一種厭氧降解石油烴產甲烷菌群的篩選方法與流程
2023-06-08 20:30:06
本發明屬於殘餘石油利用
技術領域：
，具體涉及一種厭氧降解石油烴產甲烷菌群的篩選方法。
背景技術：
：對老油田進行深度開發，提高石油採收率已成為當前老油田開發的中心任務。現有提高採收率的技術存在的主要問題是提高幅度有限，大量的殘餘石油滯留地下。而怎樣利用大量殘存在油藏中的石油又成為一項重要課題。通過微生物降解石油產甲烷，從而對殘餘石油進行利用，成為一條有效途徑。微生物厭氧降解石油產甲烷過程是多種菌群參與的多步驟反應，在整個降解過程中，影響反應速率的因素非常多。油藏中的實驗也證實了在有機質(特別是殘餘石油)降解過程中，公認的降解終端產物是甲烷，而電子受體耗儘是甲烷產生的基礎，具體來說產甲烷古菌和其它功能菌群協同作用，最終使殘餘石油得到降解並產生甲烷。而地質學的研究也表明，在數千年來，油藏內部一直自發進行著微生物降解石油產甲烷，因為地球內部的厭氧環境有利於這一過程的進行。有研究表明：油藏中的微生物群體是由微好氧菌群和兼性厭氧型以及嚴格厭氧型細菌組成的，烴類提供了它們存活的基礎條件，其可能原因是隨著油藏的開採，會大量注入水和其它物質，這改變了油藏本來的環境。目前，還沒有一種簡單有效的，篩選厭氧降解石油烴產甲烷菌群的方法出現。技術實現要素：為了解決上述技術問題，本發明提供了一種厭氧降解石油烴產甲烷菌群的篩選方法，所述篩選方法本發明以油田採出液和含油汙泥作為樣品，對其中的菌群進行厭氧培養，在不加入碳源的情況下，菌群只能利用石油烴作為碳源，進而培育篩選出能夠利用石油烴作為碳源的菌群，同時為了得到適應性更強的降解石油烴混合菌群，本發明同時使用油田採出液和含油汙泥作為樣品，並根據油田採出液和含油汙泥中菌群的不同屬性分別篩選出產氣量大於0.4μmol/d和1.15μmol/d的樣品，進而將其混合，得到能夠降解石油烴混合菌群的混合物。本發明的技術方案是，一種厭氧降解石油烴產甲烷菌群的篩選方法，包括以下步驟：s1、取樣：分別從油田的不同區域採集油田採出液和含油汙泥，作為樣品；s2、厭氧培養：將所述油田採集液和含油汙泥分別按照厭氧條件培養；s3、培養結果測定：一段時間後，測量油田採出液和含油汙泥的甲烷產量；s4：菌種混合：篩選油田採集液中產氣量大於0.4μmol/d和含油汙泥中產氣量大於1.15μmol/d的樣品，取培養液分別作為最優油田採集液培養液和最優含油汙泥培養液，並將最優油田採集液培養液和最優含油汙泥培養液進行混合，即得到含有降解石油烴混合菌群的混合物。本發明以油田採出液和含油汙泥作為樣品，對其中的菌群進行厭氧培養，在不加入碳源的情況下，菌群只能利用石油烴作為碳源，進而培育篩選出能夠利用石油烴作為碳源的菌群，同時為了得到適應性更強的降解石油烴混合菌群，本發明同時使用油田採出液和含油汙泥作為樣品，並根據油田採出液和含油汙泥中菌群的不同屬性分別篩選出產氣量大於0.4μmol/d和1.15μmol/d的樣品，進而將其混合，得到能夠降解石油烴混合菌群的混合物。再使用所述混合物或從中提取出菌群，進行石油烴的厭氧降解以產生甲烷。為保證樣品質量和多樣性，優選的，步驟s1中，所述油田採出液的原油密度為0.87-0.93g/cm3，原油粘度為61.6-169.3mpas，採集所述油田採出液後，使用氮氣密封保存；取距地面30cm以下被石油汙染的含油率為5.8-11.3％的含油汙泥，取樣後在-5℃下厭氧保存。在油田的不同區域採集油田採出液或含油汙泥，並將不同的樣品分別按照厭氧條件培養；厭氧培養為：取30-40g的油田採出液或含油汙泥，和60ml無機鹽富集培養基充入到120ml無菌瓶中，30℃下富集培養直到培養瓶中能檢測到穩定的甲烷產量，培養結束。本發明中，使用的所述無機鹽富集培養基的成分及含量為：kh2po45.0g，k2hpo45.0g，nh4cl5.0g，nacl1.0g，mgcl22.0g，cacl20.1g，酵母粉0.5g，l-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g，硫酸亞鐵銨0.5g和刃天青1.0mg，加水定容至1l。所述無機鹽富集培養基能夠滿足菌群生長的需要，保證菌群的正常生長。為使菌群生長的更好，優選的，所述無機鹽富集培養基中還包括維生素水溶液5ml，所述維生素水溶液中維生素的成分及濃度為：維生素h2.0mg/l，維生素b92.0mg/l，維生素b610mg/l，維生素b15.0mg/l，維生素b25.0mg/l，維生素b120.1mg/l，硫辛酸5.0mg/l。進一步的，所述無機鹽富集培養基中還包括微量元素水溶液5ml，所述微量元素水溶液中的成分及濃度為：次氮基三乙酸1.5g/l，氯化鈷0.1g/l，無水氯化錳0.1g/l，氯化亞鐵0.1g/l，六水氯化鈷0.18g/l，氯化鋅0.1g/l，五水硫酸銅0.01g/l，十二水硫酸鋁鉀0.02g/l，硼酸0.01g/l，兩水鉬酸鈉0.01g/l和六水氯化鎳0.025g/l。所述無機鹽富集培養基的配製方法為：將培養基中除刃天青、維生素水溶液和微量元素水溶液之外的其他組分混合，加熱煮沸的同時不斷通入氮氣，直到培養基由粉色變為無色，停止加熱，待體系冷卻後，加入維生素水溶液和微量元素水溶液，滅菌後加入最終質量比為0.03％的九水硫化鈉、最終質量比為0.02％的碳酸氫鈉，以及刃天青，密封保存。其中，刃天青需要現用現配。由於含油汙泥的粘度和濃度較大，為便於後續的厭氧培養，優選的，在對所述含油汙泥進行厭氧培養之前，向所述含油汙泥中加入10倍重量的無機鹽富集培養基進行初級培養6-8小時，初級培養結束後取上清液繼續進行厭氧培養。本發明中，使用色譜儀對生成的甲烷產量進行測定，其中fid的溫度為200℃，氣化進樣器的溫度為150℃；色譜柱的初溫為35℃，保持15min後以5℃/min的升溫速度升溫至200℃，並保持5min，取樣時使用氣體收集器從樣品上方收集氣體，然後再用密封注射器取樣和進樣，進樣體積為0.3ml。為了驗證最終產生的氣體為油田採集液或含油汙泥中的菌群產生，優選的，所述篩選方法還包括使用滅菌組對培養結果進行驗證：使用滅菌後的樣品按照所述厭氧條件培養，若最終滅菌後的樣品經厭氧條件培養後無甲烷產生，則證明甲烷氣體由樣品中的菌群產生。如果若最終滅菌後的樣品經厭氧條件培養後有甲烷產生，則證明甲烷氣體不全由樣品中的菌群產生，此時需要重新採用，重複以上步驟，以得到含有降解石油烴混合菌群的混合物。本發明的有益效果為：所述篩選方法本發明以油田採出液和含油汙泥作為樣品，對其中的菌群進行厭氧培養，在不加入碳源的情況下，菌群只能利用石油烴作為碳源，進而培育篩選出能夠利用石油烴作為碳源的菌群，同時為了得到適應性更強的降解石油烴混合菌群，本發明同時使用油田採出液和含油汙泥作為樣品，並根據油田採出液和含油汙泥中菌群的不同屬性分別篩選出產氣量大於0.4μmol/d和1.15μmol/d的樣品，進而將其混合，得到能夠降解石油烴混合菌群的混合物。具體實施方式為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本發明的技術方案進行詳細的描述。顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動的前提下所得到的所有其它實施方式，都屬於本發明所保護的範圍。實施例一種厭氧降解石油烴產甲烷菌群的篩選方法，包括以下步驟：s1、取樣：分別從油田的不同區域採集油田採出液和含油汙泥，作為樣品；本步驟中，採集某油田區塊的六口油井採出液調研取樣，將數個塑料桶裝滿(約5l)，取樣之前通入氮氣密封，取樣後迅速運回實驗室，低溫保存，編號為yh1-yh6；取4份距地面30cm以下被石油汙染的含油率為5.8-11.3％的含油汙泥，取樣後在-5℃下厭氧保存，分別編號為th1-th6；其中，yh1-yh6的理化性質如表1所示。表1：yh1-yh6的理化性質附註1：yh代表厭氧培養油田採出液，後面的編號為取樣地油井編號s2、厭氧培養：將所述油田採集液和含油汙泥分別按照厭氧條件培養；將不同的樣品分別按照厭氧條件培養，厭氧培養為：取30-40g的油田採出液或含油汙泥，和60ml無機鹽富集培養基充入到120ml無菌瓶中，30℃下富集培養直到培養瓶中能檢測到穩定的甲烷產量，培養結束。使用的所述無機鹽富集培養基的成分及含量為：kh2po45.0g，k2hpo45.0g，nh4cl5.0g，nacl1.0g，mgcl22.0g，cacl20.1g，酵母粉0.5g，l-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g，硫酸亞鐵銨0.5g和刃天青1.0mg，加水定容至1l。所述無機鹽富集培養基中還包括維生素水溶液5ml，所述維生素水溶液中維生素的成分及濃度為：維生素h2.0mg/l，維生素b92.0mg/l，維生素b610mg/l，維生素b15.0mg/l，維生素b25.0mg/l，維生素b120.1mg/l，硫辛酸5.0mg/l。所述無機鹽富集培養基中還包括微量元素水溶液5ml，所述微量元素水溶液中的成分及濃度為：次氮基三乙酸1.5g/l，氯化鈷0.1g/l，無水氯化錳0.1g/l，氯化亞鐵0.1g/l，六水氯化鈷0.18g/l，氯化鋅0.1g/l，五水硫酸銅0.01g/l，十二水硫酸鋁鉀0.02g/l，硼酸0.01g/l，兩水鉬酸鈉0.01g/l和六水氯化鎳0.025g/l。將培養基中除刃天青、維生素水溶液和微量元素水溶液之外的其他組分混合，加熱煮沸的同時不斷通入氮氣，直到培養基由粉色變為無色，停止加熱，待體系冷卻後，加入維生素水溶液和微量元素水溶液，滅菌後加入最終質量比為0.03％的九水硫化鈉、最終質量比為0.02％的碳酸氫鈉，以及刃天青，密封保存。其中，刃天青需要現用現配。由於含油汙泥的粘度和濃度較大，為便於後續的厭氧培養，在對所述含油汙泥進行厭氧培養之前，向所述含油汙泥中加入10倍重量的無機鹽富集培養基進行初級培養6-8小時，初級培養結束後取上清液繼續進行厭氧培養。s3、培養結果測定：培養400天後，測量油田採出液和含油汙泥的甲烷產量；本發明中，使用色譜儀對生成的甲烷產量進行測定，其中fid的溫度為200℃，氣化進樣器的溫度為150℃；色譜柱的初溫為35℃，保持15min後以5℃/min的升溫速度升溫至200℃，並保持5min，取樣時使用氣體收集器從樣品上方收集氣體，然後再用密封注射器取樣和進樣，進樣體積為0.3ml。具體來說，本實施例中甲烷的產氣測定的具體操作為：氣體組分：安捷倫氣相色譜儀。檢測器：fid200℃；氣化進樣器150℃；色譜柱：pona彈性石英毛細柱(50m×0.2mm×0.5μm)；柱溫：初溫35℃，15min；5℃/min升溫至200℃，5min。取樣時先用氣體收集器從上方收集氣體，然後再用密封注射器取樣，進樣體積：0.3ml，將標準氣體用高純氮氣稀釋成不同濃度，在上述條件下進行分析，修正的面積歸一法定量氣體含量。本實施例中，各樣品的產氣量詳見表2所示表2：各樣品的產氣量結果表樣品編號yh1yh2yh3yh4yh5yh6產氣量(μmol)70.599.261.7108.3246.90樣品編號th1th2th3th4th5th6產氣量(μmol)68.546625.692.560.730.8s4：菌種混合：篩選油田採集液中產氣量大於0.4μmol/d和含油汙泥中產氣量大於1.15μmol/d的樣品，取培養液分別作為最優油田採集液培養液和最優含油汙泥培養液，並將最優油田採集液培養液和最優含油汙泥培養液進行混合，即得到含有降解石油烴混合菌群的混合物。從表2中能夠得知，yh5和th2符合要求，所以yh5和th2分別作為最優油田採集液培養液和最優含油汙泥培養液，將yh5和th2的培養液進行混合，即得到含有降解石油烴混合菌群的混合物。需要說明的是，yh6中未檢出甲烷生成，可能的原因是本實施例採用厭氧培養，而yh6中可能含有好氧菌，本實施例並未對yh6進行滅菌處理。為了驗證最終產生的氣體為油田採集液或含油汙泥中的菌群產生，所述篩選方法還包括使用滅菌組對培養結果進行驗證：使用滅菌後的樣品按照所述厭氧條件培養，結果發現，無論是油田採集液還是含油汙泥，其最終產生的甲烷的量均為0，由此能夠得出，本實施例中，甲烷氣體均由樣品中的菌群產生，並且使用本實施例中的方法，得到能夠降解石油烴混合菌群的混合物。以上所述，僅為本發明的具體實施方式，但本發明的保護範圍並不局限於此，任何熟悉本
技術領域：
的技術人員在本發明揭露的技術範圍內，可輕易想到變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。因此，本發明的保護範圍應以所述權利要求的保護範圍為準。當前第1頁12