沙門氏菌活疫苗的製作方法

2023-06-08 17:13:01

專利名稱：沙門氏菌活疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及沙門氏菌活疫苗的特殊用途，以前未曾使用的新沙門氏菌活疫苗，製備這種疫苗的方法以及適當的沙門氏菌疫苗株。
大部分沙門氏菌決定的人的胃腸炎感染是由汙染的動物產品引起的。最近，特別是被現今主要存在的血清型腸炎沙門氏菌汙染的雞和雞蛋，都已造成越來越多的感染。然而源自大量培養的動物的所有食品都受影響。一般許多動物呆在一個有限的空間內，這就加速了動物群間傳染的擴散。
按常規獸醫措施切斷傳染鏈可以減小從感染動物到人的傳染轉移的危險。另外，在處理汙染的動物產品過程中嚴格遵守廚房衛生規則可以防止向人的轉移。但是在食品儲存和處理過程中，特別是前述規則往往不能被遵守。因此，迫切需要從開始時就排除處理感染動物的可能性。這可以通過如給動物群接種抗沙門氏菌感染的疫苗而獲得。
適當的沙門氏菌活疫苗必須符合各種不同的條件1.必須調節用於製備疫苗的菌株的毒性，一方面保證非顯性感染，另一方面保證疫苗株在宿主組織中的足夠持久性，這是高免疫原性的必要條件。
2.另外，相對其毒性和其保護特性，必須廣泛保證所用疫苗株的穩定性，即必須保證它們不會突變返回致病性野生株。
3.為了使傳染的可能性減小，應確保疫苗株的活體排洩不是持久性的，並且它們在環境中僅在短時間內存活。
下面詳細討論活疫苗應符合的上述三個條件。如1.中所述，適當的沙門氏菌活疫苗的產生是基於減小病原性沙門氏菌的毒性(減毒)和同時保留它們的抗原結構，從而在宿主中具有致免疫效果。一種可能性是如使用缺失突變體作為疫苗株，如pur或aro營養缺陷型克隆。這些疫苗株的減毒水平依賴於體內代謝物的缺乏，這可能防礙對免疫宿主的準確適應。關於這一點，參考EP0263528，其中描述了具有不同減毒水平的鼠傷寒沙門氏菌的穩定asp突變體。通過選擇適當的asp突變體可製備具有與每種不同的宿主種相適應的減毒水平的疫苗株。
減毒的另一種可能性是使用這樣的疫苗株，其減毒作用可追溯到代謝漂移突變(以下稱為stwd突變或標記)。「代謝漂移」指所有關鍵酶和功能上重要的細胞區已分別通過突變產生功能改變，例如核糖體蛋白、促旋酶、RNA聚合酶、透性酶，這些突變的結果使翻譯、DNA複製、DNA轉錄或穿透受到或多或少的明顯擾亂。另外，這種stwd突變體對特異抗生素和其它物質(有毒物質)有抗性。stwd突變體很容易在實驗室作為染色體抗生素抗生突變體得到。關於這一點，從EP0263528已知例如對萘啶酮酸(Nal)、鏈黴素(Sm)或利福黴素(Rif)有抗性的stwd突變體。特別是如果將幾個stwd標記整合在一個疫苗株中(雙標記或三標記疫苗株)，事實上得到了無限的可能性以製備適應於每個特異性宿主種類的理想的減毒水平。
關於「通過stwd突變減毒」的現有技術，參考下列出版物DD-WP155294；DD-WP218834；DD-WP235828；DD-WP253182；DD-WP253184；DD-WP281118；DD-WP294420；EP0263528.
另一個條件(以上2.中提及的)是通過突變得到的減毒疫苗株不會突變返回毒性野生株。該穩定性要求一方面可通過僅使用在體外檢測不到回復突變或其回復突變率＜10-7的疫苗株來達到。另一種可能性是使用含12個獨立減毒的突變的疫苗株。這樣，幾乎可以排除復原突變的可能性。
在上述3.中提及的最後一個條件與「切斷傳染鏈」有關，特別涉及關於可能的排洩和疫苗株在接種宿主體外長期存活的危險。關於這一點，最好減少排洩和疫苗株在環境中生存的能力。另一方面，為了保證充分的免疫應答，經例如口服或非胃腸道施用後，疫苗株在宿主組織中的臨時生存能力應不受損害或僅略受損害。從DD-WP218836、DD-WP231491、DD-WP253182、DD-WP253183、DD-WP253184和EP0263528中已知符合這種要求的疫苗株突變體。現有技術中建議使用減小排洩和在環境中的生存能力的所謂抗流行標記，來優化適當的疫苗株。抗流行標記在廣義上表徵外膜突變，引起外膜中通透屏障的功能性變異。
可根據應用目的得到具有不同抗流行標記的疫苗株。目前已知的抗流行標記，根據它們在外膜中產生的變化，可分為三類。第一類包括所謂的hst標記。hst標記的摻入使疫苗株變得對膽汁、陰離子洗滌劑、大環內酯抗生素和其它有毒物質高度敏感。由於對膽汁的高敏性，導致腸腔中已存在的疫苗株失活，從而減小隨糞便的排洩。由於外膜中缺乏對表面活性劑和大環內酯及其它毒性物質的通透屏障，如果疫苗株細菌被排洩，它們在環境中的存活時間縮短。因此，當使用包括hst標記的疫苗株時，幾乎可以排除傳染。但當使用常規劑量的疫苗時，含hst標記的疫苗株只能經非胃腸道施用。由於對膽汁的高敏性，如果口服施用，其毒性受到一定程度的影響，致使只有使用特別高劑量的疫苗才能取得足夠的免疫應答。因此，口服施用的溶液將提供包括其它兩類之一的抗流行標記的疫苗株。一類包括所謂的rbt標記(對膽汁耐受性的回覆突變)。可從hst標記突變得到rbt標記。它提供具有與hst標記等同的抗流行能力的疫苗株。但與hst標記相反，含rbt標記的疫苗株對膽汁有耐受性，從而可以口服施用而不減低毒性損害接種效果。另一類所謂的rtt標記(對表面活性劑耐受性的回覆突變)的情況與此相同。rtt標記可從rbt標記突變得到。含rtt標記的疫苗株對表面活性劑有耐受性，同時由於保留了對大環內脂和其它有毒物質的高敏性，它具有足夠的抗流行能力。另外，rtt標記株可毫無問題地口服施用。
以這些信息和這些出版物為基礎，可製備符合所有要求條件的活疫苗。對每種宿主的適應可在如動物試驗系列中進行。
還有另一問題需要解決。儘管採取了所有的預防措施，但還不能排除進行動物接種或疫苗生產的人與事實上已減毒但仍為病原性的沙門氏菌疫苗株接觸。對於健康人來說，幾乎沒有任何感染的危險。但如果人的免疫系統減弱(如由HIV感染所致)，與這種疫苗株的接觸可導致沙門氏菌的感染。
因此，本發明的目的是提供抗沙門氏菌感染的活疫苗，從已知現有技術開始，對待免疫宿主最優化減毒，當口服或非胃腸道施用時提供減低野生株排洩的免疫，對免疫系統弱的人僅構成很小的危險或根本不構成危險。本發明的另一目的是提供製備沙門氏菌活疫苗的方法，它通過使用比常規方法明顯少的動物實驗得到對具體宿主適合的最佳活疫苗。最後，本發明是提供適合於雞的沙門氏菌活疫苗株。
此目的通過下述第1和2項的特異性活疫苗、第10項製備沙門氏菌活疫苗的特異方法、以及第20項的活疫苗株來達到的。
1.包含大環內酯抗生素敏感性標記(外膜標記)的至少一種減毒免疫原性沙門氏菌活疫苗株的用途，它用於製備對特異宿主的活疫苗，在由該特異宿主引起的另一宿主感染的情況下，該活疫苗有助於用大環內酯類抗生素對被感染動物進行有效的治療。
2.從至少一種減毒的免疫原性活疫苗株製得的沙門氏菌活疫苗，其特徵在於該疫苗株具有一種外膜標記，該標記除任選對大環內酯類抗生素具有敏感性外，導致疫苗株對除大環內酯類抗生素外的特異的治療有效抗生素的敏感性提高。
3.根據1或2的活疫苗，其特徵在於該疫苗株包括用於減毒的至少一種染色體抗生素抗生突變，但不排斥對治療有效的抗生素的敏感性提高。
4.根據2或3的活疫苗，其特徵在於所述外膜標記使疫苗株對喹諾酮類、氯黴素類或四環素類抗生素的敏感性提高。
5.根據4的活疫苗，其特徵在於所述外膜標記使疫苗株對抗生素ciprofloxacin的敏感性提高。
6.根據1-5的活疫苗，其特徵在於疫苗株含有用於減毒的代謝漂移突變，包括鏈黴素抗性和/或利福黴素抗性。
7.根據1-6的活疫苗，其特徵在於它包括至少一種血清型O-類B(如鼠傷寒沙門氏菌)、D(如腸炎沙門氏菌)、C(如嬰兒沙門氏菌)和E(如鴨沙門氏菌)的疫苗株作為單、雙、三或四疫苗。
8.根據6的活疫苗，其特徵在於-單疫苗由疫苗株S.tmSsq/Sm60/Rif42(No.4242；保藏號DSM8433)或S.tmNal2/Rif9/Rtt(No.4223；保藏號DSM8432)或S.entSsq/Sm24/Rif12(No.4266；保藏號DSM8435)或S.entSsq/Sm24/Rif12k(No.4298；保藏號DSM9362)或S.entSsq/Sm24/Rif12g(No.4297；保藏號DSM9361)或S.entSsq/Sm24/Rif3(No.4296；保藏號9360)組成，-雙疫苗由上述一種S.tm疫苗株和S.entSsq/Sm24/Rif12或S.entSsq/Sm24/Rif12k或S.entSsq/Sm24/Rif12g或S.entSsq/Sm24/Rif3組成，-三或四疫苗由上述S.tm疫苗株之一，S.entSsq/Sm24/Rif12或S.entSsq/Sm24/Rif12k或S.entSsq/Sm24/Rif12g或S.entSsq/Sm24/Rif3，S.infSsq/Sm153/Rif(No.4289；保藏號DSM8434)和/或S.anaSsq/Sm81/Rif21(No.4279；保藏號DSM8441)組成。
9.用於口服免疫小雞以及口服或經非胃腸道免疫/加強免疫雞以抗沙門氏菌感染的活疫苗，該活疫苗是從至少一種減毒的免疫原性疫苗株製得的，特別是根據1-8之一的活疫苗，其特徵在於選擇增代時間為約28-34分鐘的疫苗株用於製備活疫苗。
10.沙門氏菌活疫苗的生產方法，該活疫苗的減毒水平被優化適合於宿主，並且從至少一種減毒的免疫原性沙門氏菌活疫苗株製得，其特徵在於具有適於宿主的延長的增代時間的疫苗株用作減毒當量，其中適合於宿主(血清型)的疫苗株的具體延長的增代時間是在一次實驗中確定的。
11.根據10的方法，其特徵在於在初步試驗中適於宿主的延長的增代時間是如此測定的從一系列分級延長增代時間開始，根據最大可能減毒水平/延長的增代時間和野生株排洩的優化減低之間的關係選擇適當的疫苗株，任選地將其延長的增代時間作為減毒當量轉用到同屬其它血清型。
12.根據10或11的優化適於小雞或雞的疫苗的製備方法，其特徵在於選擇疫苗株，其傳代時間與野生株相比從約22分鐘延長到了約28-34分鐘。
13.根據12的方法，其特徵在於所用疫苗株得自野生株，首先提供給野生株鏈黴素(Sm)或萘啶酮酸標記，使增代時間從22分鐘延長到25-29分鐘，然後再提供利福黴素(Rif)標記，進一步延長增代時間，分離作為增代時間為28-34分鐘的適當疫苗株的克隆，再以已知方式製備疫苗如從形成的疫苗株中選擇疫苗株來製備。
14.根據10-13的方法，其特徵在於如鼠傷寒沙門氏菌(S.tm)、腸炎沙門氏菌(S.ent)、嬰兒沙門氏菌(S.inf)和鴨沙門氏菌(S.ana)用作沙門氏菌血清型。
15.根據14的方法，其特徵在於Sm-Rif代謝漂變與-增代時間為約31分鐘的S.tm疫苗株(i，p，LD50小鼠為約105(野生株約101)cfu)，-增代時間為約28分鐘的S.ent疫苗株(i，p，LD50小鼠為約107(野生株約105)cfu)，-增代時間為約31分鐘的S.inf疫苗株，-增代時間為約32分鐘的S.ana疫苗株，結合，用作小雞/雞優化減毒疫苗。
16.根據13-15的方法，其特徵在於向Sm/Rif疫苗中摻入外膜標記，其對ciprofloxacin(氯黴素、強力黴素等)的敏感性增至4倍，同時排洩和在環境中的生存能力明顯減小。
17.根據15或16的方法，其特徵在於增加對ciprofloxacin的敏感性的標記通過誘變方法，或摻入野生株中或摻入Sm/Rif雙標記疫苗株中，然後在0.5μg氯黴素/ml存在下進行常規青黴素篩選。
18.根據13-17的方法，其特徵在於標記摻入的順序是隨意的。
19.根據10-18的方法，其特徵在於無外膜標記的疫苗株用作疫苗。
20.增代時間為28-32分鐘的沙門氏菌疫苗株。
21.根據20的沙門氏菌疫苗株，其為保藏號為8432、8433、8434、8435、9360、9361、9362和/或8441的疫苗株，以及增代時間為28-34分鐘的它們的較高或較低減毒變異體。
22.根據20或21的疫苗株作為權利要求1或2的活疫苗用於口服免疫小雞以及口服和經非胃腸免疫/加強免疫雞抗沙門氏菌感染的用途。
第1項說明已知的沙門氏菌活疫苗株(見如EP0263528)用於製備特異的活疫苗的用途。已知的沙門氏菌活疫苗株包含外膜標記以及減毒標記(如營養缺陷型標記或stwd標記)，使它們具有抗流行能力(減少宿主排洩及減小在環境中的存活率)。另外還使用了外膜標記，使疫苗株對大環內酯類抗生素敏化。該抗生素敏化迄今只用於選擇適當的外膜突變體，即在疫苗株的製備中。根據本發明，第一次認識到構成外膜標記的疫苗株的大環內酯敏感性還可在使用該方法產生的疫苗株時作為安全機制起作用。如此設計該疫苗，使得在該疫苗引起另一宿主感染的情形下，可用大環內酯抗生素對感染宿主進行有效的治療。僅通過選擇其繁殖可經施用合理劑量大環內酯抗生素得以控制的疫苗株(帶有外膜標記)製備疫苗，就可相當容易地達到此目的。
根據第1項以特異方式使用的已知沙門氏苗活疫苗株，由於它們的外膜標記而顯示對大環內酯的敏感性。除對疏水性抗生素(大環內酯類如紅黴素)的敏感性提高的外膜突變體外，還描述了其它外膜突變體(如Hancock，R.E.W.Ann.Rev.Microbiol，1984，38，237-264)，關於對親水性、疏水性和多陽離子抗生素的敏感性，它們有時具有不同的通透性。迄今為止，這種外膜標記在細菌活疫苗的製備中不重要。
第2項第一次提出包括具有一種外膜標記的至少一種減毒活疫苗株而製備的沙門氏菌活疫苗，該外膜標記使疫苗株對除大環內酯類以外的特異的治療有效抗生素的敏感性提高。因此，用於製備本發明的沙門氏菌活疫苗的疫苗株包括一種一般為其提供抗流行能力(切斷傳染鏈)及任選地對大環內酯類的敏感性，但無論如何提供對另一特異的治療有效抗生素的高敏感性的外膜標記。使用選定的特異治療有效抗生素可相當容易地檢測到該疫苗株，所以具有適當外膜標記的疫苗株的製備並不會構成大問題。應認識到對於可能的要求治療由該疫苗引起的意外傳染的可能性，優選選擇對所使用沙門氏菌血清型構成良好結果的這種抗生素。
另外，應認識到所選活疫苗株衍生自流行的血清型。
在3-9項中提出了第1和2項的本發明活疫苗的優選實施方案。
如上所述，活疫苗的減毒有各種可能性。一種可能性是將營養缺陷型標記(如asp)包括在疫苗株中。根據第3項，優選給疫苗株提供至少一種染色體抗生素抗性突變。染色體抗生素抗性基本由上述stwd標記構成。已證明使用選擇的stwd標記及幾種這樣的標記的特異組合都可使疫苗株的減毒水平最優化適應水平。當為了疫苗株減毒而選擇這種染色體抗生素抗性突變時，必須保證它們不排斥由外膜標記產生的對治療有效抗生素的高敏性。因此，在開發疫苗株的過程中，首先確定哪一種治療有效的抗生素將用於疫苗的可能處理。根據這一點，為疫苗減毒選擇疫苗株和其染色體抗生素抗性突變。
根據本發明的另一優選實施方案，選擇外膜標記使其為疫苗株提供(除抗流行能力和任選的大環內酯敏感性以外)對包括喹諾酮類、氯黴素類或四環素類抗生素的高敏性。特別優選為疫苗株提供對抗生素ciprofloxacin(現今對沙門氏菌最有效的抗生素)的高敏性的外膜標記。在製備後一種疫苗株時，為了減毒而提供代謝漂移突變，產生鏈黴素和/或利福黴素抗性特別有利。這些抗生素抗性不幹擾疫苗株對抗生素ciprofloxacin的可能敏感性。
根據所期望的作用譜，本發明的沙門氏菌活疫苗可從O-類B(如鼠傷寒沙門氏菌)、D(如腸炎沙門氏菌)、C(如嬰兒沙門氏菌)和E(如鴨沙門氏菌)中一種或幾種不同血清型的疫苗株作為單、雙、三或四疫苗。關於這一點，優選特別適合的如第8項所定義的疫苗。
上邊已經提到的另一個問題是，由於不同的敏感性，必須為每種宿主提供具體適應的活疫苗。關於這一點，可參考已上市的鼠傷寒沙門氏菌疫苗「ZoosaloralDessau」，在單次口服施用後可充分免疫小牛，但三次口服免疫後才能保護雞抗腹膜內毒性感染(Linde，K.Vaccine1990，8，278-282)。關於對鼠傷寒沙門氏菌的敏感性，根據宿主種類，構成hierarchy小鼠＞小牛＞雞。根據這一點，為了補償低敏感性，小雞和雞的如鼠傷寒沙門氏菌疫苗株必須具有較小的減毒水平(與小鼠相比)。可假設其它沙門氏菌血清型相應地具有同樣順序。
現發現沙門氏菌活疫苗的增代時間與它們的減毒水平相關。特別是當疫苗株為了減毒而被提供了染色體抗性突變時，發生增代時間和減毒水平之間的這種相關。
增代時間和增毒水平之間的關係使得可以不經事先的動物試驗就相對可靠地選擇適於特異宿主的疫苗株。關於這一點，第9項提出了免疫小雞和雞的適當活疫苗，其由至少一種增代時間為約28-34分鐘的減毒疫苗株製得。具有這種增代時間的疫苗株減毒水平較小(與小牛和小鼠的疫苗株相比)，補償了小雞/雞對如鼠傷寒沙門氏菌和其它血清型沙門氏菌的低敏感性。
如上所述，對宿主種小雞/雞的有效沙門氏菌疫苗特別感興趣。迄今已保藏/出版的鼠傷寒沙門氏菌stwd突變體與該宿主種無直接關係。根據第8和9項，現提出了可為小雞/雞優化減毒，或已經優化減毒的疫苗。關於這一點，強調了疫苗株S.tmNal2/Rif9/Rtt，它已為小雞/雞進行了最優化減毒。疫苗株S.tmNal2/Rif9也是這樣，它還沒有進行用於該申請的保藏，但仍然對它做出評述。所引用的疫苗株，其增代時間為約32分鐘。從這一事實已衍生出選擇相同或其它血清型的其它最優化減毒株的「減毒當量增代時間」。然而在選擇小雞/雞的適當疫苗株時，增代時間在28-34分鐘之間。這種差異表明這樣的事實小雞/雞對不同的株和每種血清型毒性的株依賴性差異有不同的敏感性。通過少數實驗系列，可從預選的增代時間為28-34分鐘的疫苗株中選擇對小雞/雞最優化減毒的那些疫苗株。有利的是，這至少使預選中所要求的動物實驗減少。
另外，關於可能宿主小雞/雞，如本發明所提出的，使用含有對特異治療有效抗生素高敏性的疫菌株的沙門氏菌活疫苗是特別令人感興趣的。雞與其它宿主種如人、小牛或小豬相比壽命較短，一般它們在比較短的培養時間以後，就被屠殺並做為冷凍或新鮮肉出賣。因為接種是在過去不很長的時間內進行的，可認為在屠殺時雞體內仍然存在活的沙門氏菌疫苗株細菌。然後它們可能進入環境。少量這種細菌的正常菌群是不明顯的。在這點上幾乎可以排除傳染的危險。然而，個別免疫系統減弱的危險病人(如帶有HIV病毒的病人)可被感染並出現臨床症狀。特別是關於這些人，要求由疫苗株引起的感染可被迅速控制而不產生任何問題。關於這一點，排除任何理論預測，摻入作為安全和治療標記的對治療有效抗生素的敏感性是合理的解決方法。
這種安全和治療標記的原形是所謂的ssq標記。帶有ssq標記的疫苗株具有對喹諾酮類，特別是對ciprofloxacin(目前對沙門氏菌最有效的抗生素)的高敏性。ssq標記也象上述的hst、rbt和rtt突變一樣，是一種外膜突變，因此，也具有或多或少的有特色的抗流行能力-取決於其膽汁和陰離子洗滌劑的耐受性和敏感性。
本發明不僅涉及特別安全的活疫苗的製備，另一個目的是提供製備活疫苗的方法，幾乎不用任何動物實驗製得對特異宿主優化減毒的活疫苗。
該目的通過包括第10項中所示特徵的方法來達到。該方法的原則是基於疫苗株的減毒(特別是摻入stwd標記)導致其增代時間延長(與野生株相比)。上述已經提到從延長的增代時間可得出關於疫苗株減毒水平的結論。因此，根據本發明的方法，在一次試驗(如動物試驗)中就足以確定適合宿主的疫苗株的增代時間。如此確定的延長的增代時間可作為進一步選擇疫苗株(相同血清型)的大致數據，或作為減毒當量轉化到同屬的其它血清型。
為了製備最適於小雞/雞的疫苗，例如選擇這樣的疫苗株，其增代時間與野生株(22分鐘)相比延長到了約28-34分鐘。所使用的疫苗株例如可從已具有鏈黴素(Sm)或萘啶酮酸(Nal)標記的野生株得到。這樣，使增代時間從22分鐘延長到25-29分鐘。然後，作為延長增代時間的另一標記，加入了利福黴素(Rif)標記。
本發明方法的其它有利實施方案在第14-19項中提出。這些項主要概括了關於選擇血清型，用於減毒的stwd標記、和摻入標記的順序的不同可能性。
根據本方法的主要特徵，這樣製備疫苗-第一步，為了製備低或中等減毒的菌株，分離具有特異抗生素抗性且顯示增代時間與沙門氏菌野生株相比延長了約3-6分鐘的表型的stwd突變體，-第二步，從這些低或中等減毒的第一標記株中再分離對抗生素抗性的另一表型的stwd突變體，增代時間再一次延長了3-6分鐘，從而得到一系列候選疫苗株，其延長了的增代時間等級為約28到34分鐘(野生株約22分鐘)-在小鼠模型中對於S.tm(因為LD50的log值與(延長的)增代時間線性相關)，它相當於LD50值等級為約105-107(野生株約101)cfu-再用該系列的單一疫苗109cfu一次口服免疫≤36小時齡小雞，2周後用106cfu的野生株口服感染免疫動物，最後根據「增代時間的最大可能延長/減毒水平和野生株排洩的最優化減低」這一關係得到優選的增代時間為約32分鐘的S.tm Nal2/Rif9菌株作為最佳原型疫苗株，以確定同一血清型和對小鼠僅有中等或缺少毒性的血清型的「減毒當量(延長的)增代時間」，-第三步，為了優化疫苗株，向通過stwd突變減毒的雙標記疫苗株中摻入「ssq安全和治療」標記，該安全和治療標記大約使其對ciprofloxacin(氯黴素、強力黴素等)的敏感性增至4倍，同時非顯著性地減低排洩和在環境中的生存能力。
所述順序是主觀隨意的，還可用毒性物質抗性表型(DD-WP235828)。
另外，本發明還涉及第20項的增代時間為28-32分鐘的特異沙門氏菌疫苗株，以及這些疫苗株的具有或較高或較低的減毒水平且增代時間為28-34分鐘的變異體。最後，第22項涉及這種疫苗株口服免疫小雞以及口服及非胃腸道免疫雞抗沙門氏菌感染的用途。
在以上各項和下述實施例中提及的疫苗株(有或無ssq標記)以及已保藏的疫苗株是可製得的具有分級減毒水平的所有候選疫苗株的實例。它們適於按已知繁殖方法製備免疫原性活疫苗，特別是用於小雞/雞的活疫苗。關於特別說明的帶有ssq標記的疫苗(保藏號為8433、8435、9362、8434、8441、8432)，指明其增代時間為約32分鐘。另一些帶有ssq標記的具體菌標的增代時間為約28分鐘(保藏號9361)和約30分鐘(保藏號9360)。對增代時間的這種說明不應理解為一種限制。考慮到毒性的株-依賴性差異(侵襲能力/菌落形成活性)，增代時間28-34分鐘也可能作為減毒當量。
下表中列出了不同血清型的優選沙門氏菌疫苗株。
*)這些微生物保芷在DSM-DeutscheSammlungvonMikro-organismenundZellkulturenGmbHMascheroderWeg1BD-38124Braunschweig以下通過幾個實施例詳細描述本發明。
實施例材料和方法所用菌株-野生株·鼠傷寒沙門氏菌(S.tm)415(Metschnikov-Institute，Moscow)i.p.LD50小鼠≤101cfu，增代時間≈22分鐘。
·腸炎沙門氏菌(S.ent)318(Prof.Selbitz，Leipzig大學)i.p.LD50小鼠≈105cfu，增代時間≈22分鐘。
·嬰兒沙門氏菌(S.inf)(Dr.Beer，Veterinarunter-SuchungsamtChemnitz)增代時間≈22分鐘。
·鴨沙門氏菌(S.ana)(Dr.Beer，Veterinarunter-SuchungamtChemnitz)增代時間≈22分鐘。
-用於檢測免疫小雞/雞的排洩減低的，具有中性萘啶酮酸和鏈黴素抗生的野生株·S.tmNal/Sm，增代時間≈22.5分鐘·S.entNal/Sm，增代時間≈22.5分鐘·S.infNal/Sm，增代時間≈22.5分鐘·S.anaNal/Sm，增代時間≈22.5分鐘-例如具有較低(或較高)減毒水平/相應地或少或多的延長了增代時間的其它雙或三標記突變體的野生株·S.tmSsq/Sm60/Rif42，增代時間≈31分鐘。
試驗室號4242；保藏號DSM8433·S.entSsq/Sm24/Rif12，增代時間≈32分鐘。
試驗室號4266；保藏號DSM8435·S.entSsq/Sm24/Rif12k，增代時間≈32分鐘。
試驗室號4298；保藏號DSM9362·S.entSsq/Sm24/Rif12g，增代時間≈28分鐘。
試驗室號4297；保藏號DSM9361·S.entSsq/Sm24/Rif3，增代時間≈30分鐘試驗室號4296；保藏號DSM9360·S.infSsq/Sm153/Rif7，增代時間≈31分鐘試驗室號4289；保藏號DSM8434·S.anaSsq/Sm81/Rif21，增代時間≈32分鐘試驗室號4279；保藏號DSM8441·S.tmNal2/Rif9/Rtt，增代時間≈32分鐘試驗室號4223；保藏號DSM8432作為為確定「減毒當量(延長的)增代時間」的原型株(對小雞/雞優化減毒)。
培養基-營養瓊酯(SIFIN，Berlin-Weiβensee)-胰蛋白 磷酸鹽培養液(Difco，U.S.A)抗生素-萘啶酮酸(CHINOIN，Budapest)野生株MHK6.2μg/ml-鏈黴素(Jenapharm)野生株MHK6.2μg/ml-利福黴素(UBM，Bacarest)野生株MHK12.5μg/ml
-Ciprofloxacin(Bayer)野生株MHK0.5μg/ml-氯黴素(Berlin-Chiemie)野生株MHK2.0μg/ml-強力黴素(Jenapharm)野生株MHK4.0μg/ml-紅黴素(Abbott)野生株MHK60.0μg/ml。
動物實驗和保存條件將來自不同養殖廠的產棕色蛋的母雞的小雞保持在籠中5-10分鐘，用火雞飼料以及加鋰水餵養動物。
口服免疫在孵育後36小時或(為了比較及確定最佳免疫年齡)在它們出生的第4天，每組10隻小雞，以單劑量109cfu，部分108cfu的具體免疫株從口施加到它們食管中。實際條件下的免疫還可能通過飲水進行(禁水4小時，然後在3小時內給以2ml/小雞的飲水)。
口服感染口服免疫後2-4周，用吸液管從口給小雞以106cfu(或107cfu)的具體中性標記的同源野生株。
檢測下列菌株的排洩-疫苗株S.tmSsq/sm60/Rif42，S.entSsq/Sm24/Rif12，S.infSsq/Sm153/Rif7和S.anaSsq/Sm81/Rif21含100μg利福黴素和200μg鏈黴素/ml的營養基；-帶或不帶rtt標記的疫苗株S.tmNal/2/Rif9含100μg利福黴素和12.5μg萘啶酮酸/ml的營養基；-中性Nal/Sm標記的野生株含100μg萘啶酮酸和200μg鏈黴素的營養基。
每組小雞每天的檢查，將5個新鮮糞樣各懸浮在2ml生理氯化鈉溶液中，再製備10-1到10-4的稀釋液。
-定量測定用刮勺將0.1ml原始懸液和稀釋液施加到含1%乳糖和蔗糖、0.015%的溴百裡酚藍的營養瓊脂上(測定大腸桿菌/腸桿菌的數目)。與此平行，將兩者都施加到含具體抗生素的相同培養基上。為了定量測定與對照相比在免疫小雞中的排洩和沙門氏菌菌落形成的減小，以千分數測定了沙門氏菌菌落數與腸桿菌菌落數之比，-定性測定將抗生素肉湯加到剩餘的原始懸液中。37℃孵育24小時後，將沙門氏菌轉移到含具體抗生素添加劑的營養瓊脂中。
對生長的沙門氏菌進行血清學和生化學驗證，並經測定標記來驗證。
作為與對照相比免疫小雞中排洩和沙門氏菌菌落形成減少的定量測定，以千分數測定了沙門氏菌菌落數與腸桿菌菌落數之比。
實施例1S.tm為確定相同血清型菌株和對小鼠僅有中等(S.ent)或缺乏(S.inf和S.ana)毒性的血清型的菌株的「減毒當量(延長)增代時間」，分離原型疫苗株，為此，分離了自發染色體抗生素抗性克隆作為具有約29-34分鐘的分級延長增代時間(野生株22分鐘)的(Nal-twd單一和)Nal/Rif-stwd雙標記株。
用刮勺將109(和1010)cfu的野生株轉移到含100μg(或分兩步先50μg再400μg)萘啶酮酸/ml的營養基上，並37℃孵育約2天。將抗性克隆轉移到營養瓊脂上，為檢驗所得抗性，測定或多或少減小了的消光值(Spekol，樣品管Zeiss-Jena，波長650nm，從細菌計數107cfu開始，37℃水溶振蕩培養3小時)。看似適當的克隆的增代時間用Abbott MS-26試驗系統測定。如上所述，在含400μg利福黴素/ml的營養瓊脂上，從增代時間為28分鐘的克隆Nal 2中得到了抗性克隆。測定了這些抗性克隆的增代時間，用分級增代時間為約29-34分鐘的Nal 2/Rif克隆確定了「減毒當量增代時間」的大致數值(見實施例3)。
實施例2在17-25天齡小雞中檢測中性Nal/Sm標記的S.tm、S.ent、S.inf和S.ana野生株的所得菌落形成活性。
17-25天齡小雞通過吸液管口服接受106(或107)cfu的中性標記的野生株。在10-15天期間，與腸桿菌數相比測定了定量的沙門氏菌菌落形成密度。
在選定的感染模型中(劑量為106-107cfu)，口服感染後，在24小時後產生高菌計數的中性標記野生株的排洩，或在第3天到第6天糞樣中沙門氏菌計數逐漸達到它們的最大值(最大值為總腸桿菌落的50‰)。8-10天後，沙門氏菌菌落降至腸桿菌菌落的1.0-0.1‰，並保持在此範圍內較長一段時間。
該菌落形成動力學說明Nal/Sm中性標記的野生株適於測定免疫小雞中減低的野生菌落形成。
實施例3為了測定相同血清型菌株和對小鼠僅有中等毒性或缺少毒性的血清型菌株的「減毒當量(延長)增代時間」，通過最大可能延長傳代時間/減毒水平及野生株排洩的最優減低的關係，確定了具有最適於小雞/雞的延長增代時間/減毒水平的S.tmNal2/Rif原型疫苗株。
將≤36小時齡的小雞用109cfu的分級增代時間為29-34分鐘的S.tm系列雙標記株中的不同菌株口服免疫，2周後用106cfu野生株口服感染。與此平行，口服感染同齡對照小雞。
與對照組相比，接受分級增代時間為29-34分鐘的疫苗株的免疫小雞，顯示野生株的排洩明顯減低(以腸桿菌菌落形成密度的千分數表示)，特別是在口服免疫後5-10天後，偏差(隨時間減小)在101-102範圍內。口服免疫後6-10天，免疫小雞中沙門氏菌菌落形成密度與對照接近直線(腸桿菌計數的0.1‰範圍內)。但在個別例子中，甚至在第10天後，免疫小雞可顯示減小的排洩在一個log級範圍內。
對於增代時間≥33分鐘的疫苗株，對野生株排洩的降低明顯少，其中與對照的區別一般不超過10倍。基於「最大可能延長增代時間/減毒水平並仍優化減低野生株排洩」這一關係，增代時間為約32分鐘的S.tm Nal 2/Rif 9(i.p.LD50小鼠為約106cfu)被確定為原型疫苗株，其(延長)增代時間約32分鐘被用作「減毒當量」的大致數值。
實施例4識別/檢測鼠傷寒沙門氏菌克隆S.tm Nal 2/Rif 9(i.p.LD50小鼠為約106(野生株為約101)cfu；增代時間從22分鐘延長到作為減毒當量的32分鐘)，對小雞/雞優化減毒，作為通過i.p和口服免疫產生對抗毒性感染的當量保護效果的優選疫苗株；(將這些規則相應地轉用在另外的「腸炎」沙門氏菌)a.通過測定小雞和小鼠的S.tm野生株和S.tm Nal 2/Rif 9疫苗株的i.p.LD50率，對小雞/雞和小鼠對鼠傷寒沙門氏菌的極端差異的敏感性的初步試驗。
對小鼠和兩天齡小雞，S.tm野生株和S.tm Nal 2/Rif 9疫苗株的不同i.p.LD50率，以及對17天齡小雞野生株的i.p.LD50率示於表1中。
表1S.tm野生株和S.tmNal2/Rif9疫苗株
小鼠和小雞的對比i.p.LD50率S.tm2天齡雞17天齡雞ICR小鼠(cfu)(cfu)(cfu)野生株 106108101Nal 2/Rif9 107n.t. 106表1的小雞和小鼠的LD50率說明小雞對S.tm的敏感性較小，必須由疫苗株的低減毒水平來補償。
b.識別對小雞/雞優化適應的鼠傷寒沙門氏菌疫苗株(有或無作為優化疫苗株的外膜突變的rtt標記)，通過i.p和口服免疫可產生抗毒性感染的當量保護作用。
抗LD75毒性感染的當量保護作用(兩周後進行)，可通過-在孵化後第2天用疫苗株S.tm Nal 2/Rif 9和S.tm Pur株(i.p.LD50小鼠107.5cfu)和對小雞過度減毒的Zoosaloral(i.p.LD50108.2cfu)單次i.p.免疫見表2；-在孵化後≤36小時或第4天用，用S.tmNal2/Rif9；S.tmNal2/Rif9/Rtt；以及對小雞過度減毒的小牛疫苗Zoosaloral單次口服免疫見表3；得到，作為「優化減毒」的標準。
表2
在第2天用106cfu的具有不同減毒水平的突變體單次i.p.免疫獲得抗毒性感染的免疫；在第16天用3×108cfu的野生株侵襲(三次試驗的平均值)。
i.p免疫:106cfu,i.p.侵襲S.tm疫苗株/試驗株死亡率(%)Nal2/Rif925Pur-81 25Zoosaloral30對照75表3用109cfu的疫苗株和對小雞過度減毒的Zoosaloral單次口服免疫，獲得抗毒性感染的免疫；在第16天用i.p3×108cfu的S.tm野生株侵襲(4次試驗的平均值)。
口服免疫,i.p侵襲第2天第4天S.tm疫苗株/試驗株cfu死亡率(%)10923 35Nal2/Rif910827 n.t.
10924 40Nal2/Rif9/Rtt10826 n.t.
10942 60Zoosaloral10847 65對照75如表2中所示，用所有疫苗株單次i.p免疫，使非生理的毒性感染死亡率從約75%降至≤30%。
如表3中所示，這種死亡率的降低-與Zoosaloral和增代時間≥33分鐘且i.p.LD50≥106.5cfu代謝漂移突變體相反-也可用疫苗株S.tm 2/Rif 9疫苗株(有或無rtt標記)單次口服免疫得到，因此，該疫苗株對小雞已優化減毒。
另外，表3表明-小牛疫苗Zoocaloral的過度減毒，-在第4天對抗毒性感染的保護性有效免疫較小。可假定，這是由於在第4天(齡)菌落形成抗性較高的原因，這應影響疫苗株的易位和通透性。
實施例5S.tm.、S.ent.、S.inf和S.ana分離通過「減毒當量(延長)增代時間」對雞優化減毒的、作為(單和)雙標記疫苗株的自發抗生素抗生克隆(也見實施例1)用刮勺將109-1010cfu的野生株轉移到含400μg鏈黴素/ml的營養瓊脂上，37℃孵育約2天。將抗性克隆轉移到營養瓊脂上，為檢驗所得抗性，在初步試驗中測定與野生株相比或多或少減低的消光值(Spekol，樣品管Zeiss-Jena，波長650nm，起始細菌計數107cfu，37℃水浴中振蕩培養3小時)(見實施例1)，似乎合適的克隆的增代時間通過Abbott MS-2試驗系統測定。如上所述，在第二步中，從增代時間延長了約3-6分鐘的克隆中得到了利福黴素抗性克隆(含400μg利福黴素/ml的營養瓊脂)，測定了其增代時間，增代時間為約28-32分鐘的Sm/Rif克隆優選作為雙標記疫苗株。(優選使用Sm-stwd減毒而不是Nal-stwd減毒，因為作為外膜突變的ssq標記(見實施例6)-如在Sm/Rif疫苗株中(避開作為解旋酶突變的Nal-stwd減毒)-也可以提供對當今最有效的抗生素cipro-floxacin的高敏性。)實施例6向野生和疫苗株中再摻入ssq(「安全和治療」)標記，優化疫苗株並提高其可接受性。
將新鮮培養物懸浮在PBS中，用100μg/ml的N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(MNG，21MET，Jena)處理達存活率10%。然後將其在含0.4μg氯黴素的營養肉湯中37℃孵育2小時，並按常規方法用1000IU青黴素/ml處理。在含0.4μg氯黴素(0.01μgciprofloxacin、1.0μg強力黴素)/ml的營養瓊脂上通過印痕(staming)法得到了不生長的克隆。作為ssq(對喹諾酮類有高敏性)株，這種克隆被確定及用作安全和治療標記物，它優化疫苗株並提高其可接受性，它們-在含0.4μg氯黴素、0.01μgciprofloxacin或1.0μg強力黴素(以及常用的30μg紅黴素)/ml的營養瓊脂上不生長，-顯示期望的回覆突變率≤10-7。
外膜突變的回覆突變率可在含20或30μg紅黴素/ml的營養瓊脂上較好地測定，因為當細菌計數高時，在高濃度ciprofloxacin、氯黴素和強力黴素下，休止(rest)生長轉向二級生長。
適合的疫苗株具有ssq標記，並且經誘變處理不發生或僅有微小的共突變引起的增代時間延長/減毒的克隆。
實施例7通過檢測代謝漂移(stwd)單標記突變體和小雞的雙標記疫苗株的所得或殘餘的侵襲能力，鑑別對小雞/雞優化減毒的鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、嬰兒沙門氏菌和鴨沙門氏菌疫苗株。
≤36小時齡的小雞分別用109cfu野生株、stwd單標記突變體和stwd雙標記突變體口服感染。5-8天後處死小雞，無菌條件下取出肝臟，勻漿，轉移到營養瓊脂上，剩餘物與營養肉湯混合。生長的菌落和培養物進行O類鑑別和標記測定。
對於鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌，5天後細菌計數/g肝為約103cfu，8天後為約102cfu。與此相反，對嬰兒沙門氏菌和鴨沙門氏菌細菌計數的定量測定在一較寬廣範圍內約101到≤102cfu，8天後常只能通過繁殖才能檢測到。嬰兒沙門氏菌和鴨沙門氏菌的這些低細菌計數/克肝，顯然與U.Methner的觀察相關(博士論文，Leipzig大學，獸醫系，1991)-嬰兒沙門氏菌對小雞的侵襲力小。
一般所得優選疫苗株(和單標記突變體)的侵襲能力-從培養後的菌落數測得-遠沒有達到同源野生株的數值，很明顯這對接種成功是很重要的(BarrowP.A.等，Res.Microbiol.，1990，141，pp851-853)。
實施例8≤36小時齡小雞口服免疫後和5天齡小雞口服免疫後，S.tmNal2/Rif9疫苗株(有或無rtt標記)的排洩百分比和持續時間的測定。
根據小雞年齡和口服免疫，有或無rtt標記的疫苗株的、試驗糞樣中的百分比和最大可檢測排洩持續時間示於

圖1中。
圖1用109cfu的無(·-)和有rtt標記(▲-)的S.tm Nal 2/Rif 9給≤36小時齡小雞單次口服免疫以及用S.tm Nal 2/Rif 9(個別數據沒有標出(一))在第4天口服免疫後，疫苗株的排洩率(繁殖後陽性樣品的百分數)和持續時間(最後的陽性結果，檢測限為約10個菌/克糞)。4到5次試驗的平均值。
圖1中顯示下列事實-孵育後≤36小時免疫，測得S.tmNal2/Rif9排洩32天。摻入rtt標記後，免疫三周後很少能檢測到疫苗株。
-在第4天免疫，18天後僅偶而檢測到S.tmNal2/Rif9(無rtt標記)，明顯由厭氧細菌引起的已存在的菌落形成抗性所致。
-陽性累積培養物的百分率與此類似。對於在≤36小時口服免疫，在約90%樣品中還可檢測到S.tmNal2/Rif9；對於已用rtt標記優化的疫苗株，僅約40%的糞樣仍為陽性。
測定了優選疫苗株S.tm Ssq/Sm 60/Rif 42、S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12g、S.inf Sqq/Sm 153/Rif 7和S.ana Ssq/Sm 81/Rif 21的菌落形成動力學，其中孵化後≤36小時口服施用109cfu，測定了兩周時間內的每種沙門氏疫苗株在糞樣的腸桿菌群中的比例，其中優選疫苗株(見上文)顯示與疫苗株S.tm Nal 2/Rif 9/Rtt可比的排洩行為。
實施例9在免疫小雞中與對照相比，同源Nal/Sm中性標記野生株定量排洩的降低。
≤36小時齡小雞接受疫苗株S.tm Nal 12/Rif 9/Rtt、S.tm Ssq/Sm 60/Rif 42、S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12、S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12k、S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12g、S.ent Ssq/Sm 24/Rif 3、S.inf Ssq/Sm 153/Rif 7和S.ana Ssq/Sm 81/Rif 21單價口服免疫，分別用106(部分為107)cfu的相應同源野生株在第17天感染，同齡小雞作平行對照。
與對照組相比，與用S.tm原型疫苗株Nal 2/Rif 9所得結果相符，免疫小雞顯示野生株排洩明顯減產，特別是在口服攻擊後頭5-10天內(從腸桿菌菌落形成密度測得，千分數)。偏差(隨時間減小)在達102範圍內。從口服攻擊後第6-10天，在免疫小雞中沙門氏菌菌落形成密度與對照組接近直線(在腸肝菌計數的0.1‰範圍內)。但在個別例子中，甚至第10天後免疫小雞顯示減低的排洩在一個log級範圍內。
幾乎不能期望完全消除個體感染動物中的沙門氏菌，因為雞沙門氏菌、雛沙門氏菌這些病原體在小雞中的表現行為象「正常菌群」。就中期而言，免疫小雞/雞的大大減低排洩與衛生措施結合應產生無沙門氏菌的雞原種。
實施例10對洗滌劑的敏感性增加疫苗株S.tmSsq/Sm60/Rif42、S.entSsq/Sm24/Rif12、S.entSsq/Sm24/Rif12k、S.entSsq/Sm24/Rif12g、S.entSsq/Sm24/Rif3、S.infSsq/Sm153/Rif7、S.anaSsq/Sm81/Rif21、S.tmNal2/Rif9/Rtt與野生株相比，對陰離子洗滌劑，特別對十二烷基硫酸鈉(SDS)的敏感性增加。這些疫苗株在濃度為0.5mgSDS/ml的適當營養瓊脂(大致不含蛋白質)上不生長，野生株在5mgSDS/ml的營養瓊脂上還生長。
將疫苗株懸浮在氯化鈉生理鹽水中，室溫下30分鐘內溶菌達約90%，而野生株的溶菌率僅為約10%。
從這些觀察可以得出這樣的結論，敏感性高的疫苗株，在環境中的生存能力減低，特別是在採取了衛生清潔措施後。
實施例11從野生株中分離疫苗株按如下方法將以下菌株與野生株分離-通過它們對100μg利福黴素和200μg鏈黴素/ml的營養瓊脂的抗性以及在含0.4μg氯黴素(或分別含0.01μgciprofloxacin、1.0μg強力黴素和30μg紅黴素)/ml的營養瓊脂上不生長，得到了下列疫苗株-S.tmSsq/Sm60/Rif42，S.entSsq/Sm24/Rif12，S.entSsq/Sm24/Rif12k，S.entSsq/Sm24/Rif12g，S.entSsq/Sm24/Rif3，S.infSsq/Sm153/Rif7和S.anaSsq/Sm81/Rif21-利用其對100μg利福黴素和12.5μg萘啶酮酸*/ml的營養瓊脂的抗性以及在含30μg紅黴素/ml的營養瓊脂上不生長，得到了S.tm Nal 2/Rif 9/Rtt。
*與原始Nal2/Rif9株相比，rtt株對萘啶酮酸的抗性減低是rtt突變(摻入Nal2/Rif9中)的結果，它導致外膜通透性變化。
實施例12疫苗株的大量培養、製備和應用為了生產活疫苗，(無ssq標記的雙標記疫苗株或)帶ssq標記的三標記疫苗株在適當的完全培養基中孵育(液體培養)，直到對數期結束。將細菌懸液與傳統的穩定劑混合併冷凍乾燥。
按此方法得到的疫苗株通常施用於≤36小時齡的小雞，單次劑量為108-109cfu。成年雞通常接受109cfu口服單次免疫/加強免疫，或在產蛋期前經非胃腸道接受約108cfu。
權利要求
1.包含大環內酯抗生素敏感性標記(外膜標記)的至少一種減毒免疫原性沙門氏菌活疫苗株的用途，它用於製備對特異宿主的活疫苗，在由該特異宿主引起的另一宿主感染的情況下，該活疫苗有助於用大環內酯類抗生素對被感染動物進行有效的治療。
2.從至少一種減毒的免疫原性活疫苗株製得的沙門氏菌活疫苗，其特徵在於該疫苗株具有一種外膜標記，該標記除任選對大環內酯類抗生素具有敏感性外，導致疫苗株對除大環內酯類抗生素外的特異的治療有效抗生素的敏感性提高。
3.根據權利要求1或2的活疫苗，其特徵在於該疫苗株包括用於減毒的至少一種染色體抗生素抗生突變，但不排斥對治療有效的抗生素的敏感性提高。
4.根據權利要求2或3的活疫苗，其特徵在於所述外膜標記使疫苗株對喹諾酮類、氯黴素類或四環素類抗生素的敏感性提高。
5.根據權利要求4的活疫苗，其特徵在於所述外膜標記使疫苗株對抗生素ciprofloxacin的敏感性提高。
6.根據權利要求1-5的活疫苗，其特徵在於疫苗株含有用於減毒的代謝漂移突變，包括鏈黴素抗性和/或利福黴素抗性。
7.根據權利要求1-6的活疫苗，其特徵在於它包括至少一種血清型O-類B(如鼠傷寒沙門氏菌)、D(如腸炎沙門氏菌)、C(如嬰兒沙門氏菌)和E(如鴨沙門氏菌)的疫苗株作為單、雙、三或四疫苗。
8.根據權利要求6的活疫苗，其特徵在於-單疫苗由疫苗株S.tmSsq/Sm60/Rif42(No.4242；保藏號DSM8433)或S.tmNal2/Rif9/Rtt(No.4223；保藏號DSM8432)或S.entSsq/Sm24/Rif12(No.4266；保藏號DSM8435)或S.entSsq/Sm24/Rif12k(No.4298；保藏號DSM9362)或S.entSsq/Sm24/Rif12g(No.4297；保藏號DSM9361)或S.entSsq/Sm24/Rif3(No.4296；保藏號DSM9360)組成，-雙疫苗由上述一種S.tm疫苗株和S.entSsq/Sm24/Rif12或S.entSsq/Sm24/Rif12k或S.entSsq/Sm24/Rif12g或S.entSsq/Sm24/Rif3組成，-三或四疫苗由上述S.tm疫苗株之一，S.entSsq/Sm24/Rif12或S.entSsq/Sm24/Rif12k或S.entSsq/Sm24/Rif12g或S.entSsq/Sm24/Rif3，S.entSsq/Sm153/Rif(No.4298；保藏號DSM8434)和/或S.anaSsq/Sm81/Rif21(No.4279；保藏號DSM8441)組成。
9.用於口服免疫小雞以及口服或經非胃腸道免疫/加強免疫雞以抗沙門氏菌感染的活疫苗，該活疫苗是從至少一種減毒的免疫原性疫苗株製得的，特別是根據權利要求1-8之一的活疫苗，其特徵在於選擇增代時間為約28-34分鐘的疫苗株用於製備活疫苗。
10.沙門氏菌活疫苗的生產方法，該活疫苗的減毒水平被優化適合於宿主，並且從至少一種減毒的免疫原性沙門氏菌活疫苗株製得，其特徵在於具有適於宿主的延長的增代時間的疫苗株用作減毒當量，其中適合於宿主(血清型)的疫苗株的具體延長的增代時間是在一次實驗中確定的。
11.根據權利要求10的方法，其特徵在於在初步試驗中適於宿主的延長的增代時間是如此測定的從一系列分級延長增代時間開始，根據最大可能減毒水平/延長的增代時間和野生株排洩的優化減低之間的關係選擇適當的疫苗株，任選地將其延長的增代時間作為減毒當量轉用到同屬其它血清型。
12.根據權利要求10或11的優化適於小雞或雞的疫苗的製備方法，其特徵在於選擇疫苗株，其傳代時間與野生株相比從約22分鐘延長到了約28-34分鐘。
13.根據權利要求12的方法，其特徵在於所用疫苗株得自野生株，首先提供給野生株鏈黴素(Sm)或萘啶酮酸標記，使增代時間從22分鐘延長到25-29分鐘，然後再提供利福黴素(Rif)標記，進一步延長增代時間，分離作為增代時間為28-34分鐘的適當疫苗株的克隆，再以已知方式製備疫苗如從形成的疫苗株中選擇疫苗株來製備。
14.根據權利要求10-13的方法，其特徵在於如鼠傷寒沙門氏菌(S.tm)、腸炎沙門氏菌(S.ent)、嬰兒沙門氏菌(S.inf)和鴨沙門氏菌(S.ana)用作沙門氏菌血清型。
15.根據權利要求14的方法，其特徵在於Sm-Rif代謝漂變與-增代時間為約31分鐘的S.tm疫苗株(i，p，LD50小鼠為約105(野生株約101)cfu)，-增代時間為約28分鐘的S.ent疫苗株(i，p，LD50小鼠為約107(野生株約105)cfu)，-增代時間為約31分鐘的S.inf疫苗株，-增代時間為約32分鐘的S.ana疫苗株，結合，用作小雞/雞優化減毒疫苗。
16.根據權利要求13-15的方法，其特徵在於向Sm/Rif疫苗中摻入外膜標記，其對ciprofloxacin(氯黴素、強力黴素等)的敏感性增至4倍，同時排洩和在環境中的生存能力明顯減小。
17.根據權利要求15或16的方法，其特徵在於增加對ciprofloxacin的敏感性的標記通過誘變方法，或摻入野生株中或摻入Sm/Rif雙標記疫苗株中，然後在0.5μg氯黴素/ml存在下進行常規青黴素篩選。
18.根據權利要求13-17的方法，其特徵在於標記摻入的順序是隨意的。
19.根據權利要求10-18的方法，其特徵在於無外膜標記的疫苗株用作疫苗。
20.增代時間為28-32分鐘的沙門氏菌疫苗株。
21.根據權利要求20的沙門氏菌疫苗株，其為保藏號為8432、8433、8434、8435、9360、9361、9362和/或8441的疫苗株，以及增代時間為28-34分鐘的它們的較高或較低減毒變異體。
22.根據權利要求20或21的疫苗株作為權利要求1或2的活疫苗用於口服免疫小雞以及口服和經非胃腸免疫/加強免疫雞抗沙門氏菌感染的用途。
全文摘要
包含大環內酯抗生素敏感性標記(外膜標記)的至少一種減毒免疫原性沙門氏菌活疫苗株的用途，它用於製備對特異宿主的活疫苗，在由該特異宿主引起的另一宿主感染的情況下，該活疫苗有助於用大環內酯類抗生素對被感染動物進行有效的治療。
文檔編號A61K39/02GK1114100SQ94190658
公開日1995年12月27日 申請日期1994年8月29日 優先權日1993年9月4日
發明者K·林德, J·伯爾, B·蘭德哈根 申請人:Tad製藥產品有限公司