一種落花生莖葉藥材的指紋圖譜建立方法
2023-06-16 06:21:21 2
一種落花生莖葉藥材的指紋圖譜建立方法
【專利摘要】本發明提供了一種河北產落花生莖葉藥材指紋圖譜的建立方法，所建立的方法包括採用高效液相色譜法檢測河北產落花生莖葉藥材中的原兒茶酸，液相色譜條件包括：色譜柱為以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充材料；流動相包括：流動相A為乙腈，流動相B為酸性水溶液，進行梯度洗脫；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：210nm~400nm；理論塔板數按原兒茶酸峰計算，應不低於6000。採用本發明的建立方法，可有效獲得能夠全面表徵河北產落花生莖葉藥材活性組分的指紋圖譜，具有精密度、穩定性、重複性高的特點。獲得的指紋圖譜可用於確保河北產落花生莖葉藥材質量的穩定一致，進而保證其用藥的安全性和有效性。
【專利說明】一種落花生莖葉藥材的指紋圖譜建立方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於藥物分析檢測領域，涉及一種落花生莖葉藥材的指紋圖譜建立方法，特別涉及河北產落花生莖葉藥材的高效液相色譜（HPLC)指紋圖譜建立方法。
【背景技術】
[0002]中藥作為多組分複雜體系，其化學成分眾多，測定少數幾種有效成分或指標成分不足以確保藥材或製劑的質量，而宏觀地綜合分析已成為必然的趨勢，中藥指紋圖譜這一質量控制模式便順應了這個趨勢。
[0003]中藥指紋圖譜是指中藥材經過適當的處理後，採用一定的分析手段和儀器檢測得到的能夠標識其中各種組分群體特徵的共有峰的圖譜，是以系統的化學成分研究和藥理學研究為基礎，經化學測定或基因鑑定得到的某種或某產地中藥及其製劑所共有的、具有特異性的組分群體(某類或數類成分）的特徵圖譜或圖像。
[0004]中藥指紋圖譜能比較全面的反映中藥中所含化學成分的種類與數量，尤其是在現階段絕大多數有效成分沒有明確的情況下，雖然它不能代替含量測定，但它比測定任何單一成分所提供的信息都豐富，能更好地反映中藥的內在質量，大大提高中藥質量控制和評價的技術水平和科技含量，成為建立現代中藥質量標準體系的核心。
[0005]落花生莖葉收載於《湖南省中藥材標準》，為豆科落花生屬植物落花生Arachishypogaea L.的乾燥地上部分。本品味甘，性平。具有散瘀消腫，解毒，止汗的功效，用於治療跌打損傷，各種瘡毒和盜汗等症。近年來隨著對其化學成分和藥理活性的深入研究，使得原本作為農作物廢棄物的落花生莖葉藥材得到了合理有效的利用，以落花生莖葉藥材為主要原料的製劑，如落花安神合劑、降壓避風片等被廣泛應用於臨床。
[0006]現有落花生莖葉藥材的質量標準僅從外觀性狀、簡單的薄層鑑別角度對其進行控制，顯然不能全面準確表徵其內在質量。指紋圖譜作為中藥及其提取物成方製劑質量控制的最優方法，已被大家廣為採納。採用中藥指紋圖譜方式，一方面可以通過指紋圖譜的特徵性有效的鑑別樣品的真偽和產地，另一方面通過對主要指紋圖譜特徵峰的面積或比例的控制，能有效控制藥材的質量，確保其質量的均一和穩定，從而保證藥材的安全性和有效性。
【發明內容】
[0007]為了解決上述問題，本發明的目的是提供一種建立落花生莖葉藥材指紋圖譜的方法，該方法建立的指紋圖譜能夠全面表徵落花生莖葉的藥物活性組分，從而表徵和控制其內在質量。
[0008]本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：
[0009]本發明提供了一種落花生莖葉藥材指紋圖譜的建立方法，所述方法包括採用高效液相色譜法檢測落花生莖葉藥材成分，其中，所述高效液相色譜法的條件包括：
[0010]色譜柱：以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充材料；
[0011]流動相：流動相A為乙腈，流動相B為O. 2%體積分數甲酸水溶液，進行梯度洗脫，所述梯度洗脫程序如下，其中流動相比例均為體積百分比：
[0012](Tl5min，流動相A為0?5%，流動相B為100%?5% ；
[0013]15?60min，流動相A為5%?30%，流動相B為95%?70% ；
[0014]6(T80min，流動相 A 為 30%?50%，流動相 B 為 70%?50% ；
[0015]8(Tl00min，流動相 A 為 50%?100%，流動相 B 為 50%?0%。
[0016]優選地，所述高效液相色譜法的條件還包括：
[0017]流速：1.OmL/min ；
[0018]柱溫：30O;
[0019]檢測波長：286nm;
[0020]理論塔板數按原兒茶酸峰計算，應不低於6000。
[0021]優選地，上述建立方法還包括通過以下步驟製備對照品溶液：取原兒茶酸對照品適量，加入甲醇溶解製成每ImL含O. Img的溶液，作為對照品溶液。
[0022]並且，上述建立方法還包括通過以下步驟製備供試品溶液：取河北產落花生莖葉藥材I. Og,置於燒瓶錐形瓶中，加入70%體積分數甲醇水溶液IOOml，超聲提取lh，提取液濃縮至幹，用甲醇溶解轉移至IOml容量瓶中，用O. 45 μ m濾膜濾過，棄去初濾液，取續濾液即得。
[0023]精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μ I注入高效液相色譜儀，根據以下色譜條件進行測定，得到指紋圖譜：
[0024]色譜柱：以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充材料；DiamonSil鑽石I代α8，5μπι，
2.5 X 460mm ;
[0025]流動相：流動相A為乙腈，流動相B為O. 2%體積分數甲酸水溶液，進行梯度洗脫；
[0026]流速：1.OmL/min ；
[0027]柱溫：30°C;
[0028]紫外檢測波長：286nm。
[0029]所述梯度洗脫程序如下，其中流動相比例均為體積百分比：
[0030](Tl5min，流動相A為0?5%，流動相B為100%?5% ；
[0031 ] 15?60min，流動相A為5%?30%，流動相B為95%?70% ；
[0032]6(T80min，流動相 A 為 30%?50%，流動相 B 為 70%?50% ；
[0033]8(Tl00min，流動相 A 為 50%?100%，流動相 B 為 50%?0%。
[0034]根據上述建立方法得到的指紋圖譜中共標記有7個特徵吸收峰，其中峰I為對照品原兒茶酸，各峰以峰I為參照峰的計算相對保留時間和相對峰面積如下：
[0035]相對保留時間：
[0036]峰I ：1. OOO ;峰2 ：1. 182 ;峰3 ：1. 547 ;峰4 ：2. 221 ;峰5 ：2. 244 ;峰6 ：2. 307 ;峰7 ：
4.333 ；
[0037]相對峰面積：
[0038]峰I :1· OOO ;峰2 ：7. 204 ;峰3 ：2. 594 ;峰4 ：1. 452 ;峰5 ：2. 026 ;峰6 ：1. 023 ;峰7 ：
O.421。
[0039]以下是本發明的詳細描述：
[0040]色譜條件：採用梯度洗脫的方式；根據落花生莖葉藥材成分的特點先後嘗試了甲醇-水、甲醇-甲酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液等流動相系統，並且嘗試了多種不同梯度條件，經過對各種色譜圖比較，最後確定乙腈-O. 2%體積分數甲酸水溶液系統，採用梯度洗脫方式，得到的多個色譜峰有較好的分離效果。
[0041]供試品溶液採用二極體陣列檢測器（DAD)在21(T400nm波長範圍內進行全梯度掃描，並對各波長下的色譜圖進行分析比較。結果表明，在286nm波長處，各色譜峰分離良好，特徵峰明顯且峰型較好，從圖譜中可以儘可能的獲取色譜組分信息及反映整體系組成的全貌，因此選定286nm為指紋圖譜測定波長。通過對luna、Diamonsil鑽石I代、Ameritech,菲羅門-ODS等C18色譜柱比較，最終確定用Diamonsil鑽石I代C18 (5ym,2. 5 X 460mm)；柱溫：30°C ;檢測波長：286nm ;流動相A為乙腈，流動相B為O. 2%體積分數甲酸水溶液；洗脫方式：梯度洗脫：洗脫梯度程序為：(Tl5min，流動相A為O?5%，流動相B為100%?5% ；15?60min，流動相A為5%?30%，流動相B為95%?70% ;6(T80min，流動相A為30%?50%，流動相B為70%?50% ;8(Tl00min，流動相A為50%?100%，流動相B為50%?0%。並記錄100分鐘色譜圖。流速：1. Oml/min。進樣量10 μ L。
[0042]優選對照品溶液的製備方法為：取原兒茶酸對照品適量置25ml量瓶中，加甲醇溶解並稀釋至刻度，搖勻，即得。
[0043]優選供試品溶液的製備方法：通過多次的試驗考察確定了本質量控制方法中供試品溶液的製備方法，試驗比較了 50%體積分數乙醇水溶液、70%體積分數乙醇水溶液、50%體積分數甲醇水溶液、70%體積分數甲醇水溶液、甲醇做提取溶劑對指紋圖譜的影響，確定用70%體積分數甲醇水溶液作溶劑效果佳，同時對超聲和回流不同提取方法和不同提取時間做了比較。結果表明使用70%體積分數甲醇水溶液超聲lh，所得色譜峰較多，峰面積較大。因此，優選條件為取河北產落花生莖葉藥材I. Og，置於燒瓶錐形瓶中，加入70%體積分數甲醇水溶液100ml，超聲提取lh，提取液濃縮至幹，用甲醇溶解轉移至IOml容量瓶中，用
O.45 μ m濾膜濾過，棄去初濾液，取續濾液作為供試品溶液。
[0044]以原兒茶酸為參照峰的指紋圖譜的制定：
[0045]精密吸取對照品溶液和供試品溶液，分別注入高效液相色譜儀，依據所得的圖譜，制定標準指紋圖譜。以上述方法作為測試手段，將待測定樣品指紋圖譜與上述標準指紋圖譜對比，計算相似度，應為O. 9(Tl. 00。
[0046]與現有技術相比，本發明提供的河北產落花生莖葉藥材指紋圖譜的建立方法具有以下積極效果：
[0047]本發明首次對河北產落花生莖葉藥材的指紋圖譜進行研究，通過本發明的方法獲得的指紋圖譜能更全面、完善地表徵藥物的有效活性組分及其質量。該方法實現了對河北產落花生莖葉最大可能的化學成分的全面檢測，能有效地表徵其質量。所建立的指紋圖譜可以用於質量控制，在保證藥材均一穩定的同時，確保了製劑產品的安全性和有效性。
[0048]並且，本發明具有方法簡便、穩定、精密度高、重現性好、易於掌握的特點。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0049]圖I為10批河北產落花生莖葉供試品的指紋圖譜疊加圖；
[0050]SI-天津陳咀（2010. 10)S2-天津陳咀(2011. 10) S3-河北香河（2011. 11)S4_ 河北香河（2010. 11) S5-河北香河（2011. 6) S6-河北香河(2011. 11) S7-河北邪臺(2010.6)天津陳咀鎮2010.10
天津陳咀鎮2011.10
河北香河2011.11
河北香河2010.11
河北香河2011.6
河北香河2011.11
河北邢臺2010.6
河北邢臺2011.6
河北邢臺2011.10
河北武安2011.8
四元泵，在線脫氣裝置，自動進樣器，0八0電子天平；超聲儀:[0065]指紋圖譜的測定:吸取上述原兒茶酸對照品溶液和落花生莖葉供試品溶液注入液相色譜儀，按照高效液相色譜法測定，得到河北產落花生莖葉HPLC標準指紋圖譜，其中測定色譜測定條件包括:
[0066]色譜柱為Diamonsil C18 (5 μ m, 2.5 X 460mm),採用流動相A為乙腈,流動相B為
0.2%體積分數甲酸水溶液，梯度洗脫程序見下表2 ;檢測波長為286nm ;柱溫:30°C ;流速:
1.0ml/min,進樣量 10 μ L。
[0067]表2 HPLC梯度洗脫程序
[0068]
[0069]
【權利要求】
1.一種落花生莖葉藥材指紋圖譜的建立方法，其特徵在於：所述方法採用HPLC法，其條件為： 色譜柱：C18烷基矽烷鍵合矽膠為填充材料； 流動相：流動相A為乙腈，流動相B為O. 2%體積分數甲酸水溶液，進行梯度洗脫；檢測波長：286nm。
2.根據權利要求1所述的建立方法，其特徵在於：所述梯度洗脫程序如下，其中流動相比例均為體積百分比： O~15min，流動相A為O~5%，流動相B為100%~5% ； 15~60min，流動相A為5%~30%，流動相B為95%~70% ； 60~80min，流動相A為30%~50%，流動相B為70%~50% ； 80~lOOmin，流動相A為50%~100%，流動相B為50%~0%。
3.根據權利要求1或2所述的建立方法，其特徵在於： 所述HPLC法檢測包括以下步驟： 1)製備對照品溶液； 2)製備供試品溶液； 3)測定：根據以下色譜條件進行測定，得到指紋圖譜： 色譜柱：C18烷基矽烷鍵合矽膠為填充材料，5 μ m，2. 5 X 460mm ； 流動相：流動相A為乙腈，流動相B為O. 2%體積分數甲酸水溶液，進行梯度洗脫；
流速：1. OmL/min ； 檢測波長：286nm ； 理論塔板數按原兒茶酸峰計算，應不低於6000。
4.根據權利要求1所述的建立方法，其特徵在於，所述的製備對照品溶液按如下步驟：取原兒茶酸對照品適量，加入甲醇溶解製成每Iml含O. Img的溶液，作為對照品溶液。
5.根據權利要求1所述的建立方法，其特徵在於，所述的製備供試品溶液按如下步驟：取落花生莖葉藥材1.0g，置於燒瓶錐形瓶中，加入70 %體積分數甲醇水溶液100ml，超聲提取lh，提取液濃縮至幹，用甲醇溶解轉移至IOml容量瓶中，用O. 45 μ m濾膜濾過，棄去初濾液，取續濾液即得。
6.根據權利要求1至5中任一項所述的建立方法，其特徵在於，所述建立方法得到的指紋圖譜中包括7個共有吸收峰，其中峰I為對照品原兒茶酸，各峰以峰I為參照峰的相對保留時間和相對峰面積如下： 相對保留時間：
峰 1 ：1. 000 ；峰 2 ：1. 182 ；峰 3 ：1. 547 ；峰 4 ：2. 221 ；峰 5 ：2. 244 ；峰 6 ：2. 307 ;峰 7 :.4.333 ； 相對峰面積：
峰 1 ：1. 000 ；峰 2 ：7. 204 ；峰 3 ：2. 594 ；峰 4 ：1. 452 ；峰 5 ：2. 026 ；峰 6 ：1. 023 ;峰 7 :.O.421。
【文檔編號】G01N30/88GK103837627SQ201210479915
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年11月22日 優先權日:2012年11月22日
【發明者】張鐵軍, 王麗莉, 龔蘇曉, 朱雪瑜, 田成旺, 廖茂梁, 許浚, 孫衛 申請人:天津藥物研究院