體血清和來源於絕經期後女性的尿液的FSH中發現相當水平的聚糖複雜性(Wide等，2007)。
[0010]重組FSH產品的糖基化反映了存在於宿主細胞系中的糖基轉移酶的範圍。市售rFSH產品來源於改造的中國倉鼠卵巢細胞(CH0細胞)。來源於CHO細胞的rFSH中的聚糖修飾的範圍比在天然產品中發現的更有限。在來源於CHO細胞的rFSH中發現的降低的聚糖異質性的實例包括缺少截開型葡糖胺和減少的核巖藻糖基化和乙醯乳糖胺延伸的含量(Hard等，1990)。此外，CHO細胞僅能夠使用α 2，3連接添加唾液酸(Kagawa等，1988，Takeuchi等，1988, Svensson等，1990);來源於CHO細胞的rFSH僅包括α 2, 3_連接的唾液酸而不包括α 2，6-連接的唾液酸。
[0011]因此來源於CHO細胞的FSH不同於天然產生的FSH (例如人垂體/血清/尿FSH)，天然產生的FSH包含具有α2，3和α 2，6_連接的唾液酸的混合物的聚糖，其中前者佔多數。
[0012]此外，也已經證明，市售重組FSH製劑的FSH的量不同，並且當與垂體、血清或絕經期後尿FSH相比時，等電點(pi)在4以下(被認為是酸性同工型)(Ulloa-Aguirre等 1995)。與來源於 CHO 細胞的重組產品 Gonal-f (Merck Serono)和 Puregon(ScheringPlough)相比,尿製劑中酸性同工型的量高得多(Andersen等2004)。這必然反映了唾液酸在重組FSH中較低的摩爾含`量，因為在重組FSH中用硫酸鹽修飾的帶負電的聚糖的含量低。與天然FSH相比較低的唾液酸含量是兩種市售重組FSH產品的特徵並且可以反映製備過程中的限制。
[0013]已經記錄了來自多種來源的材料的FSH的循環壽命。這些材料中的一些已經基於總體分子電荷被分級，如由其Pi所表徵的，其中更高的酸性等於更高的負電荷。如前所述，總分子電荷的主要貢獻物是每個FSH分子的總唾液酸含量。例如，rFSH (Organon)的唾液酸含量為約8m0l/m0l，而來源於尿的FSH具有更高的唾液酸含量(de Leeuw等1996)。大鼠中相應的血漿清除率為0.34和0.14ml/min (Ulloa-Aguirre等2003)。在另一個實例中，其中重組FSH的樣品被分成高和低pi級分，高pi (較低唾液酸含量)級分的體內效能降低並且其具有較短的血漿半衰期(D』Antonio等1999)。也已經報導，在排卵周期的後期期間循環的較鹼性的FSH是由於由增加的雌二醇水平所致的垂體前葉中α 2，3唾液酸轉移酶的減量調節(Damian-Matsumara 等 1999.Ulloa-Aguirre 等 2001)。未報到 α 2，6 唾液酸轉移酶的結果。
[0014]因此，如上所述，使用CHO系統表達的重組蛋白在其末端唾液酸連接的類型方面將不同於其天然對應物。在藥用生物製品的製備中這是重要的考慮事項，因為碳水化合物部分可以有助於分子的藥理學屬性。
[0015]本 申請人:開發了人來源的重組FSH，其是作為W02009/127826A公布的國際專利申請號PCT/GB2009/000978的主題。具有α 2，3和α 2，6_連接的唾液酸兩者的混合物的重組FSH通過改造人細胞系以表達rFSH和α 2，3唾液酸轉移酶來製備。表達產物是高度酸性的並且具有α2，3_和α 2，6-連接的唾液酸兩者的混合物；後者由內源唾液酸轉移酶活性提供。發現，唾液酸連接的類型，α 2，3-或α 2，6_，可以顯著影響FSH的生物清除率。具有α2，3和α 2，6-連接的唾液酸兩者的混合物的重組FSH相比於在常規CHO細胞中表達的rFSH具有兩個優點:首先，由於兩種唾液酸轉移酶的組合的活性，材料被更加高度地唾液酸化；並且第二，材料更相似於天然FSH。與僅生產α 2，3連接的唾液酸的來源於CHO細胞的重組產品相比,在生物學上這可能是更適當的(Kagawa等，1988, Takeuchi等，1988, Svensson 等，1990)並且具有降低的唾液酸含量(Ulloa-Aguirre 等 1995, Andersen等 2004)。
[0016]在國際專利申請號PCT/GB2009/000978中公開的rFSH產品包含分支的聚糖部分。FSH包含聚糖(與FSH糖蛋白結合的)並且這些聚糖可以包含多種結構。如在本領域中公知的，可能發生(聚糖的)分支，其結果是聚糖可以具有1、2、3、4個以上的末端糖殘基或「觸角」；具有1、2、3或4個末端糖殘基或「觸角」的聚糖分別被稱為一-觸角，二 -觸角，三-觸角或四-觸角結構。聚糖可以具有存在於一-觸角和/或二-觸角和/或三-觸角和/或四-觸角結構上的唾液酸化。在國際專利申請號PCT/GB2009/000978中公開的實例rFSH包括單-唾液酸化的，二 -唾液酸化的，三-唾液酸化的和四-唾液酸化的聚糖結構，其相對量如下:9-15%單-唾液酸化的；27-30% 二一唾液酸化的；30-36%三一唾液酸化的和25-29%四一唾液酸化的。如公知的，單-唾液酸化的聚糖結構具有一個唾液酸殘基；二 -唾液酸化的聚糖結構具有兩個唾液酸殘基；三-唾液酸化的聚糖結構具有三個唾液酸殘基；並且四-唾液酸化的聚糖結構具有四個唾液酸殘基。本文中，術語如「X%單-唾液酸化的」，「X% 二 -唾液酸化的」，「X%三-唾液酸化的」或「X%四-唾液酸化的」是指表示為FSH上以任何方式被唾液酸化(具有唾液酸)的聚糖結構的總數的百分比(X%)的FSH上的(分別)一 _、二、三或四唾液酸化的聚糖結構的數量。因此，短語「30-36%三-唾液酸化的聚糖結構」是指，在FSH上具有唾液酸殘基(即，被唾液酸化的)的聚糖結構的總數中，這些聚糖結構中的30至36%是三唾液酸化的(具有三個唾液酸殘基)。 申請人:驚人地發現，與目前市場上的重組FSH產品相比，具有特定量的四-唾液酸化的聚糖結構的FSH(其不同於上述PCT/GB2009/000978中公開的示例rFSH產品)顯著更有效。 申請人:的產品的胺基酸序列是天然序列並且與天然人FSH和現有的來源於CHO的rFSH產品相同。然而，本 申請人:發現，當用於(例如個體化的)COS方案時，具有α2，3和α 2，6-連接的唾液酸兩者的混合物和/或特定量的四-唾液酸化的聚糖結構的人來源的重組FSH產品(即在人細胞系中生產或表達的、例如通過改造人細胞系製備的重組FSH)可以特別有效。
[0017]根據本發明，在第一方面中，提供這樣的產品(例如藥物組合物)，其包含促卵泡激素(FSH)並且用於治療患者(例如血清AMH水平為0.05pmol/L以上、例如0.5pmol/L以上的患者)的不孕，其中所述產品包含1-24 μ g、例如2-24 μ g、例如2至15 μ g人來源的重組FSH的劑量或等效劑量。優選地，所述產品包含4.5至12.5 μ g、例如5至12.5 μ g、例如6至12.5 μ g、例 如6.3至10.5 μ g人來源的重組FSH的劑量或等效劑量。
[0018]根據本發明，提供這樣的產品(例如藥物組合物)，其包含促卵泡激素(FSH)並且用於治療血清AMH水平<15pmol/L(例如0.05pmol/L至14.9pmol/L)的患者的不孕，其中所述產品包含9至14μ g、例如11至13μ g、例如12 μ g人來源的重組FSH的(例如每日)劑量或等效劑量。優選地，FSH是重組FSH( 「rFSH」或「recFSH」)。優選地，FSH是人細胞系來源的重組FSH。所述劑量提供有效響應同時最小化OHSS的風險。優選地，不孕的治療包括確定(例如測量)患者的血清AMH水平的步驟，和向血清AMH水平<15pmol/L(例如0.05pmol/L至14.9pmol/L)的患者施用所述劑量。
[0019]根據本發明，在另一個方面中，提供這樣的產品(例如藥物組合物)，其包含促卵泡激素(FSH)並且用於治療血清AMH水平≥15pmol/L的患者的不孕，其中所述產品包含5至12.5 μ g、例如6至10.5 μ g人來源的重組FSH的(例如每日)劑量或等效劑量。優選地，FSH是重組FSH( 「rFSH」或「recFSH」 )。優選地，FSH是人細胞系來源的重組FSH。所述劑量提供有效響應同時最小化OHSS的風險。優選地，不孕的治療包括確定(例如測量)患者的血清AMH水平的步驟，和向血清AMH水平> 15pmol/L的患者施用所述劑量。在一個實施方案中，所述產品用於治療血清AMH水平為15至24.9pmol/L的患者的不孕，並且所述產品以5至12 μ g、 例如7至12 μ g、例如8.7至10 μ g人來源的重組FSH (優選地，9至10 μ g人來源的重組FSH)的(例如每日)劑量或等效劑量施用。在該實施方案中，不孕的治療可以包括確定(例如測量)患者的血清AMH水平的步驟，和向血清AMH水平為15至24.9pmol/L的患者施用所述劑量。在另一個實施方案中，所述產品用於治療血清AMH水平為25至34.9pmol/L的患者的不孕，並且所述產品以5至12 μ g、例如6至9 μ g、例如7至8 μ g人來源的重組FSH(優選地7.3至Syg人來源的重組FSH)的(例如每日)劑量或等效劑量施用。在該實施方案中，不孕的治療可以包括確定(例如測量)患者的血清AMH水平的步驟，和向血清AMH水平為25至34.9pmol/L的患者施用所述劑量。在另一個實施方案中，所述產品用於治療血清AMH水平≥35pmol/L的患者的不孕，並且所述產品以5至11μ g、例如6.3至7 μ g人來源的重組FSH (優選地6至7 μ g人來源的重組FSH)的(例如每日)劑量或等效劑量施用。在該實施方案中，不孕的治療可以包括確定(例如測量)患者的血清AMH水平的步驟，和向血清AMH水平≥35pmol/L的患者施用所述劑量。
[0020]在患者的(受試者的)第一刺激方案中，以上劑量可以用於治療不孕。要理解，對於進一步的刺激周期，可以根據第一周期中的實際卵巢響應來調整劑量。
[0021] 申請人:發現，為了能夠選擇兩個高品質卵母細胞用於轉移，通常需要在九個卵母細胞的區域中提取。
[0022] 申請人:發現,對於具有低AMH(AMH〈15pmol/L每升)的受試者,需要相當高劑量的重組FSH(例如12 μ g)以實現此。以此劑量，從60%的具有低AMH的受試者將提取8至14個卵母細胞。相對於用150IU Gonal-f治療的具有低AMH的受試者的治療(其中僅從33%的受試者提取了 8至14個卵母細胞)，這是出乎意料的和顯著的進步。 申請人:發現，不需要根據患者體重來調整該劑量。 [0023]然而，60%的人口(並且因不孕而接收治療的30歲以下女性中的80%)具有高AMH (即，AMH≥15pmol/L)。對於這些受試者，通常十分容易提取平均9至11個卵母細胞；刺激方案的問題在於OHSS的風險。 申請人:發現，在以低劑量的人重組FSH用藥的患者中，在提取的卵母細胞和受試者體重之間存在關係。這表明，可能存在與以固定劑量的FSH進行治療相關的風險(這在現有技術中是常見的)。本 申請人:在FSH劑量和AMH水平以及受試者體重之間建立了關係，與已知的治療方案相比，這提供了改善的安全性特徵(降低的OHSS的風險)以及可接受的或提高的卵母細胞提取(見實施例10)。
[0024]根據本發明，在另一個方面中，提供這樣的產品(例如藥物組合物)，其包含促卵泡激素(FSH)並且用於治療血清AMH水平≤15pmol/L的患者的不孕，其中所述產品以0.09至0.19 μ g (例如0.09至0.17 μ g)人來源的重組FSH/kg患者體重的(例如每日)劑量或等效劑量施用。優選地，不孕的治療包括確定(例如測量)患者的血清AMH水平的步驟，和向血清AMH水平≤15pmol/L的患者施用所述劑量。在一個實施方案中，所述產品用於治療血清AMH水平為15至24.9pmol/L的患者的不孕，並且所述產品以0.14至0.19 μ g人來源的重組FSH (優選地0.15至0.16 μ g人來源的重組FSH) /kg患者體重的(例如每日)劑量或等效劑量施用。在該實施方案中，不孕的治療可以包括確定(例如測量)患者的血清AMH水平的步驟，和向血清AMH水平為15至24.9pmol/L的患者施用所述劑量。在另一個實施方案中，所述產品用於治療血清AMH水平為25至34.9pmol/L的患者的不孕，並且所述產品以0.11至0.14 μ g人來源的重組FSH (優選地，0.12至0.13 μ g人來源的重組FSH)/kg患者體重的(例如每日)劑量或等效劑量施用。在該實施方案中，不孕的治療可以包括確定(例如測量)患者的血清AMH水平的步驟，和向血清AMH水平為25至34.9pmol/L的患者施用所述劑量。在另一個實施方案中，所述產品用於治療血清AMH水平≤35pmol/L的患者的不孕，並且所述產品以0.10至0.1lyg人來源的重組FSH/kg患者體重的(例如每日)劑量或等效劑量施用。在該實施方案中，不孕的治療可以包括確定(例如測量)患者的血清AMH水平的步驟，和向血清AMH水平> 35pmol/L的患者施用所述劑量。優選地，FSH是重組FSH ( 「rFSH」或「recFSH」)。優選地，FSH是人細胞系來源的重組FSH。所述劑量提供有效響應同時最小化OHSS的風險。
[0025]在患者的(受試者的)第一刺激方案中，以上劑量可以用於治療不孕。要理解，對於進一步的刺激周期，可以根據第一周期中的實際卵巢響應來調整劑量。
[0026]根據本發明，在另一方面中，提供這樣的產品(例如藥物組合物)，其包含促卵泡激素(FSH)並且用於治療血清AMH水平<15pmol/L的患者的不孕，其中所述產品以0.15至0.21 μ g(例如0.19至0.21 yg)人來源的重組FSH/kg患者體重的(例如每日)劑量或等效劑量施用。優選地，不孕的治療包括確定(例如測量)患者的血清AMH水平的步驟，和向血清AMH水平<15pmol/L的患者施用所述劑量。然而，不需要依體重給血清AMH水平<15pmol/L的患者用藥。要理解，使用本領域中公知的轉換，這些劑量可以被容易地轉換從而在根據其BMI用藥的情況下治療患者。
[0027]所述產品(例如藥物組合物)可以用於治療血清AMH為5.0-14.9pmol/L的患者的不孕，其中所述產品包含6至18μ g，例如8至11 μ g，例如8.5至10.2μ g人來源的重組FSH的劑量或等效劑量。所述產品可以用於治療血清AMH為15.0-29.9pmol/L的患者的不孕，其中所述產品包含4.8至15 μ g，例如6至9 μ g，例如6.8至8.5 μ g人來源的重組FSH的劑量或等效劑量。所述產品可以用於治療血清AMH為30-44.9pmol/L的患者的不孕，其中所述產品包含3.6至12 μ g，例如4至7 μ g，例如5.1至6.8 μ g人來源的重組FSH的劑量或等效劑量。所述產品可以用於治療血清AMH為45pmol/L以上的患者的不孕，其中所述產品包含2至9 μ g，例如2.4至9 μ g (例如3.4至5.1yg)或2至5yg人來源的重組FSH的劑量或等效劑量。所述產品可以包括促卵泡激素(FSH)並用於治療血清AMH為5pmol/L以下的患者的不孕，其中所述產品包含7.2至24 μ g，例如10至15 μ g例如10.2至13.6μ g人來源的重組FSH的劑量或等效劑量。所述產品可以用於治療患者的不孕，其中所述產品包含4.8至18 μ g、例如6至11 μ g、例如6.8至10.2 μ g人來源的重組FSH的劑量或等效劑量。優選地，FSH是重組FSH( 「rFSH」或「recFSH」 )。優選地，FSH是人細胞系來源的重組 FSH。
[0028]優選地，rFSH(例如人細胞系來源的重組FSH)包括α 2，3_和α 2，6_唾液酸化。根據本發明使用的FSH(rFSH)具有的總唾液酸化中的1%至99%可以是α 2，3-唾液酸化。根據本發明的FSH (rFSH)具有的總唾液酸化中的1%至99%可以是α 2，6-唾液酸化。優選地，總唾液酸化中的50至70%，例如60至69%，例如約65%，是α 2，3-唾液酸化。優選地，總唾液酸化中的25至50%，例如30至50%，例如31至38%，例如約35%，是α 2，6-唾液酸化。
[0029]優選地，rFSH(例如人細胞系來源的重組FSH)包括一 _，二 _，三-和四-唾液酸化的聚糖結構，其中唾液酸化的聚糖結構中的15-24%，例如17-23%是四唾液酸化的聚糖結構(例如如對帶電荷的聚糖的WAX分析所示,如在以下實施例中所述)。FSH包含聚糖(與FSH糖蛋白結合的)。公知的是，FSH中的聚糖可以包括各種結構。這些可以包括一、二、三和四-觸角聚糖的組合。本文中，術語如「X%的唾液酸化的聚糖結構是四唾液酸化的聚糖結構」是指FSH上被四唾液酸化的，即具有四個唾液酸殘基的聚糖結構的數目，其被表示為FSH上以任意方式被唾液酸化(具有唾液酸)的聚糖結構的總數的百分比(X%)。因此，短語「15-24%的唾液酸化的聚糖結構是四唾液酸化的聚糖結構」表示，在FSH上具有唾液酸殘基(即，被唾液酸化)的聚糖結構的總數中，這些聚糖結構中的15至24%被四唾液酸化(具有四個唾液酸殘基)。
[0030]rFSH可以作為單一同工型或同工型的混合物存在。
[0031] 申請人:設計了 「個體化」 COS方案，其中使用具有特定性質的特定劑量的重組FSH基於患者的特定AMH水平來治療所述患者，由此增加對刺激的適當響應的可能性(例如在具有低響應潛力的患者中)，`和/或降低OHSS的風險(例如在被歸類為高或過度響應者的患者中)。
[0032]血清AMH水平可以通過本領域中已知的任何方法確定(例如測量)。優選地，血清AMH水平使用AMH Gen-1I酶聯免疫吸附測定試劑盒(BeckmanCoulter, Inc., Webster, Texas)來測量。該測定可以檢測大於0.57pmol/L的AMH濃度,定量的最低限為1.lpmol/L。可以使用其他測定。
[0033]本文中，血清AMH值通常以pmol/L為單位列舉。使用換算公式lng/mlAMH=7.lpmol/L AMH 可以將此換算為 ng/mL。
[0034]本文中，術語「患者」和「受試者」可互換地使用。
[0035]產品(例如藥物組合物)優選地包含上文中以及在權利要求中限定的量的人來源的rFSH的日劑量或等效日劑量。(日)劑量可以是初始劑量(即在治療期間，其可以被減小、增大或保持)。
[0036]產品(例如藥物組合物)可以用於在治療第一天開始並且持續七至十三天、例如九至十三天、例如10至13天、例如10至11天的FSH(每日)施用。產品(例如藥物組合物)可以用於在GnRH激動劑(例如Synarel, Lupron,Decapeptyl)施用後(例如施用開始後,例如每日施用開始後)後施用12至16、例如13至15、例如14天。產品(例如藥物組合物)可以用於與GnRH激動劑一起施用。產品(例如藥物組合物)可以用於在GnRH拮抗劑(例如加尼瑞克(ganirelix)、西曲瑞利克斯(cetrorelix))施用前施用,例如在施用GnRH拮抗劑前五或六天施用。產品(例如藥物組合物)可以用於與GnRH拮抗劑一起施用。優選地，產品(例如藥物組合物)用於在施用高(排卵的)劑量的hCG(例如4，000至11，OOOIUhCG，例如5，000IU hCG，10，000IU hCG等；或150至350微克重組hCG，例如250微克重組hCG)前施用以誘發最終的卵泡成熟。
[0037]要理解，所述產品可以以超過(或不到)每日的頻率給藥，在所述情況中，相應劑量將相當於本文中規定的(日)劑量。
[0038]本文中，術語「不孕的治療」包括通過受控的卵巢刺激(COS)治療不孕或包括受控的卵巢刺激(COS)的步驟或階段的方法，例如子宮內授精(In)，體外授精(IVF)，或胞質內精子注射(ICSI)。術語「不孕的治療」包括通過排卵誘導(OI)或通過包括排卵誘導(OI)的步驟或階段的方法治療不孕。術語「治療不孕」包括治療患有輸卵管不孕或無法解釋的不孕的受試者的不孕，包括治療具有子宮內膜異位(endometriosis)、例如I期或II期子宮內膜異位的受試者的 不孕，和/或具有無卵性不孕、例如WHO II型無卵性不孕的受試者的不孕，和/或具有患有男性因素不孕的伴侶的受試者的不孕。所述產品(或組合物)可以用於(使用於)具有子宮內膜異位的受試者中的、例如具有I期或II期子宮內膜異位的受試者中的不孕的治療(和/或用於受控的卵巢刺激)，所述I期或II期子宮內膜異位如美國生殖醫學學會(ASRM)用於子宮內膜異位的不同階段的分類系統所定義(IV期:最嚴重；I期:最不嚴重)[美國生殖醫學學會.修訂的美國生殖醫學學會子宮內膜異位分類:1996.Fertil Sterill997;67，817821.]。
[0039]所述產品(組合物)可以用於(使用於)處於早期卵泡期中的、具有I至16IU/L、例如I至12IU/L的正常血清FSH水平的受試者中的不孕的治療(和/或受控的卵巢刺激)。
[0040]所述產品(組合物)可以用於(使用於)年齡為18至42歲、例如25至37歲的受試者中的不孕的治療(和/或受控的卵巢刺激)。所述產品可以用於(使用於)BMI>1且BMI18 且 BMI〈25kg/m2 的受試者、例如 BMI>20 且 BMI〈25kg/m2的受試者中的不孕的治療(和/或受控的卵巢刺激)。
[0041]rFSH可以優選地包含27_33%、例如30_32%三-唾液酸化的聚糖結構。rFSH可以優選地包含24-33%、例如26-30% 二-唾液酸化的聚糖結構。rFSH可以優選地包含12_21%、例如15-17%單-唾液酸化的聚糖結構。rFSH優選地包含具有如下的相對量的單_唾液酸化的，二 -唾液酸化的，三-唾液酸化的和四-唾液酸化的聚糖結構:15至17%單-唾液酸化的；26-30% 二 —唾液酸化的；27-33%(例如29至32%，例如30-32%，例如30至31%)三一唾液酸化的和17-23%四一唾液酸化的(例如如對帶電荷的聚糖的WAX分析所示的，如實施例中所述的)。rFSH可以包含O至7%、例如0.1至7%、例如3至6%、例如5至6%中性唾液酸化的結構。FSH包含聚糖(與FSH糖蛋白結合的)。本文中，術語如「X%單-唾液酸化的」，「X% 二 -唾液酸化的」，「X%三-唾液酸化的」或「X%四-唾液酸化的」是指FSH上(分別)被一 _、二、三或四唾液酸化的聚糖結構的數目，其被表示為FSH上以任意方式被唾液酸化(具有唾液酸)的聚糖結構的總數的百分比(X%)。因此，短語「27-33%三-唾液酸化的聚糖結構」是指在FSH上具有唾液酸殘基(即，唾液酸化)的聚糖結構的總數中，這些聚糖結構中的27至33%是三唾液酸化的(具有三個唾液酸殘基)。[0042]rFSH具有的唾液酸含量[以唾液酸的摩爾量與蛋白的摩爾量的比表示]可以為6mol/mol 以上，例如 6mol/mol 至 15mol/mol,例如 8mol/mol 至 14mol/mol,例如 10mol/mol至 14mol/mol,例如 llmol/mol 至 14mol/mol,例如 12mol/mol 至 14mol/mol,例如 12mol/mol至13mol/mol。rFSH可以產生或表達在人細胞系中。
[0043]根據本發明使用的FSH(rFSH)具有的總唾液酸化中的1%至99%可以為α 2，3_唾液酸化。rFSH具有的總唾液酸化中的10%以上可以為α 2，3-唾液酸化。例如，總唾液酸化中的20、30、40、50、60、70、80或90%以上可以為α 2，3-唾液酸化。優選地，rFSH包含的α 2，3-唾液酸化的量可以為總唾液酸化的50至70%，例如總唾液酸化的60至69%，例如總唾液酸化的63至67%，例如約65%。根據本發明使用的FSH(rFSH)具有的總唾液酸化中的1%至99%可以為α 2，6-唾液酸化。本發明的rFSH(或rFSH製劑)具有的總唾液酸化中的5%以上、例如5%至99%可以為α 2，6_唾液酸化。rFSH具有的總唾液酸化中的50%以下可以為α 2，6-唾液酸化。優選地，rFSH包含的α 2，6_唾液酸化的量可以為總唾液酸化的25至50%，例如總唾液酸化的30至50%，例如總唾液酸化的31至38%、例如約35%。唾液酸化是指存在於FSH碳水化合物結構上的唾液酸殘基的量。α 2，3-唾液酸化是指2，3位處的唾液酸化(如本領域中公知的)並且α 2，6唾液酸化位於2，6位處(也是本領域中公知的)。因此，「總唾液酸化中的％可以為α 2，3唾液酸化」是指存在於FSH中的在2，3位被唾液酸化的唾液酸殘基的總數的％。術語「總唾液酸化中的％為α 2，6-唾液酸化」是指存在於FSH中的在2，6位被唾液酸化的唾液酸殘基的總數的％。
[0044]按質量計，rFSH可具有的唾液酸含量(唾液酸化的量/FSH分子)可以為(基於蛋白質量而不是蛋白加碳水化合物的質量)6%以上(例如6%至15%，例如7%至13%，例如8%至12%,例如11%至15%,例如12%至14%)。
[0045]rFSH可以為rFSH或rFSH製劑，其中16%以下(例如0.1至16%)的聚糖包含(例如具有)截開型N-乙醯葡糖胺(截開型GIcNAc或bisGlcNAc)。優選地，rFSH(或rFSH製劑)是rFSH或rFSH製劑，其中8至14.5%的聚糖包含(例如具有)截開型N-乙醯葡糖胺(截開型 GlcNAc 或 bisGlcNAc)。
[0046]要理解，FSH包含與FSH糖蛋白結合的聚糖。也要理解，100%的聚糖是指或表示與FSH糖蛋白結合的所有聚糖。因此，本文中，術語「8至14.5%的聚糖包含(具有)截開型N-乙醯葡糖胺」是指與FSH糖蛋白結合的聚糖的總數中的8至14.5%包含/具有截開型N-乙醯葡糖胺；「16%以下的聚糖包含(具有)截開型N-乙醯葡糖胺」是指與FSH糖蛋白結合的聚糖的總數中的16%以下包含/具有截開型N-乙醯葡糖胺，等等。
[0047] 申請人:發現，其中16%以下(例如8至14.5%)的包含在FSH糖蛋白中的聚糖具有截開型GlcNac的重組FSH(rFSH製劑；rFSH組合物)可以具有有利的藥代動力學性質。據信，產生有利性質的原因是具有截開型GlcNac的聚糖的量與在來源於人尿的產品Bravelle中的類似，其遠少於其他重組FSH製劑如在W02012/017058中公開的那些的。
[0048]rFSH(或rFSH製劑)可以是這樣的rFSH或rFSH製劑，其中20%以上的聚糖包含(例如具有)N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)，例如其中20%以上的聚糖包含(例如具有)末端GalNAc。優選地rFSH(或rFSH製劑)是這樣的FSH或FSH製劑，其中40至55%、例如42%至52%的聚糖包含(例如具有)GalNAc。優選地，rFSH(或rFSH製劑)是這樣的FSH或FSH製劑，其中40至55%、例如42%至52%的聚糖包含(例如具有)末端GalNAc0[0049]要理解，FSH包含與FSH糖蛋白結合的聚糖。也要理解，100%的聚糖是指或表示所有與FSH糖蛋白結合的聚糖。因此，本文中，術語「其中20%以上的聚糖包含(例如具有)GalNAc」是指與FSH糖蛋白結合的聚糖的總數的20%以上包含/具有N-乙醯半乳糖胺(GalNAc) ;「40至55%，例如42%至52%的聚糖包含(例如具有)末端GalNAc」是指與FSH糖蛋白結合的聚糖總數的40至55%、例如42%至52%包含/具有末端GalNAc，等等。
[0050]看起來，與僅具有可用的α2，3_連接的來源於CHO細胞的產品相比，α 2，6_連接的可用性增加了四唾液酸化的結構的數目。 申請人:還發現，由於糖組成，它們的rFSH區別於其他批准的產品:其包含或可以包含特定量的GalNac。這可以與四唾液酸化和效力聯繫，因為2，6-唾液酸化與GalNac相關。換言之，本 申請人:開發了這樣的rFSH產品，其具有特殊性質(2，6-接頭位點，GalNac)，所述特殊性質給rFSH提供高度的唾液酸化，這表現為在體內導致提高的效力。
[0051]rFSH(或rFSH製劑)可以具有16至24%的包含(例如末端)I巖藻糖-lewis的聚糖，例如16.5至18%的包含(例如末端)I巖藻糖-lewis的聚糖。rFSH(或rFSH製劑)可以具有1.5至4.5%，例如2至4%，例如3.7%的包含(例如末端)2巖藻糖-lewis的聚糖。巖藻糖-lewis的含量可能對效力有影響。
[0052]可以在人細胞系，例如Per.C6細胞系，HEK293細胞系，HT1080細胞系等中生產或表達rFSH。這可以簡化製備方法(並且使其更有效)，因為與已知方法相比，操縱和控制例如細胞生長培養基以保持唾液酸化可以不是那麼關鍵。所述方法還可以更有效，因為與已知rFSH產品的生產相比，幾乎不產生鹼性的rFSH ;產生更為酸性的rFSH並且鹼性FSH的
分離/去除較少有問題。 可以在PER.C6?細胞系、來源於PER.C6?的細胞系或修飾的PER.C6?細胞系中產生或表達rFSH。在人細胞系(例如PER.C6?細胞系、HEK293細胞系、HT1080細胞系等)中生產或表達的rFSH將包含一些由[所述細胞系的]內源唾液酸轉移酶活性提供的α 2，6-連接的唾液酸(α 2，6唾液酸化)並且將包含一些由內源唾液酸轉移酶活性提供的α 2，3-連接的唾液酸(α 2，3唾液酸化)。可以使用α 2，3_唾液酸轉移酶修飾所述細胞系。可以使用α 2，6-唾液酸轉移酶修飾所述細胞系。備選地或另外地，rFSH可以包含由[所述細胞系的]內源唾液酸轉移酶活性提供的α 2，6-連接的唾液酸(α 2，6唾液酸化)。本文中，術語「人來源的重組FSH」是指在人細胞系中生產或表達的重組FSH (例如通過改造人細胞系製備的重組FSH)。
[0053]可以使用α 2，3-和/或α 2，6-唾液酸轉移酶生產rFSH。在實例中，使用α2，3_唾液酸轉移酶生產rFSH。rFSH可以包含由內源唾液酸轉移酶活性提供的α 2，6-連接的唾液酸(α 2，6唾液酸化)。
[0054]所述產品可以是藥物組合物。所述藥物組合物用於治療不孕。不孕的治療可以包括輔助生殖技術(ART)，排卵誘導或子宮內授精(ΙΠ)。例如，在使用已知FSH製劑的醫學適應證中可以使用藥物組合物。
[0055]可以將所述產品或組合物配製為用於任何藥物施用途徑的眾所周知的組合物，所述藥物施用途徑例如口服、直腸、腸胃外、透皮(例如，貼片技術)、靜脈內、肌內、皮下、intrasusternal、陰道內、腹膜內、局部(粉末、藥膏或滴劑)或作為頰含或鼻噴霧劑。典型的組合物包含藥用載體，如水溶液、非毒性賦形劑，包括鹽和防腐劑，緩衝劑等，如特別在雷明頓藥物科學(Matt出版公司，1975)第15版，在1405-1412和1461 - 87頁中，以及在國家藥典(national formulary)XIV 第十四版(美國藥物協會(American PharmaceuticalAssociation), 1975)中所述。
[0056]適合的水性和非水性藥物載體、稀釋劑、溶劑或賦形劑的實例包括水、乙醇、多元醇(如甘油，丙二醇，聚乙二醇，等)，羧甲基纖維素及其適合的混合物，植物油(如橄欖油)，和可注射的有機酯如油酸乙酯。本發明的組合物還可以包含添加劑如，但不限於防腐劑、溼潤劑、乳化劑、表面活性劑和分散劑。可以包含抗細菌劑和抗真菌劑以防止微生物的生長，並且包括，例如間甲酚、苄醇、對羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。如果包含防腐劑，則苄醇、苯酚和/或間甲酚是優選的；然而，防腐劑決不限於這些實例。此外，包含等張劑如糖、氯化鈉等可能是需要的。所述產品或組合物還可以包含鹽，所述鹽包含選自由Na+-或K+-鹽或其組合組成的組的藥用鹼金屬陽離子。優選地，鹽是Na+-鹽，例如NaCl或Na2SO4O
[0057]優選地，所述產品或組合物包含:重組FSH ;和聚山梨醇酯20，L-甲硫氨酸，苯酚，硫酸二鈉和磷酸鈉緩衝液中的一種或多種。
[0058]在一些情形中，為了實現延長的作用，需要延緩自皮下或肌內注射的FSH(和其它活性成分，如果存在的話)的吸收。這可以通過使用具有較差水溶性的結晶或無定形物質的液體混懸液來實現。FSH吸收的速率於是取決於其溶出速率，其又可以取決於晶體大小和晶型。備選地，腸胃外施用的FSH組合形式的延緩吸收通過將所述FSH組合溶解或懸浮在油賦形劑中實現。可注射長效製劑形式可以通過在可生物降解的聚合物如聚交酯-聚乙交酯中形成FSH(和其它藥劑，如果存在的話)的微膠囊基質來進行製備。取決於FSH與聚合物的比率以及所用的特 定聚合物的性質，可以控制FSH釋放的速率。其它可生物降解的聚合物的實例包括聚乙烯吡咯烷酮，聚(原酸酯)，聚(酐)等。可注射的長效製劑也通過將FSH包埋在脂質體或微乳中進行製備，所述脂質體或微乳可與體組織相容。
[0059]可注射製劑可以例如通過經過留住細菌(bacterial-retaining)的濾器進行過濾，或通過摻入無菌固體組合物形式的滅菌劑來進行滅菌，所述無菌固體組合物可以溶解或分散在無菌水或其它無菌可注射介質中，之後立即使用。可以將可注射製劑在任何適合的容器中提供，所述容器例如瓶子、預先填充的注射器、注射藥筒等。
[0060]產品或組合物可以被配製成用於單次使用或多次使用(多劑量)。如果產品或組合物被製備成用於多次使用，則優選的是包含防腐劑。如果包含防腐劑，則苄醇、苯酚和/或間甲酚是優選的；然而，防腐劑絕不限於這些實例。單次使用或多次使用配製的產品或組合物還可以包含鹽，所述鹽包含選自由Na+-或K+-鹽或其組合組成的組的藥用鹼金屬陽離子。優選地，鹽是Na+-鹽，例如NaCl或Na2SO4。
[0061]所述產品或組合物可以被包含在容器如小瓶、預先填充的藥筒(例如用於單次施用或多次使用的)或注射設備如用於例如施用多劑量的「筆」。
[0062]所述產品或組合物可以是這樣的製劑(例如可注射製劑)，其包含FSH(任選具有hCG、LH、LH活性等)。LH活性，如果存在，可以源自LH或人絨毛膜促性腺素hCG。如果存在超過一種活性成分(即FSH和例如hCG或LH)，則這些可以適合於單獨施用或一起施用。如果單獨施用，施用可以是連續的。所述產品可以在任何合適的包裝中被供應。例如，產品可以包含多個容器(例如預填充的注射器或小瓶)，所述容器含有FSH或hCG或FSH和hCG兩者的組合。hCG可以是重組hCG或尿hCG。如果產品包括含有FSH、例如重組FSH的多個容器(例如預填充的注射器或小瓶)，則每個容器可以包含相同量的FSH。一個以上的容器可以包含不同量的FSH。注射器或小瓶可以被包裝在泡罩包裝或其他裝置中以保持無菌。任何產品可以任選地包含使用FSH(和例如hCG(如果存在的話))製劑的使用說明。根據本領域中的常規實踐調整藥物組合物中各種成分的PH和確切濃度。見GOODMAN和GILMAN’sTHE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICES (治療劑的藥學基礎)，第 7 版。在優選的實施方案中，本發明的組合物作為用於腸胃外施用的組合物供應。製備腸胃外製劑的一般方法是本領域中已知的並且在REMINGTON; THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (雷明頓:藥物科學和實踐)，上文，第780-820頁中描述。腸胃外組合物可以以液體製劑或作為固體供應，所述固體與無菌可注射介質混合，之後立即施用。在尤其優選的實施方案中，腸胃外組合物以易於施用和劑量均一的劑量單位形式供應。
[0063]根據 本發明，在另一個方面中，提供治療不孕的方法，所述方法包括:(a)測量受試者的血清AMH水平；和(b)向所述受試者施用1-24 μ g、例如2-24 μ g、例如2至15 μ g人來源的重組FSH的劑量或等效劑量。優選地，所述劑量為或等效於4.5至12.5 μ g，例如5至12.5 μ g，例如6至12.5 μ g，例如6.3至12 μ g人來源的重組FSH。
[0064]根據本發明，在另一個方面中，提供治療不孕的方法，所述方法包括:(a)確定(例如測量)受試者的血清AMH水平；和(b)向血清AMH水平<15pmol/L (例如0.05pmol/L至14.9pmol/L)的受試者施用9至14 μ g，例如11至13 μ g，例如12 μ g人來源的重組促卵泡激素(FSH)的(例如每日)劑量或等效劑量。優選地，FSH是重組FSH(「rFSH」或「recFSH」)。優選地，FSH是人細胞系來源的重組FSH。所述劑量提供有效響應同時最小化OHSS的風險。
[0065]根據本發明，在另一個方面中，提供治療不孕的方法，所述方法包括:(a)確定(例如測量)受試者的血清AMH水平；和(b)向血清AMH水平≥15pmol/L的受試者施用5至
12.5yg人來源的重組促卵泡激素(FSH)的(例如每日)劑量或等效劑量。(例如每日)劑量可以為或等效於6至IOyg人來源的重組促卵泡激素(FSH)。優選地，FSH是重組FSH ( 「rFSH」或「recFSH」)。優選地，FSH是人細胞系來源的重組FSH。所述劑量提供有效響應同時最小化OHSS的風險。
[0066]在一個實施方案中，所述方法包括向血清AMH水平為15至24.9pmol/L的受試者施用5至12 μ g，例如7至12 μ g，例如8.7至10 μ g人來源的重組FSH (優選地9至10 μ g人來源的重組FSH)的(例如每日)劑量或等效劑量的步驟。在另一個實施方案中，所述方法包括向血清AMH水平為25至34.9pmol/L的受試者施用5至12 μ g人來源的重組FSH (例如7至12 μ g，例如6至9 μ g，例如7至8 μ g，例如7.3至8 μ g人來源的重組FSH)的(例如每日)劑量或等效劑量的步驟。在另一個實施方案中，所述方法包括向血清AMH水平≥35pmol/L的受試者施用5至11 μ g人來源的重組FSH (例如6至7 μ g，例如6.3至7 μ g人來源的重組FSH)的(例如每日)劑量或等效劑量的步驟。
[0067]根據本發明，在另一個方面中，提供治療不孕的方法，所述方法包括:(a)確定(例如測量)受試者的血清AMH水平；和(b)施用0.09 M0.19 μ g (例如0.09至0.17 μ g)人來源的重組FSH/kg受試者體重的(例如每日)劑量或等效劑量，其中所述受試者的血清AMH水平≥15pmol/L0優選地，FSH是重組FSH ( 「rFSH」或「recFSH」 )。優選地，FSH是人細胞系來源的重組FSH。所述劑量提供有效響應同時最小化OHSS的風險。
[0068]在一個實施方案中，所述方法包括施用0.14至0.19 μ g人來源的重組FSH (優選地,0.15至0.16 μ g人來源的重組FSH)/kg受試者體重的(例如每日)劑量或等效劑量的步驟，所述受試者的血清AMH水平為15至24.9pmol/L。在另一個實施方案中，所述方法包括施用0.11至0.14 μ g人來源的重組FSH (優選地，0.12至0.13 μ g人來源的重組FSH) /kg受試者體重的(例如每日)劑量或等效劑量的步驟，所述受試者的血清AMH水平為25至34.9pmol/Lo在另一個實施方案中，所述方法包括施用0.10至0.11 μ g人來源的重組FSH/kg受試者體重的(例如每日)劑量或等效劑量的步驟，所述受試者的血清AMH水平≤35pmol/L。優選地，FSH是重組FSH ( 「rFSH」或「recFSH」)。優選地，FSH是人細胞系來源的重組FSH。這些劑量提供有效響應同時最小化OHSS的風險。
[0069]根據本發明，在另一個方面中，提供治療不孕的方法，所述方法包括:(a)確定(例如測量)受試者的血清AMH水平；和(b)施用0.15至OJlyg(例如0.19至OJlyg)人來源的重組FSH/kg受試者體重的(例如每日)劑量或等效劑量，其中所述受試者的血清AMH水平〈15pmol/L。
[0070]所述施用優選地包含以上及權利要求中限定的FSH的量的日劑量或等效日劑量。(日)劑量可以是初始劑量(其在治療期間可以被降低、升高或保持)。
[0071]所述方法可以是在患者的(受試者的)第一刺激方案中的治療不孕的方法。要理解，對於進一步的刺激周期，可以根據第一周期中的實際卵巢響應調整所述劑量。
[0072]根據本發明，在另一個方面中，提供治療不孕的方法，所述方法包括:(a)確定(例如測量)受試者的血清AMH水平；
[0073]和(b)如果受試者的血清AMH 水平 <15pmol/L (例如 0.05pmol/L 至 14.9pmol/L),則向所述受試者施用10至14 μ g、例如11至13 μ g、例如12 μ g人來源的重組促卵泡激素(FSH)的劑量或等效劑量；或者
[0074]如果受試者的血清AMH水平為15至24.9pmol/L,則向所述受試者施用0.14至0.19 μ g人來源的重組FSH (優選地，0.15至0.16 μ g人來源的重組FSH)/kg受試者體重的劑量或等效劑量；或者
[0075]如果受試者的血清AMH水平為25至34.9pmol/L pmol/L,則向所述受試者施用0.11至0.14 μ g人來源的重組FSH (優選地，0.12至0.13 μ g人來源的重組FSH)/kg受試者體重的劑量或等效劑量；或者
[0076]如果受試者的血清AMH水平≤35pmol/L pmol/L,則向所述受試者施用0.10至
0.11 μ g人來源的重組FSH/kg受試者體重的劑量或等效劑量。
[0077]對於血清AMH為5.0-14.9pmol/L的患者(受試者)，可以施用6至18 μ g、例如8至11 μ g、例如8.5至10.2yg人來源的重組FSH的劑量或等效劑量。對於血清AMH為15.0-29.9pmol/L的患者(受試者)，可以施用4.8至15 μ g、例如6至9 μ g、例如6.8至
8.5 μ g人來源的重組FSH的劑量或等效劑量。對於血清AMH為30-44.9pmol/L的患者(受試者)，可以施用3.6至12 μ g、例如4至7 μ g、例如5.1至6.8 μ g人來源的重組FSH的劑量或等效劑量。對於血清AMH為45pmol/L以上的患者(受試者)，可以施用2至9 μ g、例如
2.4至9 μ g (例如3.4至5.1yg)或2至5yg人來源的重組FSH的劑量或等效劑量。對於血清AMH為5pmol/L以下的患者(受試者)，可以施用7.2至24 μ g、例如10至15 μ g、例如10.2至13.6μ g人來源的重組FSH的劑量或等效劑量。在一些實例中，施用4.8至18 μ g、例如6至11 μ g、例如6.8至10.2 μ g人來源的重組FSH的劑量或等效劑量。優選地，FSH是重組FSH ( 「rFSH」或「recFSH」)。優選地，FSH是人細胞系來源的重組FSH。所述施用優選地包含以上及權利要求中限定的FSH的量的日劑量或等效日劑量。所述(日)劑量可以是初始劑量(其在治療期間可以被降低、升高或保持)。
[0078]發明詳述
[0079]現在將根據附圖更詳細地描述本發明，其中:
[0080]圖1顯示pFSH α / β表達載體的質粒圖譜；
[0081]圖2顯示α 2，3-唾液酸轉移酶(ST3GAL4)表達載體；
[0082]圖3顯示α 2，6_唾液酸轉移酶(ST6GAL1)表達載體；
[0083]圖4顯示在用α 2，3_唾液酸轉移酶改造後穩定表達FSH的PER.C6?細胞製備的重組FSH的實例的唾液酸分布的％豐度；
[0084]圖5顯示在用α 2，3_唾液酸轉移酶改造後穩定表達FSH的PER.C6?細胞製備的重組FSH的實例的聚糖電荷分布的％豐度；
[0085]圖6顯示在施用225IU Gonal f(底部線，虛線)和225IU本發明的實施例(頂部線，實線)後抑制素-B的濃度的比較；
[0086]圖7顯示體重對低AMH治療組中提取的卵母細胞的影響(實施例10，10A);和
[0087]圖8顯示體重對高AMH治療組中提取的卵母細胞的影響。
[0088]序列選擇
[0089]人 FSH
[0090]根據Fiddes和Goodman.(1981)使用FSHa多肽的基因編碼區。序列登記為AH007338，並且在構建時，不存在該蛋白序列的其它變體。該序列在本文中稱為SEQ IDNO:1。
[0091]根據Keene等(1989)使用FSH3多肽的基因編碼區。將所述序列登記為NM_000510，並且在構建時，不存在該蛋白序列的其它變體。該序列在本文登記為SEQ IDN0:2。
[0092]唾液酸轉移酶
[0093]a 2，3-唾液酸轉移酶-根據Kitagawa和Paulson(1994)使用β_半乳糖苷α -2，3-唾液酸轉移酶4(α 2，3_唾液酸轉移酶，ST3GAL4)的基因的編碼區。將序列登記為L23767，並且在本文稱為SEQ ID Ν0:3。
[0094]α 2，6-唾液酸轉移酶-根據Grundmann等(1990)使用β _半乳糖醯胺(galactosamide) α-2，6_唾液酸轉移酶I ( α 2，6_唾液酸轉移酶，ST6GAL1)的基因編碼區。將序列登記為ΝΜ_003032並且在本文稱為SEQ ID NO:4。
實施例
[0095]實施例1FSH表達載體的構建
[0096]分別使用弓丨物組合FSHa-fw和FSHa-rev和FSHb-fw和FSHb-rec，通過PCR擴增FSHa 多肽(ΑΗ007338，SEQ ID NO:1)和 FSHP 多肽(NMJ)O3O321SEQ ID NO:2)的編碼序列。
[0097]FSHa-fw5』-CCAGGATCCGCCACCATGGATTACTACAGAAAAATATGC-3』 (SEQ ID NO:9)
[0098]FSHa-rev5』-GGATGGCTAGCTTAAGATTTGTGATAATAAC-3』 (SEQ ID NO:10)[0099]FSHb-fw5』-CCAGGCGCGCCACCATGAAGACACTCCAGTTTTTC-3』 (SEQ ID NO:11)
[0100]FSHb-rev5』-CCGGGTTAACTTATTATTCTTTCATTTCACCAAAGG-3』 (SEQ ID NO:12)
[0101]將得到的擴增的FSH β DNA用限制性酶AscI和HpaI消化，並將其插入在攜帶新黴素選擇標記的CMV驅動的哺乳動物表達載體上的AscI和HpaI位點中。類似地，將FSH a DNA用BamHI和NheI消化，並將其插入到在已經包含FSH β多肽DNA的表達載體上的位點BamHI和NheI中。
[0102]將載體DNA用於轉化大腸桿菌(E.coli)的DH5 α菌株。挑選克隆用於擴增。選擇包含含有FSHa和β兩者的載體的克隆用於測序並且全部都包含正確的根據SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的序列。選擇質粒pFSH A+B#17用於轉染(圖1)。
[0103]實施例2ST3表達載體的構建
[0104]使用引物組合2，3STfw和2，3STrev，通過PCR擴增β -半乳糖苷a -2，3_唾液酸轉移酶4(ST3，L23767，SEQ ID NO: 3)的編碼序列。
[0105]2，3STfw5』-CCAGGATCCGCCACCATGTGTCCTGCAGGCTGGAAGC-3』 (SEQ ID NO:13)
[0106]2，3STrev5』-TTTTTTTCTTAAGTCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3』 (SEQ ID NO:14)[0107]將得到的擴增的ST3DNA用限制性酶BamHI和AflII進行消化，並將其插入在攜帶潮黴素抗性標記的CMV驅動的哺乳動物表達載體上的BamHI和AflII位點中。將所述載體如前述擴增，並且測序。克隆pST3#l(圖2)包含正確的根據SEQ ID N0:3的序列，並將其選擇用於轉染。
[0108]實施例3ST6表達載體的構建
[0109]使用引物組合2，6STfw和2，6STrev，將β -半乳糖醯胺α -2，6_唾液酸轉移酶I的編碼序列(ST6, NM_003032, SEQ ID NO: 4)通過PCR進行擴增。
[0110]2，6STfw/5，-CCAGGATCCGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAG-3， (SEQ ID NO:15)
[0111]2，6STrev5』-TTTTTTTCTTAAGTTAGCAGTGAATGGTCCGG-3』 (SEQ ID NO:16)
[0112]將得到的擴增的ST6DNA用限制性酶BamHI和AflII進行消化，並將其插入攜帶潮黴素抗性標記的CMV驅動的哺乳動物表達載體上的BamHI和AflII位點中。將所述載體如前述擴增並且測序。克隆pST6#ll(圖3)包含正確的根據SEQ ID N0:4的序列並將其選擇用於轉染。
[0113]實施例4pFSHa+p在PER.C6?細胞中的穩定表達。轉染分離和克隆的篩選。
[0114]通過在單一質粒中表達FSH的兩條多肽鏈產生生產FSH的PER.C6?克隆(見實施例I)。
[0115]為了獲得穩定的克隆，使用關於pFSHa+β構建體的基於脂質體的轉染試劑。在補充了 10%FCS並包含G418的VPRO中選擇穩定的克隆。在轉染後三周，G418抗性克隆生長。選擇克隆用於分離。在選擇性培養基中培養分離的克隆直到70-80%匯合。使用FSH選擇性ELISA測定上清液的FSH蛋白含量，並且使用cAMP積累測定法(CAMP accumulationassay)，在克隆的細胞系中測定關於FSH受體的藥理學活性。表達功能蛋白的克隆進一步培養擴增到24孔、6孔和T80燒瓶。
[0116]在T80燒瓶中開始關於確定來自7個克隆的物質的生產率和質量的研究以產生足量的物質。在如前述的補充培養基中培養細胞7天，並且收集上清液。使用FSH選擇性ELISA測定生產率。通過等電聚焦(IEF)、通過本領域中的已知方法確定所述物質的等電圖譜。關於唾液酸轉移酶改造，選擇具有足夠生產率和質量的克隆。
[0117]實施例5唾液酸化水平在過量表達α 2，3_唾液酸轉移酶的細胞中增加。pST3在表達FSH的PER.C6?細胞中穩定表達；轉染分離和克隆篩選。
[0118]通過從/|:PER.C6?細胞中的各個質粒(實施例2)表達α 2，3唾液酸轉移酶來產生生產高度唾液酸化FSH的PER.C6?克隆，所述PER.C6?細胞已經表達了 FSH的兩條多肽鏈(來自實施例4)。關於它們的性質，選擇在實施例4中提及的由PER.C6?細胞產生的克隆，所述性質包括生產率，良好生長曲線，功能蛋白的產生，和包含一些唾液酸化的產生的FSH。產生穩定克隆，如之前在實施例4中所述。將克隆分離、擴增並測定。α2，3_唾液酸轉移酶克隆適合於無血清培養基和懸浮條件。
[0119]如前，使用FSH選擇性ELISA，在FSH受體細胞系中的功能反應，IEF，代謝清除率和Steelman Pohley分析,測定克隆。將結果與商購重組FSH(Gonal-f, Serono)和親代FSH PER.C6?細胞系進行比較。相比於在沒有α 2，3-唾液酸轉移酶的情況下表達的FSH,由大多數克隆產生的FSH具有顯著提高的唾液酸化(即，平均而言更多的FSH同工型，更多數量的唾液酸)。結論是，在PER.C6?細胞中FSH與唾液酸轉移酶一起的表達導致與僅表達FSH的細胞比較，增加水平的唾液酸化的FSH。
[0120]實施例6生產和純化綜述
[0121]開發了一種在PER.C6?細胞中生產FSH的方法，其在無血清培養基中混懸培養。在下面描述所述方法並 且將其應用於一些生產FSH的PER.C6?細胞系。
[0122]使用由Lowry等(1976)所述的方法的改進方法來製備來自α 2，3_克隆(實施例5)的 FSH。
[0123]對於PER.C6?-FSH的生產，使所述細胞系適應於無血清培養基，即Excell525 (JRH Biosciences (JRH生物科學))。首先將所述細胞在T80培養瓶中培養到形成70%-90%匯合單層。傳代後，將細胞重新懸浮在無血清培養基，EXcell525+4mM L-穀氨醯胺中到0.3xl06細胞/ml的細胞密度。將25ml的細胞混懸液置於250ml搖瓶中，並在5%C02下，在37°C，在IOOrpm搖動。在達到>1χ106細胞/ml的細胞密度後，將細胞繼代培養到0.2或0.3xl06細胞/ml的細胞密度，並且在搖瓶中，在37°C，5%C02和IOOrpm進一步培養。
[0124]對於FSH的生產，將細胞轉移到無血清生產培養基，即VPR0(JRHBiosciences (JRH生物科學))中，其支持PER.C6?細胞的生長到非常高的細胞密度(在批次培養物中通常為>107細胞/ml)。首先，將所述細胞在Excell525中培養到>1χ106細胞/ml，接著在1000rpm離心5分鐘，並隨後懸浮在VPRO培養基+6mM L-穀氨醯胺中到IxlO6細胞/ml的密度。接著，將細胞在37°C，5%C02和lOOrpm，在搖瓶中培養7_10天。在該階段過程中，將所述細胞培養到>107細胞/ml的密度。在細胞生命力開始下降後收穫培養基。將所述細胞在1000rpm離心5分鐘，並將所述上清液用於FSH的量化和純化。使用ELISA (DRGEIA1288)確定FSH的濃度。
[0125]隨後，使用由Lowry等(1976)所述方法的改進方法進行FSH的純化。通過本領域中公知的方法進行使用電荷選擇性色譜的純化以富集高度唾液酸化的形式。[0126]在所有色譜過程期間，如本文所要求保護的FSH的唾液酸化形式的富集通過RIA (DRG EIA1288)和 / 或 IEF 確認。
[0127]實施例7 α 2，3和α 2，6唾液酸的相對量的量化
[0128]使用已知技術測量純化的rFSH(實施例6)上的α 2，3和α 2，6唾液酸的相對百分比的量。
[0129]使用PNGase F在變性條件下使N-聚糖從樣品釋放，然後用2_氨基苯甲醯胺標記。然後通過弱陰離子交換(WAX)柱分離和分析釋放的聚糖形式以確定電荷分布。使用用於確定總唾液酸的2，3，6，8唾液酸酶和用於確定2，3唾液酸的2，3唾液酸酶處理的標記的聚糖通過弱陰離子交換柱進一步分析。
[0130]帶電荷的聚糖的相對百分數計算自存在於未經消化的和消化的聚糖庫(pool)中的結構，並且顯示在圖4中(8個樣品)。發現α 2，3唾液酸化的相對百分數為50%_70%(例如約60%或65%)，並且α 2，6唾液酸化的相對百分數為28至50%，通常為30至35% (例如約 31% 或 35%)。
[0131]實施例8 一、二、三和四唾液酸化的聚糖結構的相對量的量化
[0132]使用已知技術測量在提取自純化的rFSH(實施例6)的聚糖上一、二、三和四唾液酸化的結構的相對百分比的量。
[0133]使用PNGase F在變性條件下使N-聚糖從樣品釋放，然後用2_氨基苯甲醯胺標記。使用PNGase F在變性條件下使聚糖從樣品釋放，然後用2_氨基苯甲醯胺標記。然後通過弱陰離子交換(WAX)柱分離和分析釋放的聚糖形式以確定唾液酸化分布。中性、單-唾液酸化的、二 -唾液酸化的、三-唾液酸化的和四-唾液酸化的結構的相對量顯示在圖5中(關於圖4中顯示的8個樣品)。
[0134]rFSH包括中性、單-唾液酸化的、二 -唾液酸化的、三-唾液酸化的和四_唾液酸化的聚糖結構，其相對量如下:中性5-6% ； 15-17%單-唾液酸化的；26-30% 二一唾液酸化的；30-32%三一唾液酸化的以及17-23%四-唾液酸化的。
[0135]實施例8a
[0136]使用已知技術測量在提取自純化的rFSH的九個樣品(通過實施例6的方法製備)的純化的rFSH上α 2，6唾液酸的相對百分比的量。
[0137]使用PNGase F在變性條件下使N-聚糖從樣品釋放，然後用2_氨基苯甲醯胺標記。然後通過弱陰離子交換(WAX)柱分離和分析釋放的聚糖形式以確定電荷分布。使用用於確定總唾液酸的2，3，6，8唾液酸酶和用於確定2，3唾液酸的2，3唾液酸酶處理的標記的聚糖通過弱陰離子交換柱進一步分析(見實施例8)。所述分析允許α 2，6唾液酸的計算。
[0138]帶電荷的聚糖的相對百分數計算自存在於未經消化的和消化的聚糖庫中的結構，並且顯示在以下的表中。發現α 2，6唾液酸化的相對百分數為25至50%，通常為30至35%。
[0139]使用已知技術測量在提取自純化的rFSH的九個樣品(通過實施例6的方法製備)的聚糖上截開型GlcNac、GalNac和1_巖藻糖Lewis的相對百分比的量。使用PNGase F使N-聚糖從糖蛋白釋放並用2-氨基苯甲醯胺(2AB)標記。通過二維(2D)HPLC分析結合聚糖的酶降解來進行分析。為了驗證，通過MALD1-MS分析聚糖。α 2，6-唾液酸和末端殘基的相對量顯示在下表中，一起顯示的還有Gonal F (來源於CHO細胞的重組FSH)和Bravelle (人尿FSH)的相對量。[0140]
【權利要求】
1.包含促卵泡激素(FSH)的產品，其在治療患者(例如血清AMH水平為0.05pmol/L以上的患者)的不孕中使用，其中所述產品包含劑量或等效劑量為2-24 μ g、例如2至15 μ g的人來源的重組FSH。
2.根據權利要求1使用的產品，其包含促卵泡激素(FSH)，在治療血清AMH水平<15pmol/L的患者的不孕中使用,其中所述產品包含劑量或等效劑量為9至14 μ g的人來源的重組FSH。
3.根據權利要求2使用的產品，其中所述產品包含劑量或等效劑量為12μg的人來源的重組FSH。
4.根據權利要求2或權利要求3使用的產品，其中不孕的治療包括確定所述患者的血清AMH水平的步驟和向血清AMH水平<15pmol/L的患者施用所述劑量的步驟。
5.根據權利要求1使用的產品，其包含促卵泡激素(FSH)，在治療血清AMH水平≥15pmol/L的患者的不孕中使用，其中所述產品包含劑量或等效劑量為5至12.5μ g的人來源的重組FSH。
6.根據權利要求5使用的產品，其中不孕的治療包括確定所述患者的血清AMH水平的步驟和向血清AMH水平≥15pmol/L的患者施用所述劑量的步驟。
7.根據權利要求1使用的產品，其包含促卵泡激素(FSH)，在治療血清AMH水平≥15pmol/L的患者的不孕中使用，其中所述產品以0.09至0.19 μ g人來源的重組FSH/kg患者體重的劑量或等效劑量施用。
8.根據權利要求7使用的產品，其在治療血清AMH水平為15至24.9pmol/L的患者中使用，其中所述產品以0.14至0.19 μ g人來源的重組FSH/kg患者體重的劑量或等效劑量施用。
9.根據權利要求7使用的產品，其在治療血清AMH水平為25至34.9pmol/L的患者中使用，其中所述產品以0.11至0.14 μ g人來源的重組FSH/kg患者體重的劑量或等效劑量施用。
10.根據權利要求7使用的產品，其在治療血清AMH水平>35pmol/L的患者中使用，其中所述產品以0.10至0.11 μ g人來源的重組FSH/kg患者體重的劑量或等效劑量施用。
11.根據權利要求7至10中任一項使用的產品，其中不孕的治療包括確定所述患者的血清AMH水平的步驟和向具有限定的血清AMH水平的患者施用所述劑量的步驟。
12.根據任一項前述權利要求的產品，其中所述促卵泡激素(FSH)是人來源的重組FSH。
13.根據任一項前述權利要求的產品，其中所述FSH包括α2，3_和α 2，6_唾液酸化。
14.根據權利要求13的產品，其中總唾液酸化的25至50%，例如30至50%是α2，6-唾液酸化。
15.根據權利要求13或權利要求14的產品，其中總唾液酸化的50至70%是α2，3-唾液酸化。
16.根據任一項前述權利要求的產品，其中所述FSH包括單-，二-，三-和四-唾液酸化的聚糖結構，其中所述唾液酸化的聚糖結構的15-24%，例如17-23%是四唾液酸化的聚糖結構。
17.根據任一項前述權利要求的在治療不孕中使用的、包含促卵泡激素(FSH)的產品，其中所述產品還包含鹽，所述鹽包含選自由Na+-或K+-鹽，或其組合組成的組的藥用鹼金屬陽離子。
18.治療不孕的方法，所述方法包括: (a)測量受試者的血清AMH水平；和 (b)向所述受試者施用劑量或等效劑量為2-24μ g、例如2至15 μ g的人來源的重組FSH。
19.治療不孕的方法，所述方法包括:(a)確定受試者的血清AMH水平；和(b)將劑量或等效劑量為9至14 μ g的人來源的重組促卵泡激素(FSH)施用於血清AMH水平<15pmol/L的受試者。
20.治療不孕的方法，所述方法包括:(a)確定受試者的血清AMH水平；和(b)將劑量或等效劑量為5至12.5 μ g的人來源的重組促卵泡激素(FSH)施用於血清AMH水平≤15pmol/L的(所述)受試者。
21.治療不孕的方法，所述方法包括:(a)確定受試者的血清AMH水平；和(b)施用劑量或等效劑量為0.09至0.19 μ g的人來源的重組FSH/kg受試者體重,其中所述受試者的血清AMH水平≤15pmol/L0
22.根據權利要求21所述的方法，所述方法包括施用劑量或等效劑量為0.14至0.19 μ g的人來源的重組FSH/kg受試者體重的步驟，所述受試者的血清AMH水平為15至24.9pmol/L。
23.根據權利要求21所述`的方法，所述方法包括施用劑量或等效劑量為0.11至0.14 μ g的人來源的重組FSH/kg受試者體重，所述受試者的血清AMH水平為25至34.9pmol/L。
24.根據權利要求21所述的方法，所述方法包括施用劑量或等效劑量為0.10至0.11 μ g的人來源的重組FSH/kg受試者體重的步驟，所述受試者的血清AMH水平^ 35pmol/L。
25.治療不孕的方法，所述方法包括:(a)確定受試者的血清AMH水平；和(b)施用劑量或等效劑量為0.15至0.17 μ g的人來源的重組FSH/kg受試者體重,其中所述受試者的血清 AMH 水平 <15pmol/L。
26.包含促卵泡激素(FSH)的產品，其用於製備在治療患者(例如血清AMH水平為`0.05pmol/L以上的患者)的不孕中使用的藥物，其中所述產品包含劑量或等效劑量為2-24 μ g、例如2至15 μ g的人來源的重組FSH0
【文檔編號】A61P5/06GK103732243SQ201280038831
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年8月8日 優先權日:2011年8月8日
【發明者】霍安-卡萊斯·阿爾塞 申請人:輝凌公司