一種定量數字顯微相襯成像的方法

2023-06-15 22:02:16 2

專利名稱：一種定量數字顯微相襯成像的方法
技術領域：
本發明涉及一種定量數字顯微相襯成像的方法，具體地說，是一種在普通數字光學顯微鏡平臺上，不需要增加複雜的光學部件，基於數值算法實現相襯成像，提高透明或半透明樣本成像的襯度，屬於顯微光學成像技術領域。
背景技術：
生物學及醫學研究中，經常需要觀察一些很重要的透明生物體或組織(如細胞)，由於光通過這類物體以後強度不發生顯著變化，而相位會發生偏移，用普通透射顯微鏡成像時，生物體的結構將消失在其周圍的介質中。為了在光學顯微鏡下觀察與研究這類生物體，研究人員一般採用染色的辦法，但是這種辦法會給有機體的生命力帶來有害的影響，而且多數沾染程序都需要對細胞或組織進行固定，這通常是比較複雜和困難的。相襯顯微鏡能夠把光通過透明生物體後相位的變化轉換為強度信息，從而方便觀察透明組織的結構信息，因此在生物學、醫學、材料學和晶體學等領域得到廣泛應用。
但是，相襯顯微鏡需要昂貴、複雜的光學部件，且不同倍數的物鏡需要不同相襯器件，調整困難；另外，利用相襯顯微鏡雖可以觀察相位樣本，卻不能直接從觀測樣本圖像定量地分析出相位信息。一種更好的方法就是把光通過透明生物體後相位的變化轉換為強度信息來觀察透明生物體的結構信息，這就是光學顯微鏡應用中的相位恢復問題。
相位恢復是數字顯微相襯成像的關鍵技術。根據獲取方式，顯微相位恢復方法可以分為直接法和間接法。直接法是經典的、傳統的相位恢復方法，如M.弗朗松著(張炳勳譯)「相襯顯微鏡與幹涉顯微鏡」文中所介紹的澤爾尼克相襯法。直接法是在顯微鏡上安裝特定的光學部件，把相位樣本結構所引起的相差信息轉化為光強度信息，直接顯示出來。該方法的缺點是這些光學部件昂貴、複雜，且不同倍數的物鏡需要不同相襯器件，調整困難；另外，直接法雖可以提供好的相位樣本的觀察圖像，但是不能直接地從觀測樣本圖像定量地分析出相位信息。隨著信息光學技術的發展，由光強度來恢復光相位的間接方法受到研究人員的重視，與直接相位恢復方法相比較，該類方法不需要複雜的光學部件，一般也不需要強的光源相干性。由光強度分布恢復相位的方法大體可分為兩類迭代相位恢復算法體系和基於光強度傳輸方程(Transport of Intensity Equation，TIE)的相位恢復方法。由於迭代算法存在收斂性、解的存在性和唯一性等問題，在定量顯微相位恢復及相襯成像領域，一般採用基於光強度傳播方程的方法來恢復光的相位信息，如C.J.，貝拉爾、C.L.柯爾、B.E.阿爾曼等所著的「定量相位幅值顯微鏡IV厚樣本成像.」文中通過建立並求解光強度傳送方程恢復相位信息。基於光強度傳輸方程(Transport of Intensity Equation，TIE)的方法通過引入一個輔助函數，可以把光強度傳輸方程轉化為一個二維Poisson方程。由於二維相位恢復問題的邊界區域為矩形區域，離散化後的Poisson方程的塊結構非常有規則，因此可用T.E.古熱逸夫，K.A.紐根特.「利用光強度傳播方程實現快速定量相位成像」中所描述的離散的Fourier分析方法或薛斌黨、鄭世玲、姜志國所著的「完全多重網格法求解光強度傳播方程的相位恢復方法」文中所描述的多重網格方法(Multigrid method，MG)求解光強度傳輸方程。但是，如L.J.阿雷恩，M.P.奧克雷所著的.「基於錯焦圖像序列的相位恢復.」文中所分析的Fourier變換方法求解TIE實現相位恢復是一種近似數值解法，對複雜分布相位，該方法可能無法得到正確的結果。一般多重網格法求解光強度傳輸方程時，在每層網格上都需要給定初值，然後用Jacobi迭代法或者Gauss-Seidel迭代法解此層網格上的線性方程組，初值的選擇影響光滑迭代的效率。初值接近真實解，算法迭代收斂速度會越快，否則，需要足夠的循環後，才能達到所需收斂的收斂狀態。
目前，國內在顯微成像領域，定量相位恢復及其成像技術的研究和應用還是空白。在國外，IATIA公司(www.iatia.org.au)2002年推出了一個具有一定的定量相差分析功能的顯微成像系統，並申請了專利，如K.A.紐根特，D.帕蓋因，Anton，巴爾特.「輻射波場的相位測定」。但是，該系統仍然需要一個結構複雜、價格昂貴的相差管來獲取顯微圖像序列；另外，該系統求解光強度傳送方程時需要做嚴格的先驗假設條件，而且定量相位恢復算法對噪聲魯棒性比較差。

發明內容
1、目的本發明的目的是提供一種定量數字顯微相襯成像的方法，它克服了現有技術的不足，是一種魯棒性高且不需要特殊光學部件的定量顯微相襯成像技術，在普通光學明場透射光學顯微鏡平臺上，通過本發明的相位恢復數值算法，快速實現定量顯微相襯成像和定量相位分析。
2、技術方案 本發明具體實施所需設備條件是①一臺普通明場光學透射數碼顯微鏡系統，；②數字相位恢復用計算機為普通的PIV3.4Ghz 1G RAM微機，如附圖1所示；③數碼顯微鏡的物理參數為物鏡40X，攝像頭型號M1500，攝像頭CCD晶片像素尺寸4.65微米，三目攝像接頭0.65X，圖像解析度為696X520，比例尺為0.35微米/像素。
本發明具體實施所需環境條件是普通明場光學透射數碼顯微鏡成像環境。
本發明在普通光學明場透射光學顯微鏡平臺上，不需要特殊光學部件，用戶只需要採集三幅樣本的亮背景顯微圖像，通過本發明即可實現快速定量顯微相襯成像和定量相位分析。
本發明是一種定量數字顯微相襯成像的方法，該方法的具體步驟如下 步驟一建立光強度傳播方程並對其進行離散化處理 在傍軸近似條件下，建立光強度傳播方程並將其轉化為一個橢圓型偏微分方程；然後，利用五點有限差分法，將轉化的光強度傳播方程離散化處理。
先定義一些符號λ表示波長；k＝2π/λ是波數；r⊥是平面x-y上的矢量，垂直於光軸Z；I(r⊥，z)為光的強度；φ(r⊥，z)為光的相位；是平面x-y上梯度算子；

為給定z，在由變量r⊥所確定的平面上，在光波傳播方向上光強度的導數。
在傍軸近似情況下，光強度傳播方程(Transport of Intensity Equation，TIE)可以表示為 設P是平面x-y中具有光滑邊界

的一個區域，假設在區域P內，I(r⊥，z)＞0，同時假設

是連續的，那麼在給定I(r⊥，z)和

時，TIE具有唯一解，即獲取光強度沿光軸的變化率，通過求解TIE可以得到唯一的

由於不能精確測量光強在光軸方向的變化率，通常計算兩個輸出面上光強差分近似表示光強度變化率。
設輸入面和輸出面均垂直於光軸z，並設輸入面位於z＝0平面上，輸出面位於輸入面前後平面即z＝±Δz平面上，不同平面上光的強度分布為I(r⊥，z0)、I(r⊥，zΔz)和I(r⊥，z-Δz)。光強度在光軸方向的變化率可以近似表示為 如果將方程(1)的左端擴展為 那末，可以將方程(1)改寫為如下形式 利用五點有限差分法，可以將方程(3)離散化處理。同光強變化率計算方法相同，相位的偏導數根據如下公式近似計算 公式(4)中，h為x和y方向上相同的離散化採用間隔，(i，j)表示平面x-y上離散點的坐標位置。離散後的方程形式如下 方程(5)中， 為了描述方便，進一步將方程(5)簡化為如下的橢圓型微分方程邊值形式
其中，P是平面x-y中具有光滑邊界Γ的一個區域，L是橢圓微分算子。已知輸入平面和兩個輸出平面上光強度，就可以用多重網格方法求解方程(6)，實現輸入平面上的相位恢復。
步驟二設計離散化後的光強度傳播方程數值算法 本發明設計一種集成完全多重網格算法(Full Multigrid method，FMG)和預處理共軛梯度算法(Preconditioned conjugate gradient algorithm，P-CG)優點的混合算法，即FMG-CG算法，求解TIE，實現定量相位恢復。
FMG-CG算法求解光強度傳播方程相位恢復的基本步驟如下 ①用五點有限差分法將TIE離散化，得到形如LΦ＝A的方程組； ②初始化Φ0，計算r0＝A-LΦ0，z0＝FMG(L，r0)，p0＝z0.j＝0； ③ ④Φj+1＝Φj+αjpj； ⑤rj+1＝rj-αjLpj； ⑥zj+1＝FMG(L，rj+1)； ⑦ ⑧pj+1＝zj+1+βjpj ⑨檢驗是否收斂，否則令j＝j+1，轉上述③； FMG-CG算法中，本發明選擇Jacobi迭代法作為光滑迭代算子，插值算子I2kk採用循環周期邊界的分片線性插值算子，插值模板為一般選擇插值算子的伴隨算子作為限制算子，本發明選擇半加權限制算子，限制算子模板為 步驟三光強度數據採集 在普通光學明場透射光學顯微鏡平臺上，首先，採集焦平面上顯微樣本的圖像。可以通過手動調焦的方式採集焦平面上實驗用圖像數據。對於自動顯微鏡，由於具有Z軸方向的自動聚焦功能，可以採用文獻7中所介紹的自動聚焦算法，實施快速聚焦及圖像採集。接著，控制載物臺移動，在上下錯焦平面上分別採集實驗用圖像數據。
步驟四定量相位恢復及相襯成像 基於上述採集的焦平面上圖像和上下錯焦平面上的兩幅圖像，計算強度在光軸方向的變化率，利用本發明的技術求解光強度傳播方程(5)，實現定量相位恢復和顯微相襯成像。
3、優點及效果本發明的定量顯微相位成像技術與國外現有技術相比的優點在於①不需要特殊的光學部件如相位環、相位板或相差管等，可直接應用於普通明場光學顯微鏡平臺的定量相襯成像；②可以處理複合光條件下的相位成像；③定量相位恢復方法對噪聲魯棒性高，對光源的相干性要求弱；④已經成功地基於普通光學明場透射光學顯微鏡實現了數字相襯成像；⑤本發明還可適用於其他模態的顯微成像系統，如共聚焦顯微鏡成像系統的定量相位分析即相襯成像。


圖1本發明中實驗用成像明場光學顯微鏡及定量相位恢復計算機系統示意圖； 圖2本發明中基於FMG-CG算法求解TIE實現定量相位恢復流程圖； 圖3本發明中測試用模擬實驗數據示意圖，(a為模擬強度分布；b為模擬相位分布)； 圖4本發明中基於測試用模擬實驗數據，生成的不同焦平面上的光的強度分布(a為錯焦距離Δz＝-0.1mm平面上光的強度分布；b為錯焦距離Δz＝0.1mm平面上光的強度分布)； 圖5本發明中基於測試用模擬實驗數據，定量恢復的相位分布(a為多重網格求解光強度傳播方程即MG-TIE相位恢復結果，b為完全多重網格求解光強度傳播方程即FMG-TIE相位恢復結果，c為本發明方法求解光強度傳播方程即FMG-CG-TIE相位恢復結果)； 圖6本發明中基於普通光學明場透射光學顯微鏡，實現的定量相襯成像結果。(a為普通明場光學顯微鏡成像，b為基於焦平面和上下兩個錯焦平面上共三幅圖像恢復的數字相襯成像)； 圖中符號說明如下 1普通明場光學透射數碼顯微鏡； 2普通計算機主機； 3普通計算機顯示器。
具體實施例方式 本發明具體實施所需設備條件是①一臺普通明場光學透射數碼顯微鏡系統，；②數字相位恢復用計算機為普通的PIV3.4Ghz 1G RAM微機，如附圖1所示；③數碼顯微鏡的物理參數為物鏡40X，攝像頭型號M1500，攝像頭CCD晶片像素尺寸4.65微米，三目攝像接頭0.65X，圖像解析度為696X520，比例尺為0.35微米/像素。
本發明具體實施所需環境條件是普通明場光學透射數碼顯微鏡成像環境。
本發明一種定量數字顯微相襯成像的方法，該方法中定量相位恢復的流程如附圖2所示。
該方法具體實施步驟如下 步驟一建立光強度傳播方程並對其進行離散化處理 在傍軸近似情況下，光強度傳播方程(Transport of Intensity Equation，TIE)可以表示為 上式中，λ表示波長；k＝2π/λ是波數；r⊥是平面x-y上的矢量，垂直於光軸Z；I(r⊥，z)為光的強度；φ(r⊥，z)為光的相位；是平面x-y上梯度算子；

為給定z，在由變量r⊥所確定的平面上，在光波傳播方向上光強度的導數。
設P是平面x-y中具有光滑邊界

的一個區域，假設在區域P內，I(r⊥，z)＞0，同時假設

是連續的，那麼在給定I(r⊥，z)和

時，TIE具有唯一解，即獲取光強度沿光軸的變化率，通過求解TIE可以得到唯一的

由於不能精確測量光強在光軸方向的變化率，通常計算兩個輸出面上光強差分近似表示光強度變化率。
設輸入面和輸出面均垂直於光軸z，並設輸入面位於z＝0平面上，輸出面位於輸入面前後平面即z＝±Δz平面上，不同平面上光的強度分布為I(r⊥，z0)、I(r⊥，zΔz)和I(r⊥，z-Δz)。光強度在光軸方向的變化率可以近似表示為 如果將方程(1)的左端擴展為 那末，可以將方程(1)改寫為如下形式 利用五點有限差分法，可以將方程(3)離散化處理。同光強變化率計算方法相同，相位的偏導數根據如下公式近似計算 公式(4)中，h為x和y方向上相同的離散化採用間隔，(i，j)表示平面x-y上離散點的坐標位置。離散後的方程形式如下 方程(5)中， 為了描述方便，進一步將方程(5)簡化為如下的橢圓型微分方程邊值形式
其中，P是平面x-y中具有光滑邊界Γ的一個區域，L是橢圓微分算子。已知輸入平面和兩個輸出平面上光強度，就可以用多重網格方法求解方程(6)，實現輸入平面上的相位恢復。
步驟二設計離散化後的光強度傳播方程數值算法 本發明設計一種集成完全多重網格算法(Full Multigrid method，FMG)和預處理共軛梯度算法(Preconditioned conjugate gradient algorithm，PCG)優點的混合算法，即FMG-PCG算法，求解TIE，實現定量相位恢復。
FMG-CG算法求解光強度傳播方程相位恢復的基本步驟如下 ①用五點有限差分法將TIE離散化，得到形如LΦ＝A的方程組； ②初始化Φ0，計算r0＝A-LΦ0，z0＝FMG(L，r0)，p0＝z0.j＝0； ③ ④Φj+1＝Φj+αjpj； ⑤rj+1＝rj-αjLpj； ⑥zj+1＝FMG(L，rj+1)； ⑦ ⑧pj+1＝zj+1+βjpj ⑨檢驗是否收斂，否則令j＝j+1，轉上述③. FMG-CG算法中，本發明選擇Jacobi迭代法作為光滑迭代算子，插值算子I2kk採用循環周期邊界的分片線性插值算子，插值模板為一般選擇插值算子的伴隨算子作為限制算子，本發明選擇半加權限制算子，限制算子模板為 步驟三光強度數據生成及採集 本發明實驗實施中，通過兩種方式獲取光強度數據。
方案一仿真實驗數據 仿真實驗選擇3幅含有豐富細節的圖像作為設想的輸入焦平面上光強度和相位分布，分別如附圖3(a)、圖3(b)所示，其像元數為256×256，物理尺寸為1×1mm2，波長λ＝550nm，相位值在
弧度之間變化，強度值在
之間變化。利用文獻8中所介紹的平面波角譜傳播公式，計算不同輸出平面上光強度分布，如附圖4所示。
方案二明場光學顯微鏡平臺上採集的光強度數據 在普通光學明場透射光學顯微鏡平臺上，首先，採集焦平面上顯微樣本的圖像。可以通過手動調焦的方式採集焦平面上實驗用圖像數據。對於自動顯微鏡，由於具有Z軸方向的自動聚焦功能，可以採用文獻7中所介紹的自動聚焦算法，實施快速聚焦及圖像採集。
接著，控制載物臺移動，在上下錯焦平面上分別採集實驗用圖像數據。
步驟四定量相位恢復及相襯成像 本發明實驗實施中，設計兩種方案進行相位位恢復及相襯成像實驗。
方案一基於仿真實驗數據的定量相位恢復 基於仿真實驗數據進行定量相位恢復能夠準確測試本發明的相位恢復效率及準確度。在PIV3.4Ghz 1G RAM微機上做模擬相位恢復實驗。對比了MG法、FMG法和本發明方法(FMG-CG法)求解光強度傳播方程相位恢復的計算效率和相位恢復精度。採用相對均方根誤差(root mean square，RMS)定量評估相位恢復精度，它的定義為 其中，φijtrue表示輸入面模擬真實相位某個元素(i，j)的相位值，φijrec表示相位恢復算法恢復的相位某個元素(i，j)的相位值。
另外，模擬相位恢復實驗中，為了對比在相同初始解條件下，不同方法求解TIE的收斂速度和求解精度，光強度傳播方程的初始解都假設為0。
利用仿真得到的不同輸出平面上光的強度，通過求解TIE，恢復出輸入面上光的相位信息如圖5所示，其中多重網格的V循環迭代次數均設定為10次。附表1對比了三種方法求解TIE相位恢復的計算時間和相位恢復的相對均方根誤差。
從上述相位恢復仿真實驗結果可以看出，在相同初始值條件下，本發明的方法在相位恢復精度和算法收斂速度上都優於MG和FMG相位恢復的結果。
方案二明場光學顯微鏡平臺上的相位恢復及相襯成像實驗 在附圖1所示MoticBA600普通明場光學透射數碼顯微鏡系統進行定量相位恢復及相襯成像實驗。基於採集的焦平面上圖像和上下錯焦平面上的兩幅圖像，計算強度在光軸方向的變化率，利用本發明的技術求解離散化處理後的光強度傳播方程(5)，實現定量相位恢復和顯微相襯成像。相襯成像結果如附圖6所示，其中圖6(a)所示為普通明場光學顯微鏡成像，6(b)所示為基於本發明方法實現的數字相襯圖像。可以看出，相襯圖像展現了樣本的結構信息，便於觀察樣本不同區域的細節對比信息。
表1本發明基於仿真圖像數據進行相位恢復實驗的誤差及算法效率比較。


權利要求
1、一種定量數字顯微相襯成像的方法，它是在普通數字光學顯微鏡平臺和普通個人用計算機上實現的，其特徵在於該方法具體步驟如下
步驟一建立光強度傳播方程並對其進行離散化處理
在傍軸近似條件下，建立光強度傳播方程並將其轉化為一個橢圓型偏微分方程；然後，利用五點有限差分法，將轉化的光強度傳播方程離散化處理；
符號定義為λ表示波長；k＝2π/λ是波數；r⊥是平面x-y上的矢量，垂直於光軸Z；I(r⊥，z)為光的強度；φ(r⊥，z)為光的相位；是平面x-y上梯度算子；
為給定z，在由變量r⊥所確定的平面上，在光波傳播方向上光強度的導數；
在傍軸近似情況下，光強度傳播方程TIE可以表示為
設P是平面x-y中具有光滑邊界
的一個區域，假設在區域P內，I(r⊥，z)＞0，同時假設
是連續的，那麼在給定I(r⊥，z)和
時，TIE具有唯一解，即獲取光強度沿光軸的變化率，通過求解TIE可以得到唯一的
由於不能精確測量光強在光軸方向的變化率，通常計算兩個輸出面上光強差分近似表示光強度變化率；
設輸入面和輸出面均垂直於光軸z，並設輸入面位於z＝0平面上，輸出面位於輸入面前後平面即z＝±Δz平面上，不同平面上光的強度分布為I(r⊥，z0)、I(r⊥，zΔz)和I(r⊥，z-Δz)；光強度在光軸方向的變化率可以近似表示為
如果將方程(1)的左端擴展為
那末，可以將方程(1)改寫為如下形式
利用五點有限差分法，可以將方程(3)離散化處理；同光強變化率計算方法相同，相位的偏導數根據如下公式近似計算
公式(4)中，h為x和y方向上相同的離散化採用間隔，(i，j)表示平面x-y上離散點的坐標位置，離散後的方程形式如下
方程(5)中，
將方程(5)簡化為如下的橢圓型微分方程邊值形式
其中，P是平面x-y中具有光滑邊界Γ的一個區域，L是橢圓微分算子；已知輸入平面和兩個輸出平面上光強度，就可以用多重網格方法求解方程(6)，實現輸入平面上的相位恢復；
步驟二設計離散化後的光強度傳播方程數值算法
設計一種集成完全多重網格算法即FMG和預處理共軛梯度算法即P-CG優點的混合算法，即FMG-CG算法，求解TIE，實現定量相位恢復；
FMG-CG算法求解光強度傳播方程相位恢復的基本步驟如下
①用五點有限差分法將TIE離散化，得到形如LΦ＝A的方程組；
②初始化Φ0，計算r0＝A-LΦ0，z0＝FMG(L，r0)，p0＝z0·j＝0；
③
④Φj+1＝Φj+αjpj；
⑤rj+1＝rj-αjLpj；
⑥zj+1＝FMG(L，rj+1)；
⑦
⑧pj+1＝zj+1+βjpj；
⑨檢驗是否收斂，否則令j＝j+1，轉上述③；
FMG-CG算法中，選擇Jacobi迭代法作為光滑迭代算子，插值算子I2kk採用循環周期邊界的分片線性插值算子，插值模板為一般選擇插值算子的伴隨算子作為限制算子，在這裡選擇半加權限制算子，限制算子模板為
步驟三光強度數據採集
在普通光學明場透射光學顯微鏡平臺上，首先，採集焦平面上顯微樣本的圖像；可以通過手動調焦的方式採集焦平面上實驗用圖像數據；對於自動顯微鏡，由於具有Z軸方向的自動聚焦功能，可以採用自動聚焦算法，實施快速聚焦及圖像採集；接著，控制載物臺移動，在上下錯焦平面上分別採集實驗用圖像數據；
步驟四定量相位恢復及相襯成像
基於上述採集的焦平面上圖像和上下錯焦平面上的兩幅圖像，計算強度在光軸方向的變化率，利用技術求解光強度傳播方程，實現定量相位恢復和顯微相襯成像。
全文摘要
本發明是一種定量數字顯微相襯成像的方法，它是在普通數字光學顯微鏡平臺和普通個人用計算機上實現的。該方法有四大步驟步驟一建立光強度傳播方程並對其進行離散化處理；步驟二設計離散化後的光強度傳播方程數值算法；步驟三光強度數據採集；步驟四定量相位恢復及相襯成像。本發明是在普通數字光學顯微鏡平臺上，不需要增加複雜的光學部件，基於相位恢復數值算法實現相襯成像，提高透明或半透明樣本成像的襯度，快速實現定量顯微相襯成像和定量相位分析。它還適用於其他模態的顯微成像系統。本發明在顯微光學成像技術領域內具有廣泛的實用價值和應用前景。
文檔編號G02B21/00GK101576650SQ20091008659
公開日2009年11月11日 申請日期2009年6月12日 優先權日2009年6月12日
發明者薛斌黨, 鄭世玲 申請人:北京航空航天大學