豌豆的pcr鑑定用引物及pcr鑑定方法
2023-06-09 08:13:36
專利名稱：豌豆的pcr鑑定用引物及pcr鑑定方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測鑑定技術，具體地說涉及對豌豆生物資源進行PCR鑑定用引 物及使用該引物的PCR鑑定方法。
背景技術：
豌豆屬豆科植物，我國已有兩千多年的栽培歷史，現在各地均有栽培，主要產區有 四川、河南、湖北、江蘇、青海等十多個省區。豌豆的營養價值比較豐富，在豌豆莢和豆苗的 嫩葉中富含維生素C和能分解體內亞硝胺的酶，可以分解亞硝胺，具有抗癌防癌的作用。此 外，與一般蔬菜有所不同，豌豆所含的止杈酸、赤黴素和植物凝素等物質，具有抗菌消炎，增 強新陳代謝的功能。我國是一個豌豆屬植物種質資源十分豐富的國家，有許多優良品種，這 些品種已成為我國許多地區生產上大量栽培的品種，大大地促進了我國豌豆相關產業的發 展。為防止我國豌豆種質資源的流失，對我國的社會生產力造成難以估量的損失，應該加大 對我國豌豆資源的保護與研究工作。 以前，豆類品種的辨別和鑑定都是根據栽培過程中的品種特徵的區別來進行的。 即，通過對豆類進行長期的栽培，追蹤觀察其成長過程中的特徵，從而進行鑑定。這種品種 鑑定方法至少需要一年。尤其，對於近似品種的豆類，因其在形狀和顏色等特徵上無明顯差 異，不易通過目視鑑別。另外，隨著現代生物技術的出現，使基因資源更多的是以非活體的 遺傳物質形式攜帶出境，使得口岸查驗更加困難，因而研究及建立有效的遺傳資源出境檢 驗鑑定方法以及相關的能力建設就顯得極為必要。 另一方面，利用PCR(聚合酶鏈反應)的基因擴增法已被廣泛利用於各個領域。PCR 法是以極微量的DNA為模板，短時間內將目的DNA區域擴增至數十萬倍的方法，因其精度高 而廣泛被利用於醫學和微生物領域。在農產品領域中，已有利用RAPD(隨機擴增多態DNA) 法對稻類品種進行鑑別的方法。而作為我國重要植物種質資源的豌豆，目前國內外對其檢 測識別僅限於形態上，未見有關其分子鑑定方法的研究。 上述用於鑑別稻類品種的RAPD法是以基因組DNA為模板，以單個人工合成的較短 的隨機多態核苷酸序列(通常為IO個鹼基對)為引物，在熱穩定的DNA聚合酶(Taq酶)作 用下，進行PCR擴增。擴增產物經瓊脂糖或聚丙烯醯胺電泳分離、溴化乙錠染色後，在紫外 透視儀上檢測多態性。擴增產物的多態性反映了基因組的多態性。由於該方法是從隨機的 引物中選擇RAPD標記，因此，即使沒有所要鑑定品種的基因組信息也能進行鑑定。但是，該 方法有如下缺點由於使用了各自為IO個鹼基對程度的較短的引物，所以退火溫度較低， 容易因退火誤操作而引起非特異擴增。並且，使用RAPD標記的PCR中包括鑑定所需的特異 擴增片段和多餘的擴增片段，產生多個PCR產物，因此重複性較差，鑑定需要熟練的技術。
綜上所述，為了保護豌豆種質資源，需要建立一種能夠對難以從形態上進行判斷 的豌豆進行辨別，且適合口岸檢查應用的，簡單且精確的生物鑑定方法，以此防止豌豆不會 以非活體遺傳物質形式等非傳統形態被攜帶出境。
發明內容
本發明所要解決的課題為，提供一種豌豆的PCR鑑定用引物及PCR鑑定方法，對難以從形態上進行判斷的豌豆進行簡單且精確的鑑定。 本發明所要解決的課題為，提供一種豌豆的PCR鑑定用引物及PCR鑑定方法，能夠從原料含有豌豆的加工品以及種質資源中檢測/鑑定豌豆。 本發明為了解決上述課題，應用PCR方法對豌豆的分子檢測方法進行研究，通過trnL序列設計特異引物，從而建立了對豌豆穩定、高效的鑑定方法、成本低，可根據對擴增產物的普通瓊脂糖電泳判定是否有豌豆核酸存在。 DNA測序技術是目前物種鑑別研究中運用最廣的技術之一。而植物譜系地理學研究中主要集中研究葉綠體DNA(chloroplast DNA， cpDNA)片段該基因組具有分子量小、單親遺傳、多拷貝、結構簡單及鹼基序列重組少等特點，有利於進行遺傳分析。此外，植物葉綠體基因的某些區域，特別是一些非編碼區域存在相對較高的核苷酸置換率，不僅適合於確定物種之間的親緣關係，同樣也適合於物種鑑別研究。 植物葉綠體基因組、編碼tRNA的trnL基因的內含子非編碼區序列受外界選擇壓力小、進化速率快、能提供較多的具有系統學意義的信息位點，多用於較低分類階元及近期分化類群間系統發育和種間、品種的鑑別研究。為此，本發明人對豌豆及其近緣種屬植物的trnL序列(豌豆的trnL序列參照SEQ ID No. 3)進行了測定和比較，以期為豌豆的鑑別提供有效的分子標記系統。 本發明提供一種豌豆PCR鑑定用引物，其核苷酸序列為 正向5' -ATTCAAAATGGGCAATCCTG-3， 反向5' -TTGATTCTAATGTTTCCATTGTGAT-3'。 本發明通過分析豌豆與其近緣種植物葉綠體trnL基因序列的基礎上，設計特異引物，能夠快速、準確地對豌豆進行定性檢測。本發明的引物可以通過利用本領域技術人員公知的化學合成方法來進行的DNA合成技術來獲得。本發明人在對相關植物的trnL序列進行測定和比較的基礎上，根據豌豆trnL序列上的特異鹼基位點設計了引物，因此僅對豌豆有擴增信號，而其他對照材料沒有目的擴增信號。 另外，本發明提供一種豌豆PCR鑑定方法，該方法以樣品總DNA為模板，利用上述的引物進行PCR擴增，反應結束後根據瓊脂糖凝膠電泳判定結果。 PCR 25iiL反應體系樣品DNA 1 ii L(10-50ng) ， 10XPCR buffer (Mg2+free) 2. 5 ii L， 25mM MgCL2 2 ii L， 10mM d證s 2 ii L， 10 ii MPrimers 2 ii L， 5U/ ii L Taq DNApolymerase 0. 1 li L， ddH20 15. 4 li L。本發明提供的豌豆PCR鑑定方法，其中PCR的反應過程為預變性95t:、3min，再經95。C變性30sec，60。C退火30sec，72。C延伸30sec，35循環，最後72。C延伸5min。
本發明還提供一種豌豆PCR鑑定試劑盒，包括，上述引物。 可以將本發明引物以及相關試劑組裝成試劑盒，以方便使用。本發明的試劑盒可以是由多個隔斷所形成，以容納固定一個或多個如管或小瓶的容器。這些容器之一或者多個可以裝有本發明的引物，根據需要該引物可以是凍幹形式或溶於緩衝液中的狀態。另外，本發明的試劑盒中還可以包括用於PCR反應的一種或多種酶/試劑，以及實施本發明所需要的其它成分及用具。
使用本發明的引物以及方法進行鑑定的樣品來源包括，種子、小葉、豌豆加工品以及豌豆種質資源，但並不局限於此。 通過使用本發明的引物，對所測豌豆的DNA進行擴增，生成豌豆特異擴增片段，從而能夠簡單且精確地對豌豆進行鑑定。並且，本發明的引物僅對目的片段特異擴增，不會擴增其它區域，因此也能使用於一次PCR中導入兩種以上引物的多重PCR中，從而能有效地縮短試驗時間。並且，本研究建立了適合口岸應用的簡便的檢測方法，即直接從進、出境的禾本科類材料上檢測豌豆，操作快捷、結果準確，避免了用傳統的形態分類學和細胞學方法所產生的耗費時間和易疏漏的缺陷，順應了當今口岸檢測工作的特點。
圖1是PCR對豌豆特異性檢測實驗； 其中1 :小扁豆、2 :蠶豆、3 :菜豆、4 :豌豆、5 :自貢冬豆、6 :吉林小粒、7 :晉豆21、8 :冀豆12、9 :野生大豆236、10 :肯農18、11 :日本晴、12 :玉米、13 :中國春、CK :水對照。
具體實施例方式
下面實施例用於對本發明的進一步說明，但不用來限制本發明的範圍。
實施例1引物的設計 根據豌豆trnL序列，利用軟體和Primer 3設計引物，引物序列為
正向5' -ATTCAAAATGGGCAATCCTG-3，
反向5' -TTGATTCTAATGTTTCCATTGTGAT-3，。
實施例2總DNA的提取 (1)取0. 2 0. 3g植物組織，用矽膠保存，剪碎後置研缽中加液氮研成粉末狀，移至已滅菌的1. 5mL離心管，一般加到離心管的1/3體積。 (2)在離心管中加入已在65。C預熱500 y L CTAB提取液(20g/LCTAB， 1. 4M NaCl，
0. 1M Tris-HCl，20mM EDTA， pH 8. 0)混勻，置於65。C水浴鍋保溫30分鐘。 (3)將樣品從水浴鍋中取出，加入與提取液等體積的氯仿/異戊醇(24 : l)，上下
顛倒離心管充分混勻，12000轉/分鐘離心15分鐘。 (4)吸取上清液置於另一已滅菌的1. 5mL離心管。 (5)再加入等體積的氯仿/異戊醇(24 : l)，重複步驟(3)， (4)。 (6)加入等體積或兩倍體積的無水乙醇(已在_201:預冷)，輕輕顛倒離心管混勻，
置於_201:冰箱，放置30分鐘。 (7) 10000轉/分鐘離心10分鐘，倒去上清液，保留沉澱.此時的沉澱物主要為DNA。 (8)加入400 ii L 70%乙醇，10000轉/分鐘離心5分鐘，收集沉澱。置於37。C或5(TC烘箱烘乾。 (9)加入100 ii L TE (或者滅菌水)溶解DNA，再加2 y L RNA酶(10mg/ml) ， 37。C保溫30分鐘。 (10) 1. 0%瓊脂糖電泳檢測DNA濃度及質量。
實施例3 PCR擴增方法的建立
1、PCR反應體系 以總DNA為模板，進行PCR反應，25 ii L反應體系中有樣品樣品DNA1 ii L(10-50ng) ， 10XPCR buffer (Mg2+ free) 2. 5 ii L， 25mMMgCL2 2 ii L， 10mM dNTPs 2 ii L，10 ii M Primers 2 ii L， 5U/ ii L Taq DNApolymerase 0. 1 ii L， ddH20 15. 4 ii L。
2、PCR反應條件將樣品管放入ABI PCR儀後，設置如下條件進行反應預變性95t: 3min，再經95。C
變性30sec，60。C退火30sec，72。C延伸30sec， 35循環，最後72。C延伸5min。反應結束後擴
增產物經過瓊脂糖凝膠電泳判定結果。 實施例4豌豆PCR方法的特異性確定 以豌豆與其近緣種等13個豆科植物總DNA為模板，以水為陰性對照，通過PCR反應結束後瓊脂糖凝膠電泳206bp的特異性擴增條帶判定陽性結果。
試驗結果 只有豌豆的PCR擴增產物出現陽性擴增，而其它近緣材料和陰性對照均沒有擴增
信號，結果見圖1。
序列表〈110〉中國檢驗檢疫科學研究院〈120〉豌豆的PCR鑑定用引物及PCR鑑定方法
0053]〈130〉〈160>3〈170>PatentIn version 3. 3〈210>1〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>1attc朋朋tg ggc朋tcctg〈210>2〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2ttgattctea tgtttccatt gtgat〈210>3〈211>409〈212>DNA〈213>豌豆(Zea mays)〈400>3acttecc朋g tg朋朋cttt C3朋ttcag3 ga朋ccctgg朋ttc朋朋t gggc朋tcctgagcc朋3tc cttctttctg朋朋ca朋te 3朋gttc3ga朋gtg朋朋t c朋朋朋gga
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aacaaatgga gttgacaaca ttcaattgat 180
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gatteatc皿3cgag皿tea agategagtc 360
a皿ttttteg teagagg皿 409
權利要求
一種豌豆PCR鑑定用引物，其能對豌豆的葉綠體trnL基因進行擴增，生成豌豆特異性擴增片段。
2. 如權利要求1所述的豌豆PCR鑑定用引物，其核苷酸序列為 正向5' -ATTCAAAATGGGCAATCCTG-3'反向5， -TTGATTCTAATGTTTCCATTGTGAT-3，。
3. —種豌豆PCR鑑定方法，該方法以樣品總DNA為模板，利用權利要求1或2所述的引 物進行PCR擴增，反應結束後根據瓊脂糖凝膠電泳判定結果。
4. 如權利要求3所述的方法，其特徵在於，PCR的反應程序為預變性95t:、3min，再經 95。C變性30sec，60。C退火30sec，72。C延伸30sec，35循環，最後72。C延伸5min。
5. 如權利要求3或4所述的方法，其特徵在於，樣品總DNA來自豌豆的種子、小葉、豌豆 加工品以及豌豆種質資源。
6. —種豌豆PCR鑑定用試劑盒，包括，權利要求1或2所述引物。
全文摘要
本發明提供了一種豌豆PCR鑑定用引物及PCR鑑定方法，所述引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1&2所示。本發明的豌豆PCR鑑定方法，是以樣品總DNA為模板，利用上述引物進行PCR擴增，反應結束後根據瓊脂糖電泳判定結果。本發明引物特異性好，檢測方法快速簡單，準確性高，靈敏度好，為豌豆物種資源的鑑定提供了檢測方法。
文檔編號C12N15/11GK101701254SQ20091023801
公開日2010年5月5日 申請日期2009年11月13日 優先權日2009年11月13日
發明者徐濤, 許瑾 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院