液相三磷酸腺苷偶合的納米單質硒及其製備和保存方法

2023-06-16 00:24:36

專利名稱：：液相三磷酸腺苷偶合的納米單質硒及其製備和保存方法
技術領域：
：本發明涉及納米硒，特別是液相三磷酸腺苷偶合的納米單質硒及其製備與保存方法。
背景技術：
：硒是人體必需微量元素。硒具有抗氧化、調節免疫、拮抗有害重金屬等重要生物功能。人體缺硒將誘發多種疾病，如愛滋病(AIDS)、B型肝炎、肝癌、克山病、大骨節病、心腦血管疾病等。目前研究結果顯示使用超大劑量的硒(比硒的營養劑量範圍高出510倍，硒的營養劑量為50200|ig/d)能防癌，降低癌症發生率和癌變程度。流行病學調查發現，低硒地區癌症發生率高於富硒地區癌症發生率。人群幹預研究證明補硒可以防癌。在江蘇啟東肝癌高發區、河南林縣食管癌高發區，人群強化補硒後顯著降低了癌症的發病率。在美國，對8000人進行長達10年的補硒研究，結果表明，硒可以顯著降低肺癌、腸癌、胃癌、血癌等癌症的發病率。同時又有大量實驗表明超大劑量的硒與化療藥物合併使用可以提高癌症治療的治癒率。Yatrik.(Mol.CancerTher[J]，2005，4:1239-1249)等人石開究發現甲基硒酸和它莫西芬聯合使用，提高了它莫西芬治療乳腺癌、肺癌的效果。1992年MasahikoSato等人(CancerChemotherPharmacol[J],1992,30:439-443)用亞硒酸鈉與順鉑聯用取得顯著效果，荷瘤動物單用順鉑治療，存活在7周左右，超大劑量的亞硒酸鈉與順鉑聯用完全治癒了腫瘤。ShousongCao等人(Clin.CancerRes[J]，2004,10:2561-2569)用超大劑量的甲基硒代半胱氨酸與依力替康聯用，取得驚人效果。依力替康是治療腸癌的化療藥物，它與超大劑量的甲基硒代半胱氨酸聯用後，對敏感性腸癌和頭頸部癌治癒率提高了7080%，對不敏感性腸癌和頭頸部癌治癒率提高了為4070°/。。預防癌症和合併化療治癒癌症方面需要超營養水平或超大劑量硒，而這些劑量已經進入了硒的毒性範圍，這嚴重限制了硒在防治癌症方面的潛力。因此尋求低毒而生物利用度良好的硒形式對硒在治療癌症和其它疾病方面的應用十分重要。1985年，就有人提出了膠體狀態的紅色單質硒具有生物活性的假說，但一直缺乏研究證據。1998年，張勁松等人在蛋白質或多肽溶液體系中使用還原劑還原硒化合物得到蛋白質態或多肽態的納米硒，再經過分離和乾燥得到了納米硒固體，並申請了發明專利(CN1184776A)。試驗研究表明，納米硒的生物利用性好，急毒性小，生物活性高。例如，納米硒能對抗CCl4誘發的急性肝損傷，顯著抑制腫瘤體積，抑制腫瘤轉移，提高免疫指標等。目前納米硒的生物學功效己被認可，國家衛生部已經批准納米硒膠囊為保健食品(衛食健字1998第134號)。2002年，張勝義等申請了葡苷聚糖納米硒及其製備方法(CN1415241A)、甲殼素納米硒及其製備方法(CN1415310A)和胺基酸納米硒及其製備方法中國專利CN1415308A中公開的產品均必需以固相保存且其修飾劑均是沒有抗癌活性的(如葡苷聚糖、甲殼素及混合胺基酸等)。在本課題組曾先後申請了液相多聚糖納米硒及其製備與保存(CN1947723A)、液相維生素C複合的納米單質硒及其製備與保存方法(CN100998603A)、液相胺基酸耦合的納米硒單質及其製備和保存方法等多個專利(CN101040869A)。這些專利的產物最突出的優點是以液態(水溶膠)形式保存，從而可以作為注射、噴霧等多種劑型應用，但硒的濃度都相對偏小，不利於臨床上癌症聯合化療時大劑量的使用。而且所用的修飾劑同樣是一些沒有抗癌活性的物質。黃亮等(高等學校化學學報[J],2007，28(2):208-211)研究發現具有一定抗癌活性的裙帶菜多糖或其適當氧化降解的產物對納米硒也有較好的修飾及其穩定化作用，但因修飾劑分子量大、粘度高、溶解度低、不利於人體吸收等不利因素制約了其臨床應用。同時用這類多糖對納米硒修飾時事先要對多糖進行長時間的超聲波輔助氧化分解，存在操作麻煩，生成成本高等的不利因素。三磷酸腺苷作為細胞外信號分子，通過與膜上的特異性嘌呤受體結合，調節多種細胞的功能活動。近來國外學者對三磷酸腺苷的抗癌作用十分重視。Rapaport等報導(ProcNatlAcadSciUSA[J],1989，86(5):1662~6)，三磷酸腺苷對小鼠結腸移植癌和人肺巨細胞癌及前列腺癌的增殖有抑制作用。Hatta報導(LeukRes[J],2002,26(5):477-482)三磷酸腺苷對小鼠白血病具有抗增殖作用。Yamaguchi等報導(JCellPhysiol[J]，1994,159(3):441~449)，細胞外三磷酸腺苷能提高小鼠髓細胞性白血病細胞誘導分化的能力，促使向正常表型逆轉。Palomares等報導(MelanomaRes[J],1999,9(3):233-242)三磷酸腺苷對黑色素瘤有抑制作用。Bradley等則報導(JharmacolExpTher[J],2001，299(2):748~752)三磷酸腺苷對人星形細胞瘤具有抗增殖作用。國內學者中郝純毅等(中華腫瘤雜誌[J]，1999,21(3):165167)研究發現三磷酸腺苷不僅抑制人胃癌細胞的增殖，加藥處理4天後增殖的抑制率可達80%以上。而且誘導分化，使人胃癌細胞的惡性表型向正常表型逆轉。秦葵等(中國藥理學通報[J],2006，22(1):31-4)研究發現三磷酸腺苷對人食管癌細胞株Eca-109和人肝癌細胞株SMMC-7721細胞均有增殖抑制作用。
發明內容針對現有技術的不足，本發明的首要目的是將具有抗癌活性的三磷酸腺苷弓I入液相納米單質硒體系，提供一種液相三磷酸腺苷偶合的納米單質硒。本發明的另一目的是提供上述液相三磷酸腺苷偶合的納米單質硒的製備方法。本發明的再一目的是提供一種穩定保存納米單質硒的方法。為達上述目的，本發明提供如下的技術方案一種液相三磷酸腺苷偶合的納米單質硒的製備方法，在常溫常壓下，在三磷酸腺苷溶液中加入維生素C溶液，混合均勻，然後滴加二氧化硒溶液或亞硒酸鹽溶液，邊滴加邊混勻，待產物中所出現的紅色不再改變，得到由三磷酸腺苷和納米單質硒所組成的液相偶合物。上述方法中，優選地，所述維生素C為還原型維生素C。上述方法中，優選地，所述亞硒酸鹽為亞硒酸鈉。上述方法中，優選地，所述的三磷酸腺苷溶液的濃度為0.01moH/10.1moH/1，維生素C溶液的濃度為0.02moH/10.2mol'U1,二氧化硒或亞硒酸鈉溶液的濃度為lxl(T6mol丄"lxl(T2mol'L";三磷酸腺苷溶液、維生素C溶液、二氧化硒或亞硒酸鈉溶液的體積用量比為1~50:1:0.1~10。更優選地，上述方法中，所述的三磷酸腺苷溶液的濃度為0.025moH/10.08mol丄"，維生素C溶液的濃度為0.1mol丄"，二氧化硒或亞硒酸鈉溶液的濃度為lxl(T4moH/1;三磷酸腺苷溶液、維生素C溶液、二氧化硒或亞硒酸鈉溶液的體積用量比為5~50:1:0.110。本發明還提供了上述方法所製得的液相三磷酸腺苷偶合的納米單質硒。腺苷的濃度範圍優選為lmmol，L"0.08moH/1，所述維生素C的濃度範圍為2fxmol'L"0.01mol丄"，所述納米單質硒的濃度範圍為lHmol'lZ—Smmol'L-^本發明同時提供了一種保存納米單質硒的方法，及可將納米單質硒製成本發明的液相三磷酸腺苷偶合的納米單質硒的形式，在2-10。C下在水溶液中以溶膠形態保存。本發明所得到產品的三磷酸腺苷和硒的比例可以調整，若要增加產品中硒的含量，應適當增加修飾劑三磷酸腺苷和還原劑維生素C的溶液濃度或體積。三磷酸腺苷的起始濃度過低，或納米單質硒的濃度過高，得到的納米單質硒的粒徑會偏大，且可能不利於納米單質硒的穩定保存。適當增加三磷酸腺苷的起始濃度，有利於降低硒粒子的粒徑、有利於延長保存時間。與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果本發明使用具有很好生物活性、抗癌活性和對液相納米單質硒具有優越穩定化作用的三磷酸腺苷分子作為表面修飾劑對納米單質硒進行表面修飾，以達到調控納米單質硒粒徑和穩定納米單質硒的作用，三磷酸腺苷偶合的納米單質硒水溶膠經透射電子顯微鏡、紅外光譜、Zeta電位、元素分析的測量表明，三磷酸腺苷對納米單質硒形成了很好的表面修飾及其穩定化的作用。本發明所得的三磷酸腺苷偶合的納米單質硒具有超大劑量的納米單質硒濃度且能充分發揮抗癌活性小分子與納米單質硒的協同抗癌作用，為臨床上癌症的聯合化療提供一種很好的優選方案。而且所製得的產物可以在液相中以水溶膠的形式保存，有利於多種劑型開發，如注射劑、口服、噴霧、霜劑等，從而大大拓展了應用範圍。圖1是TECNAI-10型透射電子顯微鏡(Philips)下納米單質硒形貌圖。圖中A、B、C、D分別對應實施例l至實施例4中硒濃度為64pmol丄"時三磷酸腺苷偶合的納米單質硒的形貌，E對應的是實施例五中硒濃度為1mmol.L"時三磷酸腺苷偶合的納米單質硒的形貌。圖2是實施例1中硒濃度64pmol丄"時三磷酸腺苷偶合的納米單質硒體系及其相同濃度下的單獨納米單質硒體系、三磷酸腺苷的紅外光譜圖；圖中譜線a、b、c(由上至下)分別對應納米單質硒、三磷酸腺苷、三磷酸腺苷偶合的納米單質硒的紅外光譜圖。圖3是實施例1中硒濃度64|_imol丄-1時三磷酸腺苷偶合的納米單質硒體系及其相同濃度下的單獨納米單質硒體系的Zeta電位圖；圖中A、B分別對應納米單質硒、三磷酸腺苷偶合的納米單質硒的Zeta電位圖。圖4是實施例5中硒濃度lmmol七-1時三磷酸腺苷偶合的納米單質硒顆粒中的EDX元素分析圖。具體實施方式下面結合實施例和附圖對本發明做進一步的說明，但本發明的實施方式不限於此。實施例1:在常溫常壓下(15~35°C，l標準大氣壓)，取濃度為0.025moH/1的三磷酸腺苷溶液各2ml分別加入2個10ml的容量瓶中，然後取濃度為0.1mol丄"的維生素C溶液各0.3ml分別加入這2個容量瓶中，輕輕搖勻使之混合充分，然後分別滴加濃度為4xl0'4mol七"的二氧化硒溶液1.6ml，3.2ml。邊滴加邊輕輕搖勻，待紅色不再改變，加水定容至10ml，即得到硒濃度分別為64、12^mol.U1，三磷酸腺苷的濃度為5mmoH/1，維生素C的濃度為3mmoH/1的目標產物。由BI9000AT型雷射散射儀測定產物中的納米粒子的分布情況，計數用Number。產物中的納米粒子的平均粒徑在40.0100.0nm範圍，見附表l。產物可在2-10。C下在水溶液中以溶膠形態保存。附表1:實施例1的納米單質硒粒子的粒徑範圍硒濃度平均粒徑主要粒徑粒徑範圍(|xmol七陽1)C腦)C腦)6455.340.240.099.112860.358.942.2100.0實施例2:在常溫常壓下(15~35°C，1標準大氣壓)，取濃度為0.025mol.U1的三磷酸腺苷溶液各2ml分別加入2個10ml的容量瓶中，然後取濃度為0.1mol七—1的維生素C溶液各0.3ml分別加入這2個容量瓶中，輕輕搖勻使之混合充分，然後分別滴加濃度為AxlO^mol.L-1的亞硒酸鈉溶液1.6ml，3.2ml邊滴加邊輕輕搖勻，待紅色不再改變，加水定容至10ml，即得到硒濃度分別為64、128pmoH;1，三磷酸腺苷的濃度為5mmo1.1/1，維生素C的濃度為3mmol.L"的目標產物。由BI9000AT型雷射散射儀測定產物中的納米粒子的分布情況，計數用Number。產物中的平均粒徑在31.6106.0nm範圍，見附表2。產物可在2-10°C下在水溶液中以溶膠形態保存。附表2:實施例2的納米單質硒粒子的粒徑範圍tableseeoriginaldocumentpage8實施例3:在常溫常壓下(15~35°C，l標準大氣壓)，取濃度為0.025mol.L—1的三磷酸腺苷溶液各4ml分別加入2個10ml的容量瓶中，然後取濃度為0.1mol丄—1的維生素C溶液各0.3ml分別加入這2個容量瓶中，輕輕搖勻使之混合充分，然後分別滴加濃度為4xl(T4mol七"的亞硒酸鈉溶液1.6ml，3.2ml邊滴加邊輕輕搖勻，待紅色不再改變，加水定容至10ml,即得到硒濃度分別為64、128pmol丄"，三磷酸腺苷的濃度為10mmoH/1，維生素C的濃度為3mmol丄"的目標產物。由BI9000AT型雷射散射儀測定產物中的納米粒子的分布情況，計數用Number。產物的納米粒子的平均粒徑在37.6112.0nm範圍，見附表3。產物可在2-l(TC下在水溶液中以溶膠形態保存。附表3:實施例3的納米單質硒粒子的粒徑範圍tableseeoriginaldocumentpage8實施例4:在常溫常壓下(15~35°C，l標準大氣壓)，取濃度為0.08mol丄"的三磷酸腺苷溶液各5ml分別加入2個10ml的容量瓶中，然後取濃度為0.1mol丄"的維生素(3溶液各0.21111分別加入這2個容量瓶中，輕輕搖勻使之混合充分，然後分別滴加濃度為4xlO"mol，L"的二氧化硒溶液1.6ml，3.2ml。邊滴加邊輕輕搖勻，待紅色不再改變，加水定容至10ml，即得到硒濃度分別為64、128pmoH/1，粒徑在48，2105.8nm範圍，見附表l。產物可在2-10°C下在水溶液中以溶膠形態保存。附表4:實施例4的納米單質硒粒子的粒徑範圍硒濃度平均粒徑主要粒徑粒徑範圍(nmol'L-1)Cnm)(nm)6458.358.248.296.012860.772.760.7105.8實施例5:在常溫常壓下(15~35°C，l標準大氣壓)，取濃度為0.05mol.U1的三磷酸腺苷溶液各4ml分別加入2個10ml的容量瓶中，然後取濃度為0.1mol七"的維生素C溶液各2ml分別加入這2個容量瓶中，輕輕搖勻使之混合充分，然後分別滴加濃度為4xl(T2mol丄"的二氧化硒溶液0.25ml，0.75ml邊滴加邊輕輕搖勻，待紅色不再改變，加水定容至lOml，即得到硒濃度分別為1、Smmol'L-1,三磷酸腺苷的濃度為20mmoH/1，維生素C的濃度為15mmol'U1的目標產物。由BI9000AT型雷射散射儀測定產物中的納米粒子的分布情況，計數用Number。產物中的納米粒子的平均粒徑在32.699.3nm範圍，見附表5。產物可在2-l(Tc下在水溶液中以溶膠形態保存。附表5:實施例5的納米單質硒粒子的粒徑範圍硒濃度平均粒徑主要粒徑粒徑範圍(mmol-U1)Cnm)C歸)144.431.632.694.2351.960.735.199.3需要強調的是，本發明所得到產品的三磷酸腺苷和硒的比例可以調整，若要增加產品中硒的含量，應適當增加修飾劑三磷酸腺苷和還原劑維生素c的溶液濃度或體積。三磷酸腺苷的起始濃度過低，或納米單質硒的濃度過高，得到的納米單質硒的粒徑會偏大，且可能不利於納米單質硒的穩定保存。適當增加三磷酸腺苷的起始濃度，有利於降低硒粒子的粒徑、有利於延長保存時間。實施例l-5所得產品在透射電鏡下的形貌如圖1A-E所示，從圖中可以看出三磷酸腺苷偶合的納米單質硒顆粒尺寸均一，說明三磷酸腺苷對納米單質硒有很好的粒徑調控作用。對實施例1中硒濃度為64pmol丄"時三磷酸腺苷偶合的納米單質硒的體系進行離心分離得到固體顆粒，乾燥後與KBr壓片，測試紅外光譜。同時分別測試相同濃度的納米單質硒和三磷酸腺苷的紅外光譜。如圖2所示。圖中譜線a、b、c分別對應納米單質硒、三磷酸腺苷、三磷酸腺苷偶合的納米單質硒的紅外光譜圖。根據三磷酸腺苷紅外譜圖的變化，說明在三磷酸腺納米單質硒偶合物體系中，三磷酸腺苷中三個磷酸基周圍的環境發生了很大的變化。這種變化我們認為主要是三磷酸腺苷是通過a、卩位的P=0上的氧原子與硒形成O—Se—O化學鍵來完成對納米單質硒的修飾，從而導致三磷酸腺苷中酸苷鍵Pa—O—Pp、P=0的振動受到了很大的抑制，周時對磷酯鍵C一O—P的振動也產生了很大的影響。實施例1中硒濃度為64pmol丄"時三磷酸腺苷偶合的納米單質硒的體系及其相同濃度的單獨納米單質硒表面的Zeta電位如圖3所示，從圖3(A)中可以看出，在單獨的納米單質硒體系中，納米顆粒表面的Zeta電位為零，而在三磷酸腺苷納米單質硒偶合物體系中，納米單質硒表面的Zeta電位為一10mv，如圖3(B)所示，這說明體系中納米單質硒表面帶上了負電荷。這主要是因為納米單質硒表面耦合了三磷酸腺苷造成的。三磷酸腺苷的三個磷酸基帶有負電荷，三磷酸腺苷通過P=0上的氧原子與硒形成O-Se-O化學鍵來完成對納米單質硒的修飾後使納米單質硒表面也帶上負電荷。三磷酸腺苷納米單質硒偶合物的生成，一方面對納米單質硒顆粒間的相互接觸形成了空間位阻，同時使納米顆粒表面都帶上了負電荷形成了排斥力，這兩方面的原因防止納米單質硒發生沉聚，使其穩定地保存於溶液中。實施例5中硒濃度為lmmol丄-l時，三磷酸腺苷偶合的納米單質硒顆粒中的EDX元素分析如圖4所示。從圖中可以看出三磷酸腺苷偶合的納米單質硒體系中硒、磷、氧等元素的分布情況。這也從另一個角度說明了三磷酸腺苷對納米單質硒的表面修飾作用。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。權利要求1、一種液相三磷酸腺苷偶合的納米單質硒的製備方法，其特徵在於在常溫常壓下，在三磷酸腺苷溶液中加入維生素C溶液，混合均勻，然後滴加二氧化硒溶液或亞硒酸鹽溶液，邊滴加邊混勻，待產物中所出現的紅色不再改變，得到由三磷酸腺苷和納米單質硒所組成的液相偶合物。2、根據權利要求1所述的液相三磷酸腺苷偶合的納米單質硒的製備方法，其特徵在於所述維生素C為還原型維生素C。3、根據權利要求1所述的液相三磷酸腺苷偶合的納米單質硒的製備方法，其特徵在於所述亞硒酸鹽為亞硒酸鈉。4、根據權利要求1所述的液相三磷酸腺苷偶合的納米單質硒製備方法，其特徵在於所述的三磷酸腺苷溶液的濃度為0.01mol丄"0.1moH/1，維生素C溶液的濃度為0.02mol丄"0.2mol丄"，二氧化硒或亞硒酸鈉溶液的濃度為lxlO"mol，L"lxl(^mol丄"；所述磷酸腺苷溶液、維生素C溶液、二氧化硒或亞硒酸鈉溶液的體積用量比為150:1:0.110。5、根據權利要求4所述的液相三磷酸腺苷偶合的納米單質硒製備方法，其特徵在於所述的三磷酸腺苷溶液的濃度為O.OSSmol'lZ-O.OSmol'L-1,維生素C溶液的濃度為0.1moH/1，二氧化硒或亞硒酸鈉溶液的濃度為lxl0^mol七"；所述三磷酸腺苷溶液、維生素C溶液、二氧化硒或亞硒酸鈉溶液的體積用量比為550:1:0,110。6、一種液相三磷酸腺苷偶合的納米單質硒，其特徵在於是由權利要求1至5中任一項所述的液相三磷酸腺苷偶合的納米單質硒的製備方法得到的。7、根據權利要求6所述的液相三磷酸腺苷偶合的納米單質硒，其特徵在於其中，三磷酸腺苷的濃度範圍為lmmol'L-10.08mol'U1,維生素C的濃度範圍為2拜01七-10.0111101丄-1，納米單質硒的濃度範圍為liimoH^—Smmol'L^8、一種穩定保存納米單質硒的方法，其特徵在於製成權利要求6所述的液相三磷酸腺苷偶合的納米單質硒，在210。C下在水溶液中以溶膠形態保存。全文摘要本發明涉及納米硒，具體公開了一種三磷酸腺苷偶合的納米單質硒及其製備和保存方法。製備方法如下在常溫常壓下，在三磷酸腺苷溶液中加入維生素C溶液，混合均勻後滴加二氧化硒或亞硒酸鹽溶液，邊滴加邊混勻，待產物中所出現的紅色不再改變，得到由三磷酸腺苷和納米單質硒所組成的液相偶合物。本發明用具有抗癌活性的小分子三磷酸腺苷對納米單質硒進行很好的粒徑調控和穩定化作用，得到了抗癌活性高毒性低的硒形式。而且所製得的產物可以在液相中以水溶膠的形式保存，有利於多種劑型開發，如注射劑、口服、噴霧、霜劑等，從而大大拓展了應用範圍。文檔編號A61K33/04GK101530422SQ200910038320公開日2009年9月16日申請日期2009年4月1日優先權日2009年4月1日發明者傑劉,張逸波,航徐,芳楊,鄭文杰,陳填烽申請人:暨南大學