攜帶綠色螢光蛋白基因的乙型腦炎病毒全長感染性克隆及製備方法和應用的製作方法

2023-06-16 20:30:31

攜帶綠色螢光蛋白基因的乙型腦炎病毒全長感染性克隆及製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種攜帶綠色螢光蛋白基因的乙型腦炎病毒全長感染性克隆及製備方法和應用。一種攜帶綠色螢光蛋白基因的乙型腦炎病毒全長感染性克隆，其序列為SEQIDNO.22所示。該全長感染性克隆成功製備出攜帶綠色螢光蛋白的重組乙型腦炎病毒。本發明成功獲得的攜帶綠色螢光蛋白基因的重組乙型腦炎病毒，在神經環路標記、藥物篩選平臺的建立、藥物抑制乙型腦炎病毒作用機制的分析、乙型腦炎病毒疫苗和診斷試劑的研發、動物模型的建立、病毒複製和致病機制的分析等方面具有廣泛的應用價值。
【專利說明】攜帶綠色螢光蛋白基因的乙型腦炎病毒全長感染性克隆及製備方法和應用

【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】，更具體涉及一種攜帶綠色螢光蛋白基因的乙型腦炎病毒及製備方法和應用，應用包括在解析腦神經環路、乙型腦炎病毒抗原表位分析和藥物(如抗體藥物)篩選中的應用。

【背景技術】
[0002]人腦是自然界中最為複雜的系統之一，而神經網絡是大腦行使功能的基礎，成年人的大腦中約有111個神經元，並經115個突觸相互連接而構成腦神經網絡。神經網絡的正常連接，使得人體產生正常的生理活動，如認知、學習、記憶和恐懼等；神經網絡的異常往往導致神經疾病的出現，如:阿爾茨海默病、帕金森病、抑鬱症等，但是還沒有有效的手段來治療這些神經疾病。目前，正常生理活動和致病機制均不清楚，主要的原因在於腦神經網絡連接信息的缺乏。因此，開展腦神經環路的研究而繪製高精度的腦功能連接圖譜，對於了解人的生理活動和致病機制具有重要的意義。我國政府高度重視腦科學的研究，《國家中長期科學和技術發展規劃》將「腦科學與認知科學」列為八大前沿科學問題之一，有一批科學家已投身於該領域的研究，並取得了一系列的成果。2012年，中國科學院啟動了戰略性先導科技專項「腦功能聯結圖譜研究」，並在2014年成立了「腦科學卓越創新中心」。2013年，美國和歐盟已經開始實施人腦圖譜研究計劃。腦科學研究計劃是繼人類基因組計劃後又一個具有挑戰的偉大計劃，該計劃的研究成果將會和人類基因組計劃的成果一樣造福人類。性能優良的神經環路示蹤工具對於順利開展該項目具有十分重要的作用。
[0003]乙型腦炎病毒(Japanese Encephalitis virus, JEV)屬於黃病毒科黃病毒屬，其基因組為單股正鏈RNA，長度約為12kb。基因組編碼的多聚蛋白可切割成3個結構蛋白(C、prM、E)和7個非結構蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。乙型腦炎病毒具有廣泛的宿主範圍，包括:人、豬、鼠、猴、馬、牛、羊、兔、雞、鴨和鳥類等，能夠進入神經系統而引起腦炎。給人類的健康和農業生產帶來了巨大損失。目前，有預防該病毒感染的疫苗，對於保障人類的健康和提高農業生產的效率發揮了重要作用。但是，目前還沒有有效的藥物來特異的治療該病毒感染引起的疾病。另外，乙型腦炎病毒感染腦神經系統的特性使其成為具備解析神經環路的能力。
[0004]隨著分子生物學的不斷發展，科學家已經能夠通過反向遺傳學的手段來定向改造病毒，為深入開展相關的病毒學研究提供了良好的工具。因此，本發明分別採用不同的技術途徑獲得了具有表達綠色螢光蛋白的乙型腦炎病毒全長感染性克隆。將在神經環路標記、抗原表位分析、藥物篩選平臺的建立、藥物抑制乙型腦炎病毒作用機制的分析、乙型腦炎病毒疫苗和診斷試劑的研發、動物模型的建立和病毒複製與致病機制的分析等方面具有廣泛的應用價值和前景。


【發明內容】

[0005]本發明的目的在於提供了一種攜帶綠色突光蛋白(Enhanced Green FluorescentProtein,EGFP)基因的乙型腦炎病毒(Japanese Encephalitis virus, JEV)全長感染性克隆，其序列為SEQ ID NO:22所示。
[0006]本發明的目的在於提供了一種攜帶EGFP基因的乙型腦炎病毒全長感染性克隆的製備方法，方法簡單，易行。
[0007]本發明的目的在於提供了一種攜帶EGFP基因的乙型腦炎病毒全長感染性克隆應用，該全長感染性克隆可應用於腦科學研究和藥物篩選和抗原表位分析，也在藥物抑制乙型腦炎病毒作用機制的分析、乙型腦炎病毒疫苗和診斷試劑的研發、動物模型的建立和病毒複製與致病機制的分析等方面具有廣泛的應用價值。
[0008]為了實現以上目的，本發明採用如下技術方案:
[0009]攜帶EGFP基因的乙型腦炎病毒全長感染性克隆，其構建方法如下:
[0010](I)拼接乙型腦炎病毒全長基因組序列；
[0011]①分節段合成乙型腦炎病毒基因組的互補DNA:以乙型腦炎病毒的全基因組序列(GenBank登陸號AB196923)為對象，並在其基因組的6713位點將原序列的鹼基A變成T，但是沒有改變胺基酸的編碼。分別合成片段F1、F2、F3和F4，每個片段分別連接到載體pUC57。
[0012]F1、F2、F3 和 F4 片段的序列分別為 SEQ ID NO: USEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQID NO:4 所示。
[0013]②乙型腦炎病毒基因組四個片段的拼接:用SalI和KpnI酶切P麗118，採用膠回收的方法回收PMW118的大片段,採用Gibson Assembly Cloning Kit同源重組試劑盒將Fl和F2片段插入到pMWl 18，將重組產物轉化感受態HBlOl，PCR鑑定為陽性的克隆進行培養並抽提質粒進行測序，測序正確的克隆命名為PJEVF1-F2 ;然後使用NaeI和KpnI酶切PJEVF1-F2，採用膠回收的方法回收PJEVF1-F2的大片段，使用濃度為I % (w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量,採用Gibson Assembly Cloning Kit同源重組試劑盒將F3和F4片段插入到PJEVF1-F2，將重組產物轉化感受態HB101，PCR鑑定為陽性的克隆進行培養並抽提質粒進行測序，測序正確的克隆命名為PJEVF1-F2-F3-F4，即為乙型腦炎病毒的全長感染性克隆PJEVFL ；
[0014](2)構建攜帶EGFP基因的乙型腦炎病毒全長感染性克隆；
[0015]①將EGFP基因插入到乙型腦炎病毒的E基因和NSl基因之間:合成序列SEQ ID勵:14，並將該片斷連接進入？此57。以pEGFP-Cl質粒為模板，擴增EGFP片段為SEQ IDNO: 19所示。
[0016]使用SacI酶切pJEVFL,然後採用Gibson Assembly Cloning Kit同源重組試劑盒將SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 19片段插入到pJEVFL，將重組產物轉化感受態HB101，PCR鑑定為陽性的克隆進行培養並抽提質粒進行測序，測序正確的克隆命名為PJEVFL-EGFP，其序列為SEQ ID NO:22所示。
[0017]攜帶EGFP基因的乙型腦炎病毒全長感染性克隆的應用，包括以下應用:
[0018](I)攜帶EGFP基因的乙型腦炎病毒全長感染性克隆(本發明或稱pJEVFL-EGFP)製備病毒的能力:
[0019]用KpnI酶切pJEVFL-EGFP，回收被酶切的產物，使用MEGAscriptT7Transcript1n Kit分別體外轉錄酶切後的pJEVFL-EGFP成為RNA，並轉染BHK21細胞，37°C ,5% (v/v) CO2培養箱中培養，並同時設置未轉染RNA的細胞作為對照組，通過Olympus倒置螢光顯微鏡觀察實驗組和對照組的細胞狀態和螢光表達情況。本發明的全長感染性克隆成功製備表達EGFP的重組JEV (本發明或稱JEV-EGFP)。
[0020](2) JEV-EGFP在研究腦神經環路平臺中的應用:
[0021]取0.3μ1 JEV-EGFP病毒定位注射到鼠嗅球，感染後6天後麻醉動物，分別用
0.9% (V/V)生理鹽水灌流，然後用4% (V/V)多聚甲醛固定，取出腦組織浸泡於4% (V/V)多聚甲醛液中，然後將腦組織先置於20% (V/V)蔗糖溶液中I天，然後置於30% (V/V)蔗糖溶液中2天；將腦組織底部切平，置於底座上包埋冰凍Ih後切片；取腦片後使用螢光顯微鏡觀察。
[0022]所述的應用對象不僅限於鼠，還能用於猴、豚鼠、人、蝙蝠、豬、馬、牛、羊、兔、雞、鴨和鳥等動物的神經環路標記。
[0023](3) JEV-EGFP在分析抗原表位和抗乙型腦炎病毒藥物(抗體藥)篩選中的應用:
[0024]在6孔細胞培養板中接種8Χ 105ΒΗΚ21細胞/孔，在37°C，5% (v/v) CO2培養條件下，匯合度達到90%時。將50 μ I pJEVFL-EGFP PO代病毒液與50 μ I乙型腦炎病毒的抗體混合，37°C吸附30min，然後將該混合液加入各孔，37°C吸附Ih ;吸附完畢後將各個孔的病毒液吸棄，分別加入用含2% (v/v)胎牛血清的DMEM培養基，於37°C ,5% (v/v) CO2的培養箱中培養72h，使用螢光顯微鏡觀察。
[0025]本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果:
[0026]1.本發明製備了表達EGFP的乙型腦炎病毒(JEV-EGFP)，其具有可視化的特點，便於開展相關的研究。目前國內外還沒有用於表達綠色螢光蛋白的重組乙型腦炎病毒，本發明填補了該空白。
[0027]2.本發明對於開展JEV的基礎性研究(如致病機制、複製機制等)和應用性研究(如神經環路標記、藥物篩選、抗原表位分析、新型疫苗和診斷試劑等)具有重要的現實意義和廣泛的應用價值；
[0028]3.解析神經環路結構是開展腦科學研究的基礎，良好用於神經環路標記的工具對於解析神經環路的結構具有重要意義。JEV能夠感染人和鼠等動物的神經細胞，具有作為神經環路標記的潛力。本發明不僅能夠用於鼠等非靈長類動物，而且還能用於非人靈長類動物的腦科學研究。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為一種攜帶EGFP基因的乙型腦炎病毒全長感染性克隆的構建示意圖。
[0030]圖2為一種攜帶EGFP基因的乙型腦炎病毒產生的細胞病變和表達螢光示意圖。
[0031]A:未感染病毒的細胞；
[0032]B JEV-EGFP感染BHK21細胞產生的細胞病變；
[0033]C JEV-EGFP感染BHK21細胞表達螢光蛋白。
[0034]圖3為一種攜帶EGFP基因的乙型腦炎病毒解析鼠腦神經環路的示意圖。
[0035]A: JEV-EGFP 標記鼠嗅球；
[0036]B JEV-EGFP標記鼠梨狀皮層；
[0037]C JEV-EGFP標記鼠前嗅核。
[0038]圖4為一種攜帶EGFP基因的JEV用於抗原表位分析和抑制乙型腦炎病毒的抗體藥的作用示意圖。
[0039]A:不含抗體而含有JEV-EGFP的對照孔；
[0040]B:1:10稀釋的抗體對JEV-EGFP的抑制作用；
[0041 ] C:1:100稀釋的抗體對JEV-EGFP的抑制作用；
[0042]C:不含抗體和病毒的對照孔。

【具體實施方式】
[0043]本發明所述技術方案，如未特別說明，均為本領域的常規技術
[0044]實施例1:攜帶EGFP基因的乙型腦炎病毒全長感染性克隆，其構建方法如下:
[0045](I)拼接JEV全長基因組序列；
[0046]①分節段合成乙型腦炎病毒基因組的互補DNA:以乙型腦炎病毒的全基因組序列(GenBank登陸號AB196923)為對象，並在其基因組的6713位點將原序列的鹼基A變成T，但是沒有改變胺基酸的編碼。分別合成片段F1、F2、F3和F4，每個片段分別連接到載體pUC57。片段的序列為 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID N0:4 所示。為了大量富集目標片段用於後續的基因組組裝，分別採用PCR的方法富集片段EQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4。DNA片段Fl 的引物:SEQ ID N0:5 和 SEQ ID N0:6，DNA 片段F2的引物:SEQ ID N0:7 和 SEQ ID NO:8，DNA 片段 F3 的引物:SEQ ID N0:9 和 SEQ ID NO: 10，DNA 片段 F4 的引物:SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12，另外 SEQ ID NO: 5 含有 T7RNA 聚合酶啟動子序列SEQ ID NO: 13 ；
[0047]本發明所有PCR所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR的反應體系均為 50 μ 1:5XQ5React1n Buffer:10 μ I, 1mM dNTPs:1 μ 1,10 μ M ForwardPrimer:2.5 μ 1,10 μ M Reverse Primer:2.5 μ I,Template DNA:0.5 μ I,Q5High-FideIityDNA Polymerase:0.5 μ I, Nuclease-Free Water:33 μ I。擴增條件為:98°C 30s,98°C 5s,55°C 10s,72°C 40s, 72°C 2min,4°C 10min，30 個循環；
[0048]②JEV基因組四個片段的拼接:採用Gibson Assembly Cloning Kit同源重組的方法，將擴增的四個片段連接到低拷貝載體P麗118。用SalI和KpnI酶切p麗118，採用膠回收的方法回收P麗118的大片段，使用濃度為1% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量，米用Gibson Assembly Cloning Kit將Fl和F2片段插入到pMWl 18,將重組產物轉化感受態HB101，PCR鑑定為陽性的克隆進行培養並抽提質粒進行測序，測序正確的克隆命名為PJEVF1-F2；
[0049]然後使用NaeI和KpnI酶切pJEVFl_F2，採用膠回收的方法回收pJEVFl_F2的大片段，使用濃度為1% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量,採用Gibson Assembly CloningKit將F3和F4片段插入到PJEVF1-F2，將重組產物轉化感受態HB101，PCR鑑定為陽性的克隆進行培養並抽提質粒進行測序，測序正確的克隆命名為PJEVF1-F2-F3-F4，即為JEV病毒的全長感染性克隆PJEVFL ；
[0050]鑑定PJEVF1-F2所用的引物為片段Fl的引物為SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO:6 ；
[0051]鑑定PJEVF1-F2-F3-F4所用的引物為片段F2的引物為SEQ ID N0:9和SEQ IDNO:10 ；
[0052](2)構建攜帶EGFP基因的乙型腦炎病毒全長感染性克隆；
[0053]①將EGFP基因插入到JEV的E基因和NSl基因之間:為了便於後續克隆的構建和避免病毒內部發生同源重組，採用基因片段合成的方法合成序列SEQ ID N0:14，並將該片斷連接進入 PUC57。使用 NEB Q5High-Fidelity DNA Polymerase 擴增 SEQ ID NO: 14。DNA片段 SEQ ID N0:14的引物:SEQ ID NO: 15 和 SEQ ID NO: 16。SEQ ID NO: 14 含有合成的 E基因的C端部分序列SEQ ID NO: 17，合成的NSl基因的N端部分序列SEQ ID NO: 18。
[0054]另外，以pEGFP-Cl質粒為模板，擴增EGFP片段SEQ ID NO: 19。擴增DNA片段SEQID NO: 19的引物:SEQ ID NO: 20和SEQ ID NO: 21。使用濃度為1% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物,並使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒分別回收DNA片斷,使用Thermo ScientificNanoDrop 2000測定DNA的濃度，使用濃度為I % (w/v)的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量，並於-20°C保存備用；
[0055]PCR 的反應體系均為 50μ 1:5XQ5React1n Buffer:10 μ 1，1mM dNTPs:1 μ I,10 μ M Forward Primer:2.5 μ 1,10 μ M Reverse Primer:2.5 μ I, Template DNA:0.5 μ I,Q5High-Fidelity DNA Polymerase:0.5μ I, Nuclease-Free Water:33 μ L.擴增條件為:98°C 30s, 98°C 5s, 55°C 10s,72°C 40s, 72°C 2min,4°C 10min，30 個循環；
[0056]使用SacI 酶切 pJEVFL,然後米用 Gibson Assembly Cloning Kit 將 SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 19片段插入到pJEVFL，將重組產物轉化感受態HB101，PCR鑑定為陽性的克隆進行培養並抽提質粒進行測序，測序正確的克隆命名為PJEVFL-EGFP，其序列為SEQ ID NO:22所示。
[0057]實施例2:pJEVFL-EGFP成功製備出表達EGFP的JEV，其步驟是:
[0058]用KpnI酶切pJEVFL-EGFP，使用濃度為I % (w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物，並使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒分別回收被酶切的產物，使用Thermo Scientific NanoDrop2000測定DNA的濃度，使用濃度為1% (w/v)的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量，並於-20°C保存備用；使用MEGAscript T7Transcript1n Kit分別體外轉錄酶切後的pJEVFL-EGFP,成為RNA，並轉染BHK21細胞，37°C，5% (v/v) CO2培養箱中培養，並同時設置未轉染RNA的細胞作為對照組，通過倒置螢光顯微鏡(Olympus)觀察實驗組和對照組的細胞狀態和螢光表達。
[0059]未轉染pJEVFL-EGFP RNA的細胞，無細胞病變發生(圖2A)，在明場下觀察轉染pJEVFL-EGFP RNA的BHK21細胞，可見明顯的細胞病變(圖2B)，表明已經產生了重組病毒；在相同的視野下，使用藍色激發螢光，可見明顯的綠色(圖2C)，表明重組病毒可以表達攜帶的外源基因綠色螢光蛋白。以上數據表明攜帶EGFP基因的重組乙型腦炎病毒全長感染性克隆具有製備乙型腦炎病毒及表達外源基因的能力，按常規方法搜集製得的。
[0060]以下應用實施例均使用的是本實施例製備的由pJEVFL-EGFP成功製備出的表達綠色螢光蛋白的JEV (JEV-EGFP)，使用的病毒滴度為3 X 106PFU/ml。
[0061 ] 實施例3 JEV-EGFP在解析腦神經環路中的應用，其步驟是:
[0062]取0.3 μ I實施例2製備的重組JEV (JEV-EGFP)定位注射到鼠嗅球，感染後6天後麻醉動物，分別用0.9% (V/V)生理鹽水灌流，然後用4% (V/V)多聚甲醛固定，取出腦組織浸泡於4% (V/V)多聚甲醛液中，然後將腦組織先置於20% (V/V)蔗糖溶液中I天，然後置於30% (V/V)蔗糖溶液中2天；將腦組織底部切平，置於底座上包埋冰凍Ih後切片；挑取腦片使用螢光顯微鏡觀察。在重組病毒注射到嗅球的一個點之後，可見明顯的螢光呈環狀的標記，表明重組病毒能夠在鼠腦內產生病毒，且該病毒具有表達綠色螢光蛋白的能力(圖3A)，進一步分析與嗅球相連接的腦區，可見在鼠腦的梨狀皮層(圖3B)和鼠腦的前嗅核(圖3C)均有綠色螢光蛋白的表達，表明重組的病毒能夠在神經網絡中運輸，具有標記腦神經環路的能力。
[0063]實施例4 JEV-EGFP在分析抗原表位和篩選抗JEV藥物(抗體藥)中的應用，其步驟是:
[0064]在6孔細胞培養板中接種8X 105BHK21細胞/孔，在37°C，5% (v/v) CO2培養條件下，匯合度達到90%時。將50 μ I實施例2製備的重組JEV (JEV-EGFP) PO代病毒液與50 μ IJEV的E蛋白多克隆抗體(濃度分別為1: 10和1:100稀釋)混合，37°C吸附30min，然後將該混合液加入各孔，37°C吸附Ih ;吸附完畢後將各個孔的病毒液吸棄，分別加入用含2%(v/v)胎牛血清的DMEM培養基，於37°C ,5% (v/v) CO2的培養箱中培養72h，使用螢光顯微鏡觀察。
[0065]乙型腦炎病毒感染細胞是通過病毒表面的配體(抗原)與細胞表面的受體結合而引導病毒進入細胞，一蛋白配體與細胞表面受體類似物結合之後則無法引導病毒進入細胞，針對病毒抗原的抗體具有類似細胞表面受體的性質，病毒抗原能夠通過特定的表位與抗體結合。基於此原理，該實施例將表達綠色螢光蛋白的乙型腦炎病毒分別與不同含量的抗體體外孵育，然後再感染細胞，檢測其螢光的表達。在不含抗體而含有重組乙型腦炎病毒的對照孔，螢光分布於整個視野(圖4A)。而當與抗體體外孵育後再感染BHK21細胞，則嚴重的影響了病毒進入細胞的能力(圖4B和4C)，只含有抗體而未感染病毒的細胞組未見細胞病變和綠色螢光蛋白(圖4D)。該實施例表明該重組病毒的配體與其對應的抗體通過特定抗原表位的結合而抑制病毒進入細胞，一方面提示該病毒能夠用於分析抗原表位；另一方面提示該重組病毒能夠用於篩選抗乙型腦炎病毒藥物(如抗體藥)。
[0066]最後，還需要注意的是，上述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法，並且以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限於以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護範圍。
【權利要求】
1.一種攜帶綠色螢光蛋白基因的乙型腦炎病毒全長感染性克隆，其序列為SEQ IDN0.22所示。
2.權利要求1所述的全長感染性克隆，其構建方法如下: (1)拼接乙型腦炎病毒全長基因組序列； ①分節段合成乙型腦炎病毒基因組的互補DNA:合成片段F1、F2、F3和F4，每個片段分別連接到載體pUC57 ;F1、F2、F3和F4片段的序列分別為SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQID NO: 3、SEQ ID NO:4 所示； ②乙型腦炎病毒基因組四個片段的拼接:用SalI和KpnI酶切P麗118，採用膠回收的方法回收PMW118的大片段,採用Gibson Assembly Cloning Kit同源重組試劑盒將Fl和F2片段插入到PMWl 18，將重組產物轉化感受態HBlOl，PCR鑑定為陽性的克隆進行培養並抽提質粒進行測序，測序正確的克隆命名為PJEVF1-F2 ;然後使用NaeI和KpnI酶切pJEVFl_F2，採用膠回收的方法回收PJEVF1-F2的大片段，使用濃度為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量，採用Gibson Assembly Cloning Kit同源重組試劑盒將F3和F4片段插入到pJEVFl_F2，將重組產物轉化感受態HB101，PCR鑑定為陽性的克隆進行培養並抽提質粒進行測序，測序正確的克隆命名為PJEVF1-F2-F3-F4，即為乙型腦炎病毒的全長感染性克隆pJEVFL ； (2)構建攜帶EGFP基因的JEV全長感染性克隆； ①將EGFP基因插入到乙型腦炎病毒的E基因和NSl基因之間:合成序列SEQ IDN0:14，並將該片斷連接進入pUC57;以pEGFP-Cl質粒為模板，擴增EGFP片段為SEQ IDNO: 19所示； 使用SacI酶切pJEVFL,然後採用Gibson Assembly Cloning Kit同源重組試劑盒將SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 19片段插入到pJEVFL，將重組產物轉化感受態HB101, PCR鑑定為陽性的克隆進行培養並抽提質粒進行測序，測序正確的克隆命名為PJEVFL-EGFP，其序列為SEQ ID NO:22所示。
3.權利要求1所述的全長感染性克隆製備出的重組病毒。
4.權利要求1所述的全長感染性克隆在製備攜帶綠色螢光蛋白基因的重組乙型腦炎病毒中的應用。
5.權利要求1所述的全長感染性克隆或權利要求3所述的重組病毒在製備研究腦神經環路平臺中的應用。
6.權利要求1所述的全長感染性克隆或權利要求3所述的重組病毒在製備抗乙型腦炎病毒藥物中的應用。
7.權利要求1所述的全長感染性克隆或權利要求3所述的重組病毒在製備研究乙型腦炎病毒抗原表位中的應用。
【文檔編號】G01N21/64GK104357459SQ201410618042
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月4日 優先權日:2014年11月4日
【發明者】賈凡, 朱續濤, 徐富強 申請人:中國科學院武漢物理與數學研究所