一種自設度梯度藥物篩選器官晶片及其製備方法
2023-06-09 05:13:36
一種自設度梯度藥物篩選器官晶片及其製備方法
【專利摘要】本發明涉及一種自設濃度梯度藥物篩選器官晶片及其製備方法。該器官晶片包括多細胞共培養體系，種子細胞培養體系，空白對照體系和藥物檢測體系。器官晶片同時可一次進行8個藥物濃度梯度的藥物活性或藥物毒性檢測及空白對照實驗，操作簡單，可以實現多種細胞的平行植入和共培養，降低了實際樣品的用量，實現低藥物消耗，簡化了細胞植入過程，具有便攜、經濟、高效、準確的特點。它可以獨立的進行細胞種植和培養以及藥物的多濃度梯度檢測。並可以體外實時在線的觀測細胞、組織和器官的生物學行為，從而為細胞-藥物研究和高通量藥物篩選提供了一個全新的技術平臺。
【專利說明】一種自設度梯度藥物篩選器官晶片及其製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種器官晶片及其製備方法，特別涉及一種自設濃度梯度藥物篩選器官晶片及其製備方法。屬於生物醫藥【技術領域】。
【背景技術】
[0002]器官晶片是一個基於多通道流體晶片的三維細胞培養系統，由多個模擬人體組織和器官環境的細胞培養分區集合而成。在各分區通過仿生循環系統進行連接。器官晶片中還包含有集成化的微型傳感和成像器件用於實時、在線檢測三維細胞聚集體生長的微環境和生長狀態、組織和器官間相互作用等。其主要目標是要在晶片上模擬生物體的環境進行細胞、組織和器官的培養，研究並控制細胞在體外培養過程中的生物學行為，從而實現能夠模擬生物體環境的器官移植以及藥物評價等。
[0003]從藥物研發的基本過程中，我們可以知道研發安全有效的藥物是一個長期、艱難和昂貴的進程。其中，藥物研發最具挑戰性的一個環節是如何測試藥物的有效性和安全性。通常情況下，對正常和疾病的生理過程的分析通常需要使用動物模型，它不但昂貴、耗時，而且存在倫理上的爭 論，更大的問題是，使用動物模型常常無法準確預測人類的正常生理反應。因此，通過體外培養人體細胞，模擬細胞在正常情況下的分裂分化、生長繁殖和信息交流等，實驗者就可以藉助特定的檢測和分析手段獲得需要的測試數據。
[0004]器官晶片突破了細胞培養和模式動物實驗的局限。它多採用微流控晶片技術，微通道的尺寸可以與細胞尺寸相當，可以精確地控制微環境的成分、溫度等因素，儘可能模擬細胞外基質的情況，增強實驗的可靠性和可操作性。同時可以設計不同的二維或三維結構和精密加工成微電極等器件實現細胞的培養、定位、有序、圖案化以及檢測等多種功能。並可以實現集濃度梯度稀釋，自動加樣，細胞培養，細胞刺激和標記以及細胞形貌和功能檢測等單元操作於一體，實現細胞多參數的高內涵篩選。它也符合高通量藥物篩選的微型化，自動化和低成本化要求。
[0005]目前，人體器官晶片的研究在國際上雖然尚處於起步階段，但是由於其在藥物開發、疾病診斷和治療方面的應用前景，受到了國際上的廣泛重視。歐美日等國家研究機構已在政府資助下開展相關的基礎研究並取得了一定的研究成果，開發出不同種類的腦晶片、肺晶片、心臟晶片、腎晶片、肝臟晶片、脾晶片、腸晶片等多種器官的晶片，同時也有多器官集成在同一個微小晶片上，以期用於器官功能模擬和替代動物模型進行藥物篩選等研究。但是，能夠高通量進行藥物篩選的器官晶片並不多見，幾乎都是單一器官種類細胞，缺乏平行性實驗對比，不能實現多濃度梯度藥物的批量化檢測。
【發明內容】
[0006]技術問題:
[0007]本發明的目的是提供一種自設濃度梯度藥物篩選器官晶片及其製備方法，該器官晶片進行多細胞的平行共培養並和藥物相互作用，進行多濃度梯度藥物的安全性和有效性評估，解決了傳統的藥物篩選的使用動物模型，昂貴、耗時，且存在倫理爭議，解決了現有細胞培養體系用途單一，不易於微型化和集成化等缺點。最後並且提供了這種自設濃度梯度藥物篩選器官晶片的製備方法。
[0008]技術方案:為了解決現有技術中的這些問題，本發明提供的技術方案:
[0009]一種自設濃度梯度藥物篩選器官晶片，該晶片由多細胞共培養體系，種子細胞培養體系，空白對照體系和藥物檢測體系四部分組成；其中多細胞共培養體系包括3個細胞培養室和I個培養液儲存池，培養液儲存池設有進出口 ；種子細胞培養體系包括8個細胞培養單元，每個細胞培養單元包括3個細胞培養室，溶液出口，彎管和2個培養液儲存池，培養液儲存池設有進口和出口 ；空白對照體系包括I個細胞培養單元，彎管，其彎管同時與多細胞共培養體系和種子細胞培養體系連通；藥物檢測體系包括2個平行自設濃度梯度系統，每個自設濃度梯度系統包括藥物儲液池和藥物進口，藥物進口聯通4個藥物入口通道:I種藥物入口通道、2種藥物入口通道、3種藥物入口通道、4種藥物入口通道；藥物入口通道另一端通過彎管連接種子細胞培養體系，彎管的寬度依次增加；培養基通道起始於多細胞共培養體系，由晶片中間部分向兩側分支且對稱分布，經由種子細胞培養體系，最後到達藥物檢測體系。
[0010]所述器官晶片的片基為聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚二甲基矽氧烷(PDMS)、聚碳酸酯(PC)、玻璃、矽片、生物膜、聚四氟乙烯膜或硝酸纖維素膜的一種或幾種。
[0011]所述細胞培養室的培養基質為明膠、殼聚糖、絲素蛋白、纖維蛋白膠、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)、基質膠(Matrigel)、海藻酸鈉、聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇丙烯酸酯(PEGDA)或異甲基丙烯醯胺(NIPAM)的一種或幾種。
[0012]所述多細胞共培養體系中的培養室的直徑相同，為1.5mm~2.0mm，多細胞共培養體系中儲液池直徑為2.0mm~3.0mm,培養基通道的寬度隨分流依次從600 μ m遞減為300μπι和200μπι，藥物入口通道另一端連接種子培養體系的彎管的寬度分別為200μπι、300 μ m、450 μ m和600 μ m,分別對應於藥物檢測體系的4個藥物入口通道:I種藥物入口通道、2種藥物入口通道、3種藥物入口通道、4種藥物入口通道。
[0013]所述多細胞共培養體系中的儲液池和所有流體通道的有效深度相同，為100 μ π!~200 μ m,小於多細胞共培養體系中的細胞培養室的有效深度，細胞培養室有效深度為 200 μ m ~600 μ m。
[0014]所述晶片的細胞培養單元中的彎管的長度依晶片尺寸增減，彎曲弧數為I~50。
[0015]所述藥物檢測系統的4個藥物入口通道:1種藥物入口通道、2種藥物入口通道、3種藥物入口通道、4種藥物入口通道，各通道寬度為100 μ m，長度依次縮短，分別為15mm，
13.5mm, 4.5mm 和 3.5mm η
[0016]所述的一種自設濃度梯度藥物篩選器官晶片的製備方法，包括以下步驟:
[0017](I)用計算機輔助設計軟體設計和繪製器官晶片中各層晶片的微結構和微通道圖形，通過微加工技術在各層器官晶片基材表面上進行加工；
[0018] (2)利用雙層粘性薄膜，將製備或複製的各層硬質晶片對齊、粘合、加壓和鍵合，組成自設濃度梯度藥物篩選器官晶片；WSU8光刻膠反模版進行聚二甲基矽氧烷(PDMS)晶片的複製，將聚二甲基矽氧烷液體灌注在反模版上，並經固化成型後進行等離子體處理，進行晶片鍵合。[0019]所述的一種自設濃度梯度藥物篩選器官晶片的製備方法，其中微加工方法是數控銑刻方法、雷射刻蝕方法、軟刻蝕方法、模數法方法、熱壓法方法、化學腐蝕方法或光刻、電鑄和注塑綜合方法(LIGA技術)的一種或幾種。
[0020]有益效果:
[0021](I)器官晶片以注射泵推動力及液差產生的重力作為流體流動驅動力，可以批量連續供應，多次利用，靈活設計和組裝。
[0022](2)通過控制藥物入口的微通道數量和流體的流動路徑長短來控制藥物濃度，同時可以調節培養基流速和藥物流速的比值來控制不同的濃度梯度，自設的8個濃度梯度和每個濃度三個平行樣以及空白對照實驗，可以很好的保證實驗結果的可比性和準確性以及極大地提高藥物篩選的效率，同時減少試驗動物的需求。
[0023](3)自設濃度梯度藥物篩選器官晶片操作簡單，集成度高，檢測範圍廣，靈敏度高，且平行培養能力高，能更真實的反應不同細胞的相互作用及影響，實現低藥物消耗、多種細胞共培養，並行高通量的分析不同濃度梯度的藥物和不同細胞的相互作用，並可以體外實時在線的觀測細胞、組織和器官的生物學行為，從而為細胞-藥物研究和高通量藥物篩選提供了一個全新的技術平臺。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖1.自設濃度梯度藥物篩選器官晶片的設計效果圖。其中，I為多細胞共培養體系，2為種子細胞培養體系，3為空白對照體系，4為藥物檢測體系，5為細胞培養室，6為儲液池兼進出口，8為細胞培養室，9為儲液池兼進口，10為儲液池兼出口，11為出口，12為彎管，13為藥物進口，14為藥物儲液池，15為I種藥物入口通道，16為2種藥物入口通道，17為3種藥物入口通道，18為4種藥物入口通道，19為培養基通道，20為藥物和培養基共用通道，21為空白對照體系彎管。
【具體實施方式】
[0025]以下結合具體實施例對上述方案做進一步說明。應理解，這些實施例是用於說明本發明而不限於限制本發明的範圍。實施例中採用的實施條件可以根據具體廠家的條件做進一步調整，未註明的實施條件通常為常規實驗中的條件。
[0026]實施例1自設濃度梯度藥物篩選器官晶片製備
[0027]用計算機輔助設計軟體設計和繪製自設濃度梯度藥物篩選器官晶片的微結構和微通道圖形，首先採用微機電加工中的矽深刻蝕技術製作矽摸具，或在底片上旋塗光刻膠，通過光刻自顯影后形成光刻膠摸具，也可利用數控CNC系統加工製備晶片的微結構和微通道。將聚二甲基矽氧烷(PDMS)的預聚體與固化劑混合，經超聲、攪拌、真空脫氣等步驟後澆鑄在模具上，適當溫度熱反應一定時間，自然冷卻，將聚二甲基矽氧烷(PDMS)晶片從模具上小心揭下，並與潔淨的蓋進行對齊、粘合、加壓縫合，製成有8個重複細胞培養單元，2個藥物供給體系，I個空白對照體系和I個共培養體系的自設濃度梯度藥物篩選器官晶片。
[0028]實施例2自設濃度梯度藥物篩選器官晶片製備
[0029]用計算機輔助設計軟體設計和繪製自設濃度梯度藥物篩選器官晶片的微結構和微通道圖形，利用數控CNC系統加工製備三層聚甲基丙烯酸(PMMA)晶片的微結構和微通道。分別用自來水、蒸餾水清洗各層晶片，並用乙醇擦拭晶片表面殘留的指紋、油潰等汙潰。在雙面膠薄膜上，用刻字機加工製備晶片所需要的微結構和微通道，將晶片基底和蓋子進行對齊、粘合、加壓縫合，製成有8個重複細胞培養單元，2個藥物供給體系，I個空白對照體系和I個共培養體系的自設濃度梯度藥物篩選器官晶片。
[0030]實施例3細胞的植入和共培養
[0031]封閉藥物進出口和培養基進出口，打開種子細胞培養系統進出口，外加管道連接每四個梯度單元的進出口，從而連通四個單元。將細胞溶液在進口內注入種子細胞，控制層流速度，使細胞溶液緩慢流經微通道進入細胞培養室，從而一次性完成種子細胞的植入。關閉種子細胞培養體系進出口，打開共培養體系進出口，同樣完成細胞的植入。空白對照體系按同樣步驟完成細胞的植入和培養。細胞培養一段時間，待貼壁或三維固著生長後，進行培養基的循環流動培養，共培養體系細胞分泌的生長因子等活性物質會促進種子細胞的生長，增殖和分化等。
[0032]實施例4藥物活性及安全性檢測
[0033]細胞穩定生長和增殖後，進行藥物檢測。打開藥物進出口，通過控制培養液和藥物溶液的流速來控制不同的藥物濃度，同時，不同的藥物通道數目設計和流經路徑長度不同也會自動形成4個濃度梯度，這樣兩個藥物檢測體系總共可以形成8個濃度梯度。藥物和培養液與種子細胞進行充分地接觸和反應，並和空白對照體系的正常細胞活性進行對比，從而進行藥物對正常細胞的安全性或藥物對病理細胞的藥物活性的檢測。 [0034]上述實例只為說明本發明的技術構思及特點，其目的在於讓熟悉此項技術的人是能夠了解本發明的內容並據以實施，並不能以此限制本發明的保護範圍。凡根據本發明精神實質所做的等效變換或修飾，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.一種自設濃度梯度藥物篩選器官晶片，其特徵是該晶片由多細胞共培養體系(1)，種子細胞培養體系(2)，空白對照體系(3)和藥物檢測體系(4)四部分組成；其中多細胞共培養體系(I)包括3個細胞培養室(5)和I個培養液儲存池(6)，培養液儲存池(6)設有進出口 ；種子細胞培養體系(2)包括8個細胞培養單元(7)，每個細胞培養單元(7)包括3個細胞培養室(8)，溶液出口(11)，彎管(12)和2個培養液儲存池，培養液儲存池設有進口(9)和出口(10);空白對照體系(3)包括I個細胞培養單元(7)，彎管(21)，其彎管(21)同時與多細胞共培養體系(I)和種子細胞培養體系(2)連通；藥物檢測體系(4)包括2個平行自設濃度梯度系統，每個自設濃度梯度系統包括藥物儲液池(14)和藥物進口(13)，藥物進口(13)聯通4個藥物入口通道:I種藥物入口通道(15)、2種藥物入口通道(16)、3種藥物入口通道(17)、4種藥物入口通道(18);藥物入口通道另一端通過彎管(20)連接種子細胞培養體系(2)，彎管(20)的寬度依次增加；培養基通道(19)起始於多細胞共培養體系(1)，由晶片中間部分向兩側分支且對稱分布，經由種子細胞培養體系(2)，最後到達藥物檢測體系(4)。
2.根據權利要求1所述的一種自設濃度梯度藥物篩選器官晶片，其特徵在於所述器官晶片的片基為聚甲基丙烯酸甲酯PMMA、聚二甲基矽氧烷PDMS、聚碳酸酯PC、玻璃、矽片、生物膜、聚四氟乙烯膜或硝酸纖維素膜的一種或幾種。
3.根據權利要求1所述的一種自設濃度梯度藥物篩選器官晶片，其特徵在於所述細胞培養室的培養基質為明膠、殼聚糖、絲素蛋白、纖維蛋白膠、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸RGD、基質膠Matrigel、海藻酸鈉、聚乙二醇PEG、聚乙二醇丙烯酸酯PEGDA或異甲基丙烯醯胺NIPAM的一種或幾種。
4.根據權利要求1所述的一種自設濃度梯度藥物篩選器官晶片，其特徵在於所述多細胞共培養體系(I)中的培養室(5)的直徑相同，為1.5_~2.0_，多細胞共培養體系(I)中儲液池(6)直徑為2.0mm~3.0mm,培養基通道(19)的寬度隨分流依次從600 μ m遞減為300μπι和200μπι，藥物入口通道另一端連接種子培養體系(2)的彎管(20)的寬度分別為20(^111、30(^111、45(^111和60(^111，分別對應於藥物檢測體系⑷的4個藥物入口通道:I種藥物入口通道(15)、2種藥物入口通道(16)、3種藥物入口通道(17)、4種藥物入口通道(18)。
5.根據權利要求1所述的一種自設濃度梯度藥物篩選器官晶片，其特徵在於所述多細胞共培養體系(I)中的儲液池(6)和所有流體通道的有效深度相同，為IOOym~200μπι，小於多細胞共培養體系(I)中的細胞培養室(5)的有效深度，細胞培養室(5)有效深度為200 μ m ~600 μ m。
6.根據權利要求1所述的一種自設濃度梯度藥物篩選器官晶片，其特徵在於所述晶片的細胞培養單元(7)中的彎管(12)的長度依晶片尺寸增減，彎曲弧數為I~50。
7.根據權利要求1所述的一種自設濃度梯度藥物篩選器官晶片，其特徵在於所述藥物檢測系統(4)的4個藥物入口通道:1種藥物入口通道(15)、2種藥物入口通道(16)、3種藥物入口通道(17)、4種藥物入口通道(18)，各通道寬度為100 μ m，長度依次縮短，分別為15mm, 13.5mm, 4.5mm 和 3.5mm η
8.如權利要求1所述的一種自設濃度梯度藥物篩選器官晶片的製備方法，包括以下步驟:(1)用計算機輔助設計軟體設計和繪製器官晶片中各層晶片的微結構和微通道圖形，通過微加工技術在各層器官晶片基材表面上進行加工； (2)利用雙層粘性薄膜，將製備或複製的各層硬質晶片對齊、粘合、加壓和鍵合，組成自設濃度梯度藥物篩選器官晶片；以光刻膠反模版進行聚二甲基矽氧烷晶片的複製，將聚二甲基矽氧烷液體灌注在反模版上，並經固化成型後進行等離子體處理，進行晶片鍵合。
9.根據權利要求8所述的一種自設濃度梯度藥物篩選器官晶片的製備方法，其特徵在於所述微加工方法是數控 銑刻方法、雷射刻蝕方法、軟刻蝕方法、模數法方法、熱壓法方法、化學腐蝕方法或光刻、電鑄和注塑綜合方法的一種或幾種。
【文檔編號】C12M1/34GK103981085SQ201410229490
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月27日 優先權日:2014年5月27日
【發明者】顧忠澤, 鄭付印, 趙遠錦, 程瑤, 劉慈慧, 湯棟梁, 王潔 申請人:東南大學