一種疫苗佐劑、其製備方法及應用的製作方法

2023-06-16 20:56:36

一種疫苗佐劑、其製備方法及應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種水包油型疫苗佐劑、其製備及應用。所述的水包油型納米乳疫苗佐劑，按照質量百分比包括0.1％～10％的油相、0.1％～10％的乳化劑、0.1％～3％的穩定劑、0.1％～3％的絡合劑以及0.01％～10％的免疫增強劑。其製備方法包括以下步驟：(1)將免疫增強劑、穩定劑和絡合劑均勻分散於水中，獲得水相；(2)將油相和乳化劑混合，獲得油相；(3)將油相緩慢加入到水相中並持續攪拌，形成穩定的乳液；(4)調節乳液的pH值並定容得到初乳；(5)將初乳進行高速剪切和高壓均質。本發明提供的疫苗佐劑，製備簡單，使用方便，副反應小，用於稀釋疫苗，尤其是豬瘟活疫苗，穩定性高，免疫效果好。
【專利說明】一種疫苗佐劑、其製備方法及應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物醫藥領域，更具體地，涉及一種疫苗佐劑、其製備方法及應用。

【背景技術】
[0002] 佐劑是指加入疫苗製劑後能促進、增強或延長機體對抗原特異性免疫應答的物 質。佐劑也是一種抗原輔助劑，與疫苗共同使用可以明顯提高疫苗的免疫效果。佐劑被 用來增強疫苗免疫作用已有80多年的歷史。免疫佐劑可輔佐免疫原刺激機體產生較早、較 強、持久的免疫應答，理想的免疫佐劑應該能滿足以下條件：在有效劑量內無毒或毒性極 小；能刺激機體產生強大的體液免疫和/或細胞免疫應答；具有持久的免疫力；不誘導自身 免疫；無致突變、致癌、致畸形作用等。
[0003] 雖然現在已有許多佐劑應用於動物，但還沒有哪一種佐劑能完全滿足以上要求。 豬瘟是由豬瘟病毒（Classical Swine Fever Virus, CSFV)引起的一種死亡率極高的急性 敗血性、接觸性傳染病，具有流行廣泛、發病率高等特點，對養豬業危害極大。世界動物衛生 組織將豬瘟列為A類16種法定傳染病之一，我國也將豬瘟定為一類烈性傳染病，屬於危害 嚴重、需要採取緊急嚴厲的強制預防、控制和撲滅的動物疫病之一。
[0004] 預防豬瘟最有效的方法就是接種豬瘟疫苗。儘管豬瘟兔化弱毒苗的廣泛應用及其 它綜合防治措施的實施，已控制了豬瘟的大規模流行，但近年來，豬瘟在亞洲、歐洲、南美 洲等地區呈現復發的趨勢。目前市場上預防豬瘟的疫苗主要有三種：乳兔苗、細胞苗和淋脾 苗，這三種均為活疫苗，在臨床使用上有一定的功效，但是，疫苗的免疫成功率不高，除了 疫苗質量、免疫程序、接種部位等因素以外，機體免疫功能低下以及免疫刺激不夠是一個重 要因素，某些病原感染導致機體的免疫功能低下或者免疫抑制。而且部分疫苗，尤其是一些 油佐劑疫苗接種後免疫應激反應很大，使用一些低免疫應激反應佐劑是發展趨勢。已有研 究發現，免疫增強劑在豬瘟疫苗使用中能提高豬免疫力，對豬瘟疫苗的抗體水平有不同程 度的影響。但是，目前尚無性能穩定的豬瘟活疫苗佐劑上市。


【發明內容】

[0005] 針對現有技術的以上缺陷或改進需求，本發明提供了一種疫苗佐劑、其製備方法 及應用，其目的在於通過添加免疫增強劑，使水包油型納米乳疫苗佐劑增強疫苗本身的細 胞及體液免疫刺激能力，尤其是該疫苗佐劑還可能同時含有適用於提高豬瘟活疫苗效力的 其他水性佐劑成分，進一步提高活疫苗的攻毒保護效力，解決目前疫苗刺激不夠的技術問 題。
[0006] 為實現上述目的，按照本發明的一個方面，提供了一種疫苗佐劑，其特徵在於，所 述疫苗佐劑為pH值在4. 0至9. 0之間的水包油型納米乳，優選pH值在7. 5至9. 0之間的水 包油型納米乳，按照質量百分比包括〇. 1%?10%的油相、〇. 1%?10%的乳化劑、〇. 1%? 3%的穩定劑、0. 1 %?3%的絡合劑以及0.01 %?10%的免疫增強劑。
[0007] 優選地，所述疫苗佐劑，其所述水包油型納米乳其平均粒徑在10nm?2000nm之 間，優選在50nm?500nm之間。
[0008] 優選地，所述疫苗佐劑，其免疫增強劑為具有免疫增強作用的蜂膠、多肽、多糖或 黃酮類；所述的多肽優選為白蛋白多肽、扇貝多肽和/或賽弗諾多肽；所述多糖優選為黃 芪多糖、人參多糖、香菇多糖、錦燈籠多糖、靈芝菌絲體多糖、板藍根多糖、枸杞多糖、當歸多 糖、靈芝多糖、紅景天多糖、大棗多糖和/或殼聚糖；所述黃酮類優選為淫羊藿黃酮、金橘黃 酮、白花蛇舌草黃酮、大豆黃酮和沙棘黃酮；
[0009] 所述免疫增強劑更優選為黃芪多糖。
[0010] 優選地，所述疫苗佐劑，其乳化劑包括親水性表面活性劑和親油性表面活性劑，所 述親水性表面活性劑與親油性表面活性劑的質量比例在1:2至2:1之間，優選在1:1至 1. 5:1之間。
[0011] 優選地，所述疫苗佐劑，其親油性表面活性劑其親水親油平衡值在3至8之間；
[0012] 所述親油性表面活性劑優選為脫水山梨醇脂肪酸酯、卵磷脂、甘露醇油酸酯、二縮 甘露醇油酸酯、聚氧丙烯甘露醇二油酸酯、聚氧乙烯山梨醇蜂蠟衍生物、單油酸甘油酯和單 油酸縮山梨醇酯中的一種或多種；所述脫水山梨醇脂肪酸酯優選為司盤20、司盤40、司盤 60、司盤80或司盤85 ;
[0013] 所述親油性表面活性劑更優選為司盤80或二縮甘露醇單油酸酯。
[0014] 優選地，所述疫苗佐劑，其親水性表面活性劑其親水親油平衡值在8至15之間；
[0015] 所述親水性表面活性劑優選為聚氧丙烯甘露醇二油酸酯、聚氧乙烯脫水山梨醇 酯、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氫化蓖麻油、聚氧乙烯月桂醇醇醚和聚氧乙烯-聚氧丙烯共 聚物中的一種或多種；所述聚氧乙烯脫水山梨醇酯，優選為吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫 80或吐溫85 ;所述聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，優選為泊洛沙姆124、泊洛沙姆188或泊洛 沙姆407 ;
[0016] 所述親水性表面活性劑更優選為吐溫80、吐溫85、聚氧乙烯氫化蓖麻油或泊洛沙 姆 407。
[0017] 優選地，所述疫苗佐劑，其穩定劑為可溶性的二價無機鹽，所述二價無機鹽的陽離 子為錳離子、鈣離子、鋅離子或亞鐵離子，所述二價無機鹽的陰離子為葡萄糖酸根離子、磷 酸根離子、磷酸氫根離子、磷酸二氫根離子或氯離子。
[0018] 優選地，所述疫苗佐劑，其絡合劑為乙二胺四乙酸和/或聚丙烯酸鈉，優選乙二 胺四乙酸。
[0019] 優選地，所述疫苗佐劑，其油相為精加工烴類礦物油，優選為美孚白礦油 Marcol52、美半白礦油Marcol82、白礦油Drakeol5或白礦油Drakeol6 ;優選為美半白礦油 Marcol52 或白礦油 Drakeol5。
[0020] 優選地，所述的疫苗佐劑，還可以進一步包括一些添加劑，如抗氧化劑（二丁基羥 基甲苯、維生素 E、茶多酚等）、防腐劑（羥苯乙酯、苯甲酸鈉等）。所述添加劑佔納米乳佐劑 總重量的0%?0.5%
[0021] 按照本發明的另一方面，提供了一種所述的疫苗佐劑的製備方法
[0022] 包括以下步驟：
[0023] (1)將配方比例的免疫增強劑、穩定劑和絡合劑均勻分散於水中，獲得水相；
[0024] (2)將配方比例的油相和乳化劑混合，獲得含乳化劑的油相；
[0025] (3)將含乳化劑的油相緩慢加入到水相中並持續攪拌，使得形成穩定的乳液；
[0026] (4)調節步驟⑶中獲得的乳液的pH值並定容得到初乳；
[0027] (5)將步驟（4)中獲得的初乳進行高速剪切和高壓均質，通過微孔濾膜過濾除菌， 獲得無菌納米乳即為所述疫苗佐劑。
[0028] 優選地，所述的製備方法，其步驟（3)將含乳化劑的油相緩慢加入到水相中持續 攪拌為磁力攪拌l〇min?40min。
[0029] 優選地，所述的製備方法，其步驟（5)所述高速剪切速率為8000?15000rpm，剪切 時間為1?7min ;所述高壓均質壓力為600?2000bar，循環次數為1?9次，優選800? 1600bar壓力條件下勻質3?5個循環。
[0030] 本發明提供的疫苗佐劑應用於豬瘟活疫苗的稀釋，有助於發揮免疫作用。
[0031] 在5至6周的SPF級的Balb/c小鼠上對所述的納米疫苗佐劑進行了安全性評價， 結果發現，免疫之後無一隻死亡，同樣也未觀察到明顯的全身和局部反應，充分證明本發明 的納米疫苗佐劑是安全、可靠的。所述的納米疫苗佐劑跟豬瘟活疫苗混合後免疫小鼠後，檢 測到CSFV抗體，並能誘導小鼠的明顯的細胞和體液免疫反應。
[0032] 總體而言，通過本發明所構思的以上技術方案與現有技術相比，由於採用含有免 疫增強劑的水包油型納米乳，可與疫苗的混合使用，與現有的生理鹽水稀釋疫苗技術相比， 能夠取得以下有益效果：
[0033] 1.本發明的納米疫苗佐劑，可以顯著增強疫苗的細胞及體液免疫刺激能力，提高 活疫苗的攻毒保護效力。以豬瘟疫苗為例，目前市場上預防豬瘟的疫苗主要有三種：乳兔 苗、細胞苗和淋脾苗，並且這三種均為活疫苗，在臨床使用上也顯示出明顯的功效。然而，仍 不能達到令人滿意的完全保護的效果。採用本發明提供的疫苗佐劑，能明顯提高免疫應答 效果。
[0034] 2.本發明提供的納米疫苗佐劑稀釋豬瘟活疫苗疫苗的效果，相較於單獨使用生理 鹽水等稀釋豬瘟活疫苗對小鼠的免疫作用更明顯，增強了疫苗的效價，節約了成本。
[0035] 3.本發明的納米疫苗佐劑製備方法，工藝簡單，成本低，得到的劑型穩定。製備的 水包油型納米乳劑，穩定期長，易儲存，免疫效果好，保護期延長，易於注射，副反應很小。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0036] 圖1是實施例10皮下注射該佐劑稀釋劑後小鼠的體重變化；
[0037] 圖2是實施例11免疫後血清中ELISA抗體動態變化；
[0038] 圖3是實施例11的IL-4標準曲線；
[0039] 圖4是實施例11接種疫苗後小鼠血清中IL_4水平；
[0040] 圖5是實施例11的IL-6標準曲線；
[0041] 圖6是實施例11接種疫苗後小鼠血清中IL_6水平；
[0042] 圖7是實施例11的IFN-r標準曲線；
[0043] 圖8是實施例11接種疫苗後小鼠血清中IFN-r水平。

【具體實施方式】
[0044] 為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對 本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並 不用於限定本發明。此外，下面所描述的本發明各個實施方式中所涉及到的技術特徵只要 彼此之間未構成衝突就可以相互組合。
[0045] 本發明提供的疫苗佐劑，為pH至在4. 0至9. 0之間的水包油型納米乳，優選pH值 在7. 5至9. 0之間的水包油型納米乳。所述疫苗佐劑，按照質量百分比包括0. 1%?10% 的油相、〇. 1%?10%的乳化劑、〇. 1%?3%的穩定劑、0. 1%?3%的絡合劑以及0.01%? 10%的免疫增強劑，餘量為水。所述水包油型納米乳其平均粒徑在l〇nm?2000nm之間，優 選在50nm?500nm之間；多分散指數Η)Ι彡0· 50。
[0046] 所述免疫增強劑為具有免疫增強作用的蜂膠、多肽、多糖或黃酮類；所述的多肽優 選為白蛋白多肽、扇貝多肽和/或賽弗諾多肽；所述多糖優選為黃芪多糖、人參多糖、香菇 多糖、錦燈籠多糖、靈芝菌絲體多糖、板藍根多糖、枸杞多糖、當歸多糖、靈芝多糖、紅景天多 糖、大棗多糖和/或殼聚糖；所述黃酮類優選為淫羊藿黃酮、金橘黃酮、白花蛇舌草黃酮、大 豆黃酮和沙棘黃酮；所述免疫增強劑更優選為黃芪多糖。
[0047] 所述乳化劑包括親水性表面活性劑和親油性表面活性劑，所述親水性表面活性劑 與親油性表面活性劑的質量比例在1:2至2:1之間，優選在1:1至1. 5:1之間。所述親油性 表面活性劑其親水親油平衡值在3至8之間，優選為脫水山梨醇脂肪酸酯、卵磷脂、甘露醇 油酸酯、二縮甘露醇油酸酯、聚氧丙烯甘露醇二油酸酯、聚氧乙烯山梨醇蜂蠟衍生物、單油 酸甘油酯和單油酸縮山梨醇酯中的一種或多種；所述脫水山梨醇脂肪酸酯優選為司盤20、 司盤40、司盤60、司盤80或司盤85。所述親油性表面活性劑更優選為司盤80或二縮甘露 醇單油酸酯。所述親水性表面活性劑其親水親油平衡值在8至15之間，優選為聚氧丙烯甘 露醇二油酸酯、聚氧乙烯脫水山梨醇酯、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氫化蓖麻油、聚氧乙烯 月桂醇醇醚和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物中的一種或多種；所述聚氧乙烯脫水山梨醇酯， 優選為吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80或吐溫85 ;所述聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，優選 為泊洛沙姆124、泊洛沙姆188或泊洛沙姆407。所述親水性表面活性劑更優選為吐溫80、 吐溫85、聚氧乙烯氫化蓖麻油或泊洛沙姆407。
[0048] 所述穩定劑為可溶性的二價無機鹽，所述二價無機鹽的陽離子為錳離子、鈣離子、 鋅離子或亞鐵離子，所述二價無機鹽的陰離子為葡萄糖酸根離子、磷酸根離子、磷酸氫根離 子、磷酸二氫根離子或氯離子。所述穩定劑優選為葡萄糖酸錳、葡萄糖酸鈣、葡萄糖酸鋅、磷 酸鈣、葡萄糖酸鐵和氯化鈣，優選葡萄糖酸錳或葡萄糖酸鈣。
[0049] 所述絡合劑為乙二胺四乙酸和/或聚丙烯酸鈉，優選乙二胺四乙酸。
[0050] 所述油相為精加工烴類礦物油，通過蒸餾油以及通過實施後續加工步驟而獲得的 烴類礦物油，後續加工步驟例如脫硫作用、脫浙青作用、芳香化合物提取以及蠟提取步驟以 及其他精加工步驟，優選為美孚白礦油Marc 〇152、美孚白礦油Marc〇182、白礦油Drake〇15 或白礦油Drakeol6 ;優選為美孚白礦油Marcol52或白礦油Drakeol5。
[0051] 本發明提供的疫苗佐劑，其製備方法，包括以下步驟：
[0052] (1)將配方比例的免疫增強劑、穩定劑和絡合劑均勻分散於水中，獲得水相。
[0053] (2)將油相和乳化劑混合，獲得含乳化劑的油相。
[0054] (3)將含乳化劑的油相緩慢加入到水相中並持續攪拌，優選磁力攪拌lOmin? 40min，使得形成穩定的乳液。
[0055] (4)調節步驟⑶中獲得的乳液的pH值並定容得到初乳。優選使用0· lmol/L的 氫氧化鈉溶液調節pH值。
[0056] (5)將步驟（4)中獲得的初乳進行高速剪切和高壓均質，通過微孔濾膜過濾除菌， 獲得無菌納米乳即為所述疫苗佐劑。高速剪切速率為8000?15000rpm，剪切時間為1? 7min ;高壓均質壓力為600?2000bar，循環次數為1?9次，優選800?1600bar壓力條 件下勻質3?5個循環。微孔濾膜為0. 22 μ m的微孔濾膜。
[0057] 按照本方法製得的疫苗佐劑，宜充氮灌裝，可室溫下放置。
[0058] 本發明提供的疫苗佐劑應用於豬瘟活疫苗稀釋。目前市場上預防豬瘟的疫苗主要 有三種：乳兔苗、細胞苗和淋脾苗，並且這三種均為活疫苗，在臨床使用上也顯示出明顯的 功效。然而，仍不能達到令人滿意的完全保護的效果。用本發明的佐劑稀釋所述三種，可以 顯著增強疫苗的細胞及體液免疫刺激能力，提高活疫苗的攻毒保護效力，減少疫苗用量，從 而降低成本。
[0059] 以下為實施例：
[0060] 實施例1
[0061] 本發明提供的疫苗佐劑，為pH為8. 0的水包油型納米乳。所述疫苗佐劑，按照質 量百分比包括5 %的油相、5%的乳化劑、1 %的穩定劑、3 %的絡合劑以及0. 5 %的免疫增 強劑，餘量為水。所述水包油型納米乳其平均粒徑為108. 4± 17. 6nm;多分散指數PDI為 0·174。
[0062] 所述免疫增強劑為具有免疫增強作用的蜂膠。
[0063] 所述乳化劑包括親水性表面活性劑和親油性表面活性劑，所述親水性表面活性劑 與親油性表面活性劑的質量比例為1. 5:1。所述親油性表面活性劑為二縮甘露醇油酸酯，其 親水親油平衡值為4. 3。所述親水性表面活性劑為吐溫80,其親水親油平衡值為15。
[0064] 所述穩定劑為葡萄糖酸錳。
[0065] 所述絡合劑為乙二胺四乙酸。
[0066] 所述油相為美孚白礦油Marcol52。
[0067] 本發明提供的疫苗佐劑，其製備方法，包括以下步驟：
[0068] (1)將0. 5%的免疫增強劑、1 %的穩定劑和3%的絡合劑均勻分散於30ml水中，獲 得水相。
[0069] (2)將5%的油相和5%的乳化劑混合，獲得含乳化劑的油相。
[0070] (3)將含乳化劑的油相緩慢加入到水相中並持續磁力攪拌20min，使得形成穩定 的乳液。
[0071] (4)調節步驟（3)中獲得的乳液用0· lmol/L的氫氧化鈉溶液調節pH值至8. 0並 定容得到初乳。
[0072] (5)將步驟（4)中獲得的初乳進行高速剪切和高壓均質，通過微孔濾膜過濾除菌， 獲得無菌納米乳即為所述疫苗佐劑。高速剪切速率為l〇〇〇〇rpm，剪切時間為3min ;高壓均 質壓力為lOOObar，循環次數為3次；微孔濾膜為0. 22 μ m的微孔濾膜。
[0073] 按照本方法製得的疫苗佐劑，宜充氮灌裝，可室溫下放置。
[0074] 實施例2
[0075] 本發明提供的疫苗佐劑，為pH為8. 5的水包油型納米乳。所述疫苗佐劑，按照質 量百分比包括10 %的油相、10 %的乳化劑、2 %的穩定劑、2 %的絡合劑以及1 %的免疫增 強劑，餘量為水。所述水包油型納米乳其平均粒徑為745. 2±20. 8nm ;多分散指數PDI為 0·207。
[0076] 所述免疫增強劑為具有免疫增強作用的香菇多糖。
[0077] 所述乳化劑包括親水性表面活性劑和親油性表面活性劑，所述親水性表面活性劑 與親油性表面活性劑的質量比例為2:1。所述親油性表面活性劑為聚氧乙烯山梨醇蜂蠟衍 生物。其親水親油平衡值為3. 0。所述親水性表面活性劑為聚氧乙烯蓖麻油，其親水親油平 衡值為13. 3。
[0078] 所述穩定劑為葡萄糖酸錳。
[0079] 所述絡合劑為乙二胺四乙酸。
[0080] 所述油相為美孚白礦油Marco 152。
[0081] 本發明提供的疫苗佐劑，其製備方法，包括以下步驟：
[0082] (1)將1%的免疫增強劑、2%的穩定劑以及2%的絡合劑均勻分散於30ml水中，獲 得水相。
[0083] (2)將10%的油相、10%的乳化劑混合，獲得含乳化劑的油相。
[0084] (3)將含乳化劑的油相緩慢加入到水相中並持續磁力攪拌30min，使得形成穩定 的乳液。
[0085] (4)調節步驟（3)中獲得的乳液用0· lmol/L的氫氧化鈉溶液調節pH值至8. 5之 間並定容得到初乳。
[0086] (5)將步驟（4)中獲得的初乳進行高速剪切和高壓均質，通過微孔濾膜過濾除菌， 獲得無菌納米乳即為所述疫苗佐劑。高速剪切速率為15000rpm，剪切時間為3min ;高壓均 質壓力為1200bar，循環次數為3次；微孔濾膜為0. 22 μ m的微孔濾膜。
[0087] 按照本方法製得的疫苗佐劑，宜充氮灌裝，可室溫下放置。
[0088] 實施例3
[0089] 本發明提供的疫苗佐劑，為pH為4. 0的水包油型納米乳。所述疫苗佐劑，按照質 量百分比包括〇. 5%的油相、1 %的乳化劑、0. 5%的穩定劑、2 %的絡合劑以及0. 01 %的免 疫增強劑，餘量為水。所述水包油型納米乳其平均粒徑為55. 9± 13. lnm ;多分散指數PDI為 0·108。
[0090] 所述免疫增強劑為具有免疫增強作用的大豆黃酮。
[0091] 所述乳化劑包括親水性表面活性劑和親油性表面活性劑，所述親水性表面活性劑 與親油性表面活性劑的質量比例為1:1。所述親油性表面活性劑為聚氧丙烯甘露醇二油酸 酯，其親水親油平衡值為8. 0。所述親水性表面活性劑為聚氧乙烯月桂醇醚，其親水親油平 衡值為9. 5。
[0092] 所述穩定劑為葡萄糖酸鈣。
[0093] 所述絡合劑為乙二胺四乙酸。
[0094] 所述油相為美孚白礦油Marco 152。
[0095] 本發明提供的疫苗佐劑，其製備方法，包括以下步驟：
[0096] (1)將0. 01 %的免疫增強劑、0. 5%的穩定劑以及2%的絡合劑均勻分散於30ml水 中，獲得水相。
[0097] (2)將0. 5%的油相和1 %的乳化劑混合，獲得含乳化劑的油相。
[0098] (3)將含乳化劑的油相緩慢加入到水相中並持續磁力攪拌40min，使得形成穩定 的乳液。
[0099] (4)調節步驟⑶中獲得的乳液用0. lmol/L的氫氧化鈉溶液調節pH值至4. 0並 定容得到初乳。
[0100] (5)將步驟（4)中獲得的初乳進行高速剪切和高壓均質，通過微孔濾膜過濾除菌， 獲得無菌納米乳即為所述疫苗佐劑。高速剪切速率為8000rpm，剪切時間為7min ;高壓均質 壓力為1600bar，循環次數為5次；微孔濾膜為0. 22 μ m的微孔濾膜。
[0101] 按照本方法製得的疫苗佐劑，宜充氮灌裝，可室溫下放置。
[0102] 實施例4
[0103] 本發明提供的疫苗佐劑，為pH為7. 5的水包油型納米乳。所述疫苗佐劑，按照質 量百分比包括〇. 1 %的油相、〇. 1 %的乳化劑、〇. 1 %的穩定劑、0.2%的絡合劑以及0.05% 的免疫增強劑，餘量為水。所述水包油型納米乳其平均粒徑為108. 3±27. 5nm ;多分散指數 PDI 為 0· 133。
[0104] 所述免疫增強劑為具有免疫增強作用的淫羊藿黃酮。
[0105] 所述乳化劑包括親水性表面活性劑和親油性表面活性劑，所述親水性表面活性劑 與親油性表面活性劑的質量比例為1. 5:1。所述親油性表面活性劑為單硬脂酸甘油酯，其親 水親油平衡值為5. 5。所述親水性表面活性劑為吐溫85,其親水親油平衡值為11。
[0106] 所述穩定劑為葡萄糖酸錳。
[0107] 所述絡合劑為聚丙烯酸鈉。
[0108] 所述油相為白礦油Drakeol5。
[0109] 本發明提供的疫苗佐劑，其製備方法，包括以下步驟：
[0110] ⑴將〇. 1%的穩定劑、0.2%的絡合劑以及0.05%的免疫增強劑均勻分散於30ml 水中，獲得水相。
[0111] ⑵將0. 1 %的油相和0. 1 %的乳化劑混合，獲得含乳化劑的油相。
[0112] (3)將含乳化劑的油相緩慢加入到水相中並持續磁力攪拌lOmin，使得形成穩定 的乳液。
[0113] (4)調節步驟（3)中獲得的乳液用0· lmol/L的氫氧化鈉溶液調節pH值至7. 5並 定容得到初乳。
[0114] (5)將步驟（4)中獲得的初乳進行高速剪切和高壓均質，通過微孔濾膜過濾除菌， 獲得無菌納米乳即為所述疫苗佐劑。高速剪切速率為l〇〇〇〇rpm，剪切時間為3min ;高壓均 質壓力為2000bar，循環次數為9次；微孔濾膜為0. 22 μ m的微孔濾膜。
[0115] 按照本方法製得的疫苗佐劑，宜充氮灌裝，可室溫下放置。
[0116] 實施例5
[0117] 本發明提供的疫苗佐劑，為pH為8. 0的水包油型納米乳。所述疫苗佐劑，按照質量 百分比包括5%的油相、5%的乳化劑、1%的穩定劑、3%的絡合劑以及1%的免疫增強劑， 餘量為水。所述水包油型納米乳其平均粒徑為200. 4± 17. 7nm ;多分散指數PDI為0. 104。
[0118] 所述免疫增強劑為具有免疫增強作用的黃芪多糖。
[0119] 所述乳化劑包括親水性表面活性劑和親油性表面活性劑，所述親水性表面活性劑 與親油性表面活性劑的質量比例為1.5:1。所述親油性表面活性劑為二縮甘露醇單油酸酯， 其親水親油平衡值為4. 3。所述親水性表面活性劑為吐溫80,其親水親油平衡值為15。 [0120] 所述穩定劑為葡萄糖酸錳。
[0121] 所述絡合劑為乙二胺四乙酸。
[0122] 所述油相為美孚白礦油Marc〇152。
[0123] 本發明提供的疫苗佐劑，其製備方法，包括以下步驟：
[0124] (1)將1%的穩定劑、3%的絡合劑以及1%的免疫增強劑均勻分散於30ml水中，獲 得水相。
[0125] (2)將5%的油相和5%的乳化劑混合，獲得含乳化劑的油相。
[0126] (3)將含乳化劑的油相緩慢加入到水相中並持續磁力攪拌20min，使得形成穩定 的乳液。
[0127] (4)調節步驟（3)中獲得的乳液用0. lmol/L的氫氧化鈉溶液調節pH值至8. 0並 定容得到初乳。
[0128] (5)將步驟（4)中獲得的初乳進行高速剪切和高壓均質，通過微孔濾膜過濾除菌， 獲得無菌納米乳即為所述疫苗佐劑。高速剪切速率為12000rpm，剪切時間為5min ;高壓均 質壓力為lOOObar，循環次數為4次；微孔濾膜為0. 22 μ m的微孔濾膜。
[0129] 按照本方法製得的疫苗佐劑，宜充氮灌裝，可室溫下放置。
[0130] 實施例6
[0131] 本發明提供的疫苗佐劑，為pH為9.0的水包油型納米乳。所述疫苗佐劑，按照質 量百分比包括2 %的油相、7. 5 %的乳化劑、1 %的穩定劑、3 %的絡合劑以及10 %的免疫增 強劑，餘量為水。所述水包油型納米乳其平均粒徑為502. 3±20. lnm ;多分散指數PDI為 0· 237。
[0132] 所述免疫增強劑為具有免疫增強作用的枸杞多糖。
[0133] 所述乳化劑包括親水性表面活性劑和親油性表面活性劑，所述親水性表面活性劑 與親油性表面活性劑的質量比例為1.25:1。所述親油性表面活性劑為二縮甘露醇單油酸 酯，其親水親油平衡值為4. 3。所述親水性表面活性劑為聚氧丙烯甘露醇二油酸酯，其親水 親油平衡值為8.0。
[0134] 所述穩定劑為葡萄糖酸鈣。
[0135] 所述絡合劑為乙二胺四乙酸。
[0136] 所述油相為白礦油Drakeol5。
[0137] 本發明提供的疫苗佐劑，其製備方法，包括以下步驟：
[0138] (1)將1%的穩定劑、3%的絡合劑以及10%的免疫增強劑均勻分散於30ml水中， 獲得水相。
[0139] (2)將2%的油相和7. 5%的乳化劑混合，獲得含乳化劑的油相。
[0140] (3)將含乳化劑的油相緩慢加入到水相中並持續磁力攪拌20min，使得形成穩定 的乳液。
[0141] (4)調節步驟（3)中獲得的乳液用0. lmol/L的氫氧化鈉溶液調節pH值至9. 0並 定容得到初乳。
[0142] (5)將步驟（4)中獲得的初乳進行高速剪切和高壓均質，通過微孔濾膜過濾除菌， 獲得無菌納米乳即為所述疫苗佐劑。高速剪切速率為lOOOOrpm，剪切時間為3min ;高壓均 質壓力為800bar，循環次數為7次；微孔濾膜為0. 22 μ m的微孔濾膜。
[0143] 按照本方法製得的疫苗佐劑，宜充氮灌裝，可室溫下放置。
[0144] 實施例7
[0145] 本發明提供的疫苗佐劑，為pH為7. 5的水包油型納米乳。所述疫苗佐劑，按照質 量百分比包括3%的油相、2 %的乳化劑、0. 5 %的穩定劑、0. 1 %的絡合劑以及0. 1 %的免疫 增強劑，餘量為水。所述水包油型納米乳其平均粒徑為1069. 7±53. 2nm ;多分散指數PDI為 0· 324。
[0146] 所述免疫增強劑為具有免疫增強作用的沙棘黃酮。
[0147] 所述乳化劑包括親水性表面活性劑和親油性表面活性劑，所述親水性表面活性劑 與親油性表面活性劑的質量比例為1:1。所述親油性表面活性劑為司盤80,其親水親油平 衡值為4. 3。所述親水性表面活性劑為泊洛沙姆407,其親水親油平衡值為15。
[0148] 所述穩定劑為葡萄糖酸鋅。
[0149] 所述絡合劑為聚丙烯酸鈉。
[0150] 所述油相為美孚白礦油Marcol52。
[0151] 本發明提供的疫苗佐劑，其製備方法，包括以下步驟：
[0152] (1)將0. 5 %的穩定劑、0. 1 %的絡合劑以及0. 1 %的免疫增強劑均勻分散於30ml 水中，獲得水相。
[0153] (2)將3%的油相和2%的乳化劑混合，獲得含乳化劑的油相。
[0154] (3)將含乳化劑的油相緩慢加入到水相中並持續磁力攪拌20min，使得形成穩定 的乳液。
[0155] (4)調節步驟（3)中獲得的乳液用0· lmol/L的氫氧化鈉溶液調節pH值至7. 5並 定容得到初乳。
[0156] (5)將步驟（4)中獲得的初乳進行高速剪切和高壓均質，通過微孔濾膜過濾除菌， 獲得無菌納米乳即為所述疫苗佐劑。高速剪切速率為8000rpm，剪切時間為lmin ;高壓均質 壓力為600bar，循環次數為1次；微孔濾膜為0. 22 μ m的微孔濾膜。
[0157] 按照本方法製得的疫苗佐劑，宜充氮灌裝，可室溫下放置。
[0158] 實施例8
[0159] 本發明提供的疫苗佐劑，為pH為8. 5的水包油型納米乳。所述疫苗佐劑，按照質 量百分比包括7. 5 %的油相、3 %的乳化劑、3 %的穩定劑、3 %的絡合劑以及0. 1 %的免疫增 強劑，餘量為水。所述水包油型納米乳其平均粒徑為1832. 2±40. 4nm ;多分散指數PDI為 0. 250。
[0160] 所述免疫增強劑為具有免疫增強作用的賽弗諾多肽，購於武漢光谷世傲生物科技 有限公司。
[0161] 所述乳化劑包括親水性表面活性劑和親油性表面活性劑，所述親水性表面活性劑 與親油性表面活性劑的質量比例為1: 2。所述親油性表面活性劑為二縮甘露醇單油酸酯，其 親水親油平衡值為4. 3。所述親水性表面活性劑為聚氧乙烯氫化蓖麻油，其親水親油平衡值 為15。
[0162] 所述穩定劑為氯化鈣。
[0163] 所述絡合劑為乙二胺四乙酸。
[0164] 所述油相為美孚白礦油Marcol52。
[0165] 本發明提供的疫苗佐劑，其製備方法，包括以下步驟：
[0166] (1)將3%的穩定劑、3%的絡合劑以及0. 1%的免疫增強劑均勻分散於30ml水中， 獲得水相。
[0167] (2)將7. 5%的油相和3%的乳化劑混合，獲得含乳化劑的油相。
[0168] (3)將含乳化劑的油相緩慢加入到水相中並持續磁力攪拌20min，使得形成穩定 的乳液。
[0169] (4)調節步驟（3)中獲得的乳液用0· lmol/L的氫氧化鈉溶液調節pH值至8. 5並 定容得到初乳。
[0170] (5)將步驟（4)中獲得的初乳進行高速剪切和高壓均質，通過微孔濾膜過濾除菌， 獲得無菌納米乳即為所述疫苗佐劑。高速剪切速率為l〇〇〇〇rpm，剪切時間為3min ;高壓均 質壓力為600bar，循環次數為3次；微孔濾膜為0. 22 μ m的微孔濾膜。
[0171] 按照本方法製得的疫苗佐劑，宜充氮灌裝，可室溫下放置。
[0172] 實施例9
[0173] 納米疫苗佐劑穩定性參數Ke的測定
[0174] 穩定性常數的計算公式如下：Ke = (AfAVA，100% (0 < Ke < 1)。式中A。為乳 劑的稀釋液在設定波長處測得的吸光度；A為經離心後離心管底部乳劑的稀釋液在同一波 長處測得的吸光度。穩定性常數Ke越小，說明乳劑在離心前後變化越小，乳劑越穩定。
[0175] 取乳劑5mL置於10mL離心試管中，4000r ?mirT1，離心15min，用微量進樣器精密量 取試管底部樣品50yL置10mL刻度試管中，用超純水稀釋至刻度，搖勻，以超純水為空白， 在可見區波長500nm處測定吸光度。同法將未離心的乳劑用微量進樣器精密量取試管底部 樣品50 μ L置10mL刻度試管中，同法測定，計算Ke。
[0176]

【權利要求】
1. 一種疫苗佐劑，其特徵在於，所述疫苗佐劑為pH值在4. 0至9. 0之間的水包油型納 米乳，優選pH值在7. 5至9. 0之間的水包油型納米乳，按照質量百分比包括0. 1 %?10% 的油相、〇. 1%?10%的乳化劑、〇. 1%?3%的穩定劑、0. 1%?3%的絡合劑以及0.01%? 10 %的免疫增強劑。
2. 如權利要求1所述的疫苗佐劑，其特徵在於，所述水包油型納米乳，平均粒徑在 10nm?2000nm之間，優選在50nm?500nm之間。
3. 如權利要求1所述的疫苗佐劑，其特徵在於，所述免疫增強劑為具有免疫增強作用 的蜂膠、多肽、多糖或黃酮類；所述的多肽優選為白蛋白多肽、扇貝多肽和/或賽弗諾多肽； 所述多糖優選為黃芪多糖、人參多糖、香菇多糖、錦燈籠多糖、靈芝菌絲體多糖、板藍根多 糖、枸杞多糖、當歸多糖、靈芝多糖、紅景天多糖、大棗多糖和/或殼聚糖；所述黃酮類優選 為淫羊藿黃酮、金橘黃酮、白花蛇舌草黃酮、大豆黃酮和沙棘黃酮； 所述免疫增強劑更優選為黃芪多糖。
4. 如權利要求1所述的疫苗佐劑，其特徵在於，所述乳化劑包括親水性表面活性劑和 親油性表面活性劑，所述親水性表面活性劑與親油性表面活性劑的質量比例在1:2至2:1 之間，優選在1:1至1.5:1之間。
5. 如權利要求4所述的疫苗佐劑，其特徵在於，所述親油性表面活性劑其親水親油平 衡值在3至8之間； 所述親油性表面活性劑優選為脫水山梨醇脂肪酸酯、卵磷脂、甘露醇油酸酯、二縮甘露 醇油酸酯、聚氧丙烯甘露醇二油酸酯、聚氧乙烯山梨醇蜂蠟衍生物、單油酸甘油酯和單油酸 縮山梨醇酯中的一種或多種；所述脫水山梨醇脂肪酸酯優選為司盤20、司盤40、司盤60、司 盤80或司盤85 ; 所述親油性表面活性劑更優選為司盤80或二縮甘露醇單油酸酯。
6. 如權利要求4所述的疫苗佐劑，其特徵在於，所述親水性表面活性劑其親水親油平 衡值在8至15之間； 所述親水性表面活性劑優選為聚氧丙烯甘露醇二油酸酯、聚氧乙烯脫水山梨醇酯、聚 氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氫化蓖麻油、聚氧乙烯月桂醇醇醚和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物 中的一種或多種；所述聚氧乙烯脫水山梨醇酯，優選為吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80或 吐溫85 ;所述聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，優選為泊洛沙姆124、泊洛沙姆188或泊洛沙姆 407 ； 所述親水性表面活性劑更優選為吐溫80、吐溫85、聚氧乙烯氫化蓖麻油或泊洛沙姆 407。
7. 如權利要求1所述的疫苗佐劑，其特徵在於，所述穩定劑為可溶性的二價無機鹽，所 述二價無機鹽的陽離子為錳離子、鈣離子、鋅離子或亞鐵離子，所述二價無機鹽的陰離子為 葡萄糖酸根離子、磷酸根離子、磷酸氫根離子、磷酸二氫根離子或氯離子。
8. 如權利要求1所述的疫苗佐劑，其特徵在於，所述絡合劑為乙二胺四乙酸和/或聚丙 烯酸鈉，優選乙二胺四乙酸。
9. 如權利要求1所述的疫苗佐劑，其特徵在於，所述油相為精加工烴類礦物油，優選為 美半白礦油Marcol52、美半白礦油Marcol82、白礦油Drakeol5或白礦油Drakeol6 ;優選為 美半白礦油Marcol52或白礦油Drakeol5。
10. 如權利要求1至9任意一項所述的疫苗佐劑的製備方法，其特徵在於，包括以下步 驟： (1) 將配方比例的免疫增強劑、穩定劑和絡合劑均勻分散於水中，獲得水相； (2) 將配方比例的油相和乳化劑混合，獲得含乳化劑的油相； (3) 將含乳化劑的油相緩慢加入到水相中並持續攪拌，使得形成穩定的乳液； (4) 調節步驟（3)中獲得的乳液的pH值並定容得到初乳； (5) 將步驟（4)中獲得的初乳進行高速剪切和高壓均質，通過微孔濾膜過濾除菌，獲得 無菌納米乳即為所述疫苗佐劑。
11. 如權利要求1至9所述的疫苗佐劑應用於豬瘟活疫苗稀釋。
【文檔編號】A61K9/107GK104147599SQ201410287027
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年6月24日 優先權日:2014年6月24日
【發明者】劉衛, 梁孔賢, 許琦, 萬江陵, 楊祥良 申請人:華中科技大學, 武漢百思凱瑞納米科技有限公司