一種用於生物在體檢測的集成式微電極的製作方法

2023-06-16 21:49:11 1

專利名稱：一種用於生物在體檢測的集成式微電極的製作方法
技術領域：
本發明屬於電化學分析、電化學傳感器領域，具體涉及用於生物在體檢測的集成 式微電極及其製作方法。背景說明傳感檢測技術在生物分析領域中發揮了重要的作用。目前，利用電化學傳感器進 行生物分子的離體檢測與分析已較為成熟，而將其用於生物活性物質的在體檢測也引起了 越來越多的研究者關注。在已有的電化學在體檢測技術中，所用電極主要是碳纖維，如ChristopheDugast 等人[C.Dugast，et al. Journal ofNeurochemistry, 200282 529-537]利用碳纖維電極 在老鼠視丘細胞中檢測去甲腎上腺素，Christian Amatore等人[Christian Amatore, et al. ChemBioChem, 20081472-1480]用修飾有鉬微粒的碳纖維電極監測巨噬細胞釋放的活性 氧，Jaroslav Katr11k[Jaros1av Katrlik,et al. Bioelectrochemistry,2002, 56 :73_76] 通過醋酸纖維素和Nafion修飾碳纖維製得一氧化氮傳感器，並在豬動脈內皮細胞中探測 到了一氧化氮。然而，由於碳纖維電極吸附性較強、延展性差，因此不適於進行活體組織的 檢測。在我們前期工作中，我們曾利用鄰苯二胺修飾分散有鉬顆粒的鉬柱電極作為工作 電極插入植物的葉片，同時將鉬絲作為對電極、鍍有氯化銀的銀絲作為參比電極插入葉莖 部，成功的在體檢測到受菌核病感染的植物上活性氧的爆發[Qiao Xu, Yuan-Di Zhao, et al. Analytica Chimica Acta，200921-25]。然而，由於在實驗中除鉬柱電極作為工作電極 插入植物的葉脈，同時還要將鉬絲對電極、鍍有氯化銀的銀絲作為參比電極插入葉莖，因此 操作較為不便，且對樣本的損傷程度較大。因此，如能將電極集成起來，將能有效克服這些 缺陷，更有利於進行在體檢測。目前，已有一些研究者提出了各種集成式的電化學傳感器， 如將Ag/AgCl參比電極纏繞在鉬銥合金(Pt/Ir)工作電極上，工作電極與參比電極之間，但這種電極很難重複使用；還有將電極做成微陣列晶片[鄒紹芳，門洪，王平。傳 感器學報，2004第二期]，雖然這種集成化的微陣列電極使用方便、易攜帶，可批量化生產， 但是製作方法極為複雜，在常規實驗室很難實現；在以公開的專利中，有人提出了一種測量 血鉛濃度的集成性一次性電化學傳感器(申請號200720070729. 1)，這種晶片式傳感器將 工作電極、參比電極和輔助電極集成在一個平面上，無法重複使用並且製成不同物質的傳 感器，而且由於體積較大，不適用於在體檢測。

發明內容
本發明的任務是提供一種用於生物在體檢測的集成式微電極，使該電極具有微型 化、集成化的特點，能重複使用、且製作方法簡單易操作、經修飾後能作為微傳感器用於生 物活性物質的在體檢測等特點。同時本發明還提供這種用於生物在體檢測的集成式微電極 的製備方法。
本發明還提供這種用於生物在體檢測的集成式微電極由由玻璃毛細管(8)、以環 氧樹脂⑵固定在玻璃毛細管⑶內的鉬絲工作電極⑴和與該鉬絲工作電極⑴的尾端 相連的銀絲工作電極導線(3)、以環氧樹脂固定在玻璃毛細管(8)內的內縮式Ag/AgCl參比 電極(6)和與該參比電極(6)的尾端相連的銀絲參比電極導線(11)、位於玻璃毛細管⑶ 外面的與銀絲工作電極導線(3)的尾端相連的第一銅絲導線(10)、位於玻璃毛細管(8)外 面的與銀絲參比電極導線(11)的尾端相連的第二銅絲導線(9)構成，鉬絲工作電極(1)的 前部為電極敏感端，在鉬絲工作電極(1)的表面有電泳漆絕緣塗層(2)，在銀絲工作電極導 線(3)的表面有絕緣膠絕緣塗層(4)，鉬絲工作電極(1)與銀絲工作電極導線(3)由導電 膠(5)相連接；第一銅絲導線(10)與銀絲工作電極導線(3)由導電膠(5)相連接；第二銅 絲導線(9)與銀絲參比電極導線(11)由導電膠(5)相連接；內縮式Ag/AgCl參比電極(6) 由位於電極前端端面的與位於玻璃毛細管(8)內的以環氧樹脂(7)固定的銀絲參比電極導 線(11)相對應位置上的一個向下凹陷的小孔洞(12)和位於該小孔洞(12)內的銀絲參比 電極導線(11)前端端面上的氯化銀沉積層(13)構成。本發明提供的用於生物在體檢測的集成式微電極的製作方法是將作為工作電極 的鉬絲與作為工作電極導線的銀絲鑄連在一起後，分別進行絕緣處理，作為工作電極的鉬 絲表面以電泳漆為絕緣塗層，作為工作電極導線的銀絲表面以絕緣膠為絕緣塗層，用環氧 樹脂將經過絕緣處理過的作為工作電極鉬絲和作為工作電極導線的銀絲，以及將作為參比 電極導線的銀絲固定在玻璃毛細管內，待環氧樹脂乾燥後，對電極敏感端即前端進行拋光 打磨，直至露出鉬盤電極與銀盤電極，用硝酸腐蝕電極端的作為參比電極導線的銀絲，使電 極端的端面上形成一個孔洞，在孔洞內的由作為參比電極導線的銀絲端面構成的銀盤上電 沉積氯化銀形成氯化銀沉積層即製成內縮式的Ag/AgCl參比電極；在作為工作電極導線的 銀絲的尾端以導電膠連接一根銅絲作為第一導線，在作為參比電極導線的銀絲的尾端以導 電膠連接一根銅絲作為第二導線，即製成本發明用於生物在體檢測的集成式微電極。以上述本發明提供的用於生物在體檢測的集成式微電極為基礎，利用電化學方法 在集成式微電極上電沉積鉬微粒，然後在沉積有鉬微粒的鉬盤電極上利用電化學的方法電 聚合鄰苯二胺，製作成過氧化氫傳感器。本發明涉及的內縮式Ag/AgCl參比電極的製作以及集成微電極電化學性能的檢 驗用硝酸腐蝕電極端的銀絲，使該電極端面上形成一個孔洞，在孔洞內的銀盤上電沉積氯 化銀製成內縮式的Ag/AgCl參比電極。將電極放入含有鐵氰化鉀的溶液中，利用循環伏安 法掃描得到較穩定的循環伏安曲線，說明這種自製的集成式電極具有較好的電化學性能。本發明提供的這種集成式微電極經過化學修飾後，可製成針對不同生物活性物質 的微傳感器，用於生物在體檢測。在本發明實施例中，將該集成式微電極進行化學修飾後， 製成過氧化氫微傳感器，對油菜受到致病因子侵染時所產生的過氧化氫進行了在體檢測。本發明提供的用於生物在體檢測的集成式微電極將工作電極與參比電極集成在 一起，具有微型化、集成化的特點，能重複使用，並且製作方法簡單易操作。這種集成式微電 極經過修飾後，可製成針對不同物質的微傳感器，用於生物的在體檢測。該集成式微傳感 器中Ag/AgCl參比電極是內縮式的，因此每次可以對電極直接打磨拋光而不會破壞參比電 極，使其具有較好的重現性和電化學性能。這種集成式微電極的製作方法簡單易操作，可以 重複使用。


圖1為本發明電極的結構模式圖，圖中各標識所指部分為1—鉬絲工作電極2—電泳漆絕緣塗層
3—銀絲工作電極導線
4—絕緣膠絕緣塗層
5—導電膠
6—內縮式Ag/AgCl參比電極
7—環氧樹脂
8—玻璃毛細管
9—第二銅絲導線.
10--第一銅絲導線.
11--銀絲參比電極導線.
12--向下凹陷的小孔洞.
13--氯化銀沉積層.圖2為內縮式Ag/AgCl參比電極結構模式圖，圖中各標識所指部分為7—環氧樹 脂；11-銀絲參比電極導線(11) ；12-向下凹陷的小孔洞(12) ；13-氯化銀沉積層(13)圖3為集成式微電極經雙目體式顯微鏡放大45倍後的實物圖；圖4為集成式微電極在在含lmmol/L鐵氰化鉀的0. 5mol/L硝酸鉀溶液中的循環 伏安曲線，掃速為100mV/S ；圖5為利用循環伏安法在集成式微電極上電沉積鉬微粒，掃速為100mV/S ；圖6為在分散有鉬微粒的集成式微電極上電聚合鄰苯二胺；圖7集成式微傳感器在5mmol/L NaCl (a)及含有0. 5mmol/L H202 (b)時的循環伏 安圖，掃描速度100mV/S ；圖8為集成微傳感器對未受侵染的植物進行循環伏安掃描曲線；圖9油菜受侵染(a)和未受侵染(b)時的時間電流曲線。
具體實施例方式實施例1本發明集成式微電極的製作，步驟如下(1)工作電極的製作與絕緣先將鉬絲(直徑100 u m,長度2cm 4cm)洗淨，與銀絲(直徑0. 2mm,長度3cm 5cm)利用導電膠連起來，銀絲得另一端與銅絲同樣利用導電膠連接。將電泳漆與水以體積 比為5 1的比例混合，並且充分攪拌18小時以上。利用線性掃描伏安法在-3V -0.5V 之間對上述的鉬絲段掃描(鉬絲為對電極，Ag/AgCl為參比電極)；然後採用恆電位法在 鉬絲上電沉積電泳漆，其中電位固定在-3V，時間為1000s，70 °C下烘乾；之後將電位固定 在-3. 5V，再次利用恆電位法電沉積1000s，70°C烘乾，重複一次該步驟；最後在-3. 5V電位 下，電沉積800s，在150°C乾燥30min。冷卻待用。
另取一根銀絲，將其與銅絲利用導電膠連接起來，作為參比電極的導線。(2)工作電極與參比電極的集成固定環氧樹脂與乙二胺以質量比為100 6.5的比例混合，並進行超聲消泡處理。將 已經絕緣的工作電極導線鉬絲段和銀絲段與參比電極導線銀絲同時插入毛細管，然後將已 經過消泡處理的環氧樹脂充入毛細管中(內徑0. 9mm 1. 1mm)，30°C乾燥。(3)內縮式參比電極的製作方法將封裝好的集成電極端打磨拋光直至露出銀盤和鉬盤。將集成電極的電極端浸 入濃度約30%硝酸，將銀絲腐蝕，直至在樹脂橫截面上形成約深0. 5mm的孔洞。最後，以孔 洞內的銀盤為工作電極，鉬絲為對電極，Ag/AgCl為參比電極，在濃度為lmol/L的鹽酸溶液 中，利用計時電壓法在孔洞內的銀上電沉積氯化銀製成內縮式的Ag/AgCl參比電極。這種自製的集成式微電極經過雙目體式顯微鏡45倍放大後，對其進行觀察。可以 清晰的看到密封在毛細玻璃管中的鉬電極與Ag/AgCl參比電極，見圖3。可見銀絲的最前端 被硝酸腐蝕，在環氧樹脂中形成了一個孔洞，其Ag截面前端有一層黑色的氯化銀鍍層作為 內縮式的Ag/AgCl參比電極(4)集成式微電極的電化學性能的檢驗將自製的集成式微電極依次用丙酮和超純水洗淨後，在含有鐵氰化鉀的硝酸鉀溶 液中的進行循環伏安掃描；得到穩定的循環伏安曲線，說明該自製的集成式微電極具有較 好的電化學性能。我們以鐵氰化鉀為探針考察了該集成電極的重現性，其循環伏安圖見圖4，可見在 0. 18V和0. 03V出現了一對較為可逆的氧化還原峰，其式電勢為0. 11V，氧化峰電流和還原 峰電流分別為29. 2nA和34. 2nA。重複八次實驗，結果見表1，其式電位的標準偏差分別為 0. 0032，說明這種自製的集成電極具有較好的重現性，可重複使用。表1 檢驗集成電極的重現性。
表1為檢驗集成電極的重現性，重複打磨電極，然後在含有lmmol/L鐵氰化鉀的 0. 5mol/L硝酸鉀進行循環伏安掃描；重複該過程八次，得到氧化還原電流與式電位的標準
偏差；(5)集成式微電極在生物在體檢測中的應用對集成電極進行修飾，製成針對不同物質的微傳感器，用於生物的在體檢測。例如 利用鄰苯二胺修飾分散有鉬微粒的鉬盤電極，製成過氧化氫傳感器，檢測植物體內受到致 病因子侵染後產生的過氧化氫；利用依次利用導電聚合物(poly-TTCA)和細胞色素C修飾 鉬電極，能在體檢測小鼠腦內的NO含量等。本發明中，利用鄰苯二胺修飾分散有鉬微粒的鉬盤電極，製成過氧化氫傳感器。對 油菜(中國農業科學院油料作物研究所培育的中雙9號品種)受到草酸致病因子侵染時， 所產生的過氧化氫進行生物在體檢測。實施例2利用本發明集成式微傳感器在體檢測植物受到草酸致病因子侵染後所產生的過 氧化氫為例，對本發明的應用作進一步詳細說明。(1)我們用此自製的集成式微電極在含有2mmol/L氯鉬酸鉀(K2PtCl6)0. 5mol/L硫 酸(H2SO4)的溶液中利用循環伏安法在工作電極中的敏感區域鉬盤上電沉積鉬微顆粒，用 儀器CHI660記錄到電化學方法電沉積鉬微粒，見圖5。可見隨著循環掃描次數的增加，氧化 還原電流不斷增大，說明了由於鉬微粒在基體鉬盤電極上的不斷沉積，工作電極的有效表 面積逐漸增大。將已修飾鉬微粒的電極置於50mmol/L鄰苯二胺(0PD)0. 5mol/L的H2S04溶 液中聚合鄰苯二胺，見圖6，最終獲得由鄰苯二胺修飾的分散有鉬微粒的工作電極(Pt/Pt/ P0PD)。該微電極可作為活性氧的微傳感器使用。(2)我們又檢測此集成式微傳感器對H202的電化學響應，結果如圖7所示，可以看 出，當加入過氧化氫後(見圖7曲線b)與加入之前(見圖7曲線a)相比，在-0. IV處有明 顯的還原峰出現(見圖7曲線b)，因此可認為本發明製備的集成式過氧化氫傳感器對H202 有明顯的還原作用。在-0.5V的電位出現了另一個較大還原峰，此處是02的還原峰。因此 在下面植物在體檢測時，利用固定電位-0. IV檢測植物所產生的活性氧(過氧化氫是其主 要成分之一)。(3)首先我們將製成的集成式微傳感器插入植物的葉脈中，先進行循環伏安掃描， 見圖8。可以看出，在植物未被草酸侵染時，利用循環伏安掃描未發現過氧化氫，同時也說明 了植物組織間的液體也能作為電化學反應的支持溶液，可以利用電流法來檢測植物中的活 性成分。在距離電極前端1cm處把葉片上的蠟質層輕輕擦掉，作為滴加草酸的位點，利用 固定電位法在體監測植物的氧爆發過程，見圖9。結果表明，在沒有受到草酸侵染時，未檢測 到活性氧的產生，見圖9曲線b。而當有草酸侵染油菜葉片時，可以明顯的看到有氧爆發的產生，見圖9曲線a。在葉片的侵染位點上滴加草酸後6h時，監測到氧爆發到達最大值，見圖 9曲線a。當植物受到致病因子的侵染時，發生了超敏反應和細胞程序性死亡(programmed celldeath, P⑶)，同時會產生大量的活性氧物質。能發生超敏反應的寄主植物一般會產生 兩次活性氧的爆發，其中第二次爆發的時間和強度都要大於第一次[傅愛根，羅廣華，王愛 國。熱帶亞熱帶植物學報，20008(1) :63-69]。在本實驗中我們監測到了第二次氧爆發的過 程，可能是由於第一次氧爆發所產生的活性氧的濃度極低，很難探測到，產生的電流信號被 噪聲所淹沒所致。
權利要求
一種用於生物在體檢測的集成式微電極，其特徵在於，由玻璃毛細管(8)、以環氧樹脂(7)固定在玻璃毛細管(8)內的鉑絲工作電極(1)和與該鉑絲工作電極(1)的尾端相連的銀絲工作電極導線(3)、以環氧樹脂固定在玻璃毛細管(8)內的內縮式Ag/AgCl參比電極(6)和與該參比電極(6)的尾端相連的銀絲參比電極導線(11)、位於玻璃毛細管(8)外面的與銀絲工作電極導線(3)的尾端相連的第一銅絲導線(10)、位於玻璃毛細管(8)外面的與銀絲參比電極導線(11)的尾端相連的第二銅絲導線(9)構成，鉑絲工作電極(1)的前部為經打磨後所形成的鉑盤電極，在鉑絲工作電極(1)的表面有電泳漆絕緣塗層(2)，在銀絲工作電極導線(3)的表面有絕緣膠絕緣塗層(4)，鉑絲工作電極(1)與銀絲工作電極導線(3)由導電膠(5)相連接；第一銅絲導線(10)與銀絲工作電極導線(3)由導電膠(5)相連接；第二銅絲導線(9)與銀絲參比電極導線(11)由導電膠(5)相連接；內縮式Ag/AgCl參比電極(6)由位於電極前端端面的與位於玻璃毛細管(8)內的以環氧樹脂(7)固定的銀絲參比電極導線(11)相對應位置上的一個向下凹陷的小孔洞(12)和位於該小孔洞(12)內的銀絲參比電極導線(11)前端端面上的氯化銀沉積層(13)構成。
2.一種用於生物在體檢測的集成式微電極的製作方法，其特徵在於，將作為工作電極 的鉬絲與作為工作電極導線的銀絲鑄連在一起後，分別進行絕緣處理，作為工作電極的鉬 絲表面以電泳漆為絕緣塗層，作為工作電極導線的銀絲表面以絕緣膠為絕緣塗層，用環氧 樹脂將經過絕緣處理過的作為工作電極鉬絲和作為工作電極導線的銀絲，以及將作為參比 電極導線的銀絲固定在玻璃毛細管內，待環氧樹脂乾燥後，對電極敏感端即前端進行拋光 打磨，直至露出鉬盤電極與銀盤電極，用硝酸腐蝕電極端的作為參比電極導線的銀絲，使電 極端的端面上形成一個孔洞，在孔洞內的由作為參比電極導線的銀絲端面構成的銀盤上電 沉積氯化銀形成氯化銀沉積層即製成內縮式的Ag/AgCl參比電極；在作為工作電極導線的 銀絲的尾端以導電膠連接一根銅絲作為第一導線，在作為參比電極導線的銀絲的尾端以導 電膠連接一根銅絲作為第二導線。
3.—種過氧化氫傳感器，其特徵在於，它是以權利要求1所述的用於生物在體檢測的 集成式微電極為基礎，利用電化學方法在權利要求1所述的生物在體檢測的集成式微電極 的鉬盤上電沉積鉬微粒，然後在沉積有鉬微粒的鉬盤電極上利用電化學的方法電聚合鄰苯 二胺得到的氧化氫傳感器。
全文摘要
本發明為生物在體檢測提供了一種新型集成式微傳感器，將鉑絲與銀絲連接後，用環氧樹脂將已絕緣的工作電極鉑絲和銀絲固定在玻璃毛細管內，然後拋光處理；利用硝酸將腐蝕銀絲，在電極端面上形成一個孔洞，在孔洞內的銀上電沉積氯化銀製成內縮式的Ag/AgCl參比電極。這種集成式微電極經過修飾後，可製成針對不同物質的微傳感器，用於生物的在體檢測。該集成式微傳感器中Ag/AgCl參比電極是內縮式的，因此每次可以對電極直接打磨拋光而不會破壞參比電極，使其具有較好的重現性和電化學性能。這種集成式微電極的製作方法簡單易操作，可以重複使用。
文檔編號G01N27/327GK101852760SQ20101017326
公開日2010年10月6日 申請日期2010年5月12日 優先權日2010年5月12日
發明者楊琴, 董緒燕, 趙元弟, 陳洪, 魏芳 申請人:華中科技大學