高產聚-β-羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm-10菌株及其篩選方法和應用的製作方法

2023-06-09 03:54:21

專利名稱：高產聚-β-羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm-10菌株及其篩選方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術醫學及生活領域，尤其涉及一種高產聚-β-羥丁酸(PHB)的 巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)Bm-10菌株及其用途。
背景技術：
聚-β-羥丁酸(PHB)是細胞內的一類生物聚酯，其力學性質與一些熱塑性材料如 聚丙烯相似，並且可以被微生物完全降解，因而被稱之為「生物可降解塑料」，是真正的環境 友好型產品。研究生物可降解塑料來替代化學合成塑料可以幫助我們解決塑料汙染問題， 節約能源，實現資源與環境的可持續發展。PHB是微生物在碳、氮等營養失衡的條件下合成 的碳源與能源的高分子儲存物(分子量50000 1000000)。作為微生物合成的可降解材 料，PHB除了具有與化學合成高分子相似的理化性質，還具有一般化學合成高分子所沒有 的性質如光學活性、低透氧性、抗紫外輻射、生物可降解性、生物相容性、壓電性和抗凝血性 等，在工業、農業、環保、食品、醫藥等領域具有十分廣闊的應用前景。如在醫療領域，PHB可 以作為藥物基質植入人體，以控制藥物的釋放，且最終降解產物為β -羥基丁酸，沒有任何 毒副作用。自發現生物體內可以積累PHB以來，國內外許多研究者致力於PHB的研究。英國、 日本、加拿大、美國等已實現了 PHB的工業化生產。國內PHB的研究起步較晚，但也取得了 一定的成果。中科院微生物所、山東大學、清華大學等在PHB的研究方面已經取得了一些研 究成果和進展。但總的來說相對於化學合成塑料，PHB的生產成本仍然較高，約為傳統塑料 生產成本的數倍至十幾倍。

發明內容
本發明針對市場上對可降解塑料需求的日益增長，而現有技術中利用微生物法生 產可降解塑料菌種產量低、成本高等問題。本發明的一個目的是提供高產聚羥丁酸的 巨大芽孢桿菌Bm-IO菌株，該菌株從汙泥中篩選獲得，可用於PHB的微生物製備。本發明另 外的一個目的是提供上述的巨大芽孢桿菌Bm-IO菌株的用途。為了實現上述的第一個目的，本發明採用了以下的技術方案高產聚-β -羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm-IO菌株，高產聚-β -羥丁酸的巨大芽 孢桿菌Bm-IO菌株的保藏號為CCTCC NO :M209131，保藏單位為中國典型培養物保藏中 心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏日期為2009年6月25日，分類命名為巨大芽 孢桿菌Bm-IO Bacillus megaterium Bm-10。該菌株菌落乳白色不透明，圓形，較大、直徑 約3 6mm，表面光滑，邊緣整齊，無特殊氣味。顯微鏡觀察細胞呈杆狀或近橢圓形杆狀， 粗大，長度約3 5 μ m，寬度約1. 2 1. 5 μ m ；趨於扭曲的短鏈；周生鞭毛，具運動性；革 蘭氏染色陽性。16S rDNA電泳和測序分析結果表明，其長度為1513bp，與巨大芽孢桿菌 (B. megaterium)菌株的同源性達99. 7 %。鑑定該菌株為巨大芽孢桿菌(B. megaterium)。對該菌體內的PHB通過蘇丹黑染色進行初步定性定量測定，細胞內含量較多。上述的高產聚- β -羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm-IO菌株的篩選方法如下取0. 2g 土壤，加入5mL蒸餾水，85°C加熱15min，進行10—1 10_4梯度稀釋，選擇10_2濃度IOOyL 塗布牛肉膏蛋白腖培養基平板，30°C培養24h，出現圓形乳白色菌落；挑取單菌落，進一步 分離、純化後，獲得菌株。作為優選，所述的牛肉膏蛋白腖培養基的配方包括牛肉膏20g、蛋白腖5g、氯化鈉 5g、水 1L，pH 7. 2。為實現上述的第二個目的，本發明的高產聚_ β _羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm-IO菌 株用於聚-β-羥丁酸的製備。高產聚-β -羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm-IO菌株用於聚-β -羥丁酸的製備方法， 該方法包括以下的步驟①挑取適量菌種接入牛肉膏蛋白腖培養液中，30°C活化培養20 30h ；裝入牛肉 膏蛋白腖培養液，取培養的種子培養液，按4 10%的接種量接種後，30°C，200r/min,搖瓶 培養80 120h，可得PHB含量佔菌體乾重的45% 55%的巨大芽孢桿菌菌體；②將搖瓶所得培養液lOOOOr/min離心5min，收集菌體，無菌水洗滌3次後再用丙 酮洗滌一次，之後加氯仿與酒精的混合液提取PHB，然後40°C乾燥後可得到白色沉澱即為 PHB。本發明由於採用了上述的技術方案，從汙泥中篩選獲得高產聚羥丁酸的巨 大芽孢桿菌Bm-IO菌株，該菌株可用於PHB的微生物製備，解決了現有技術中利用微生物法 生產可降解塑料菌種產量低、成本高等問題。


圖1為本發明巨大芽孢桿菌(B.megateriunOBm-lO菌株形態特徵圖。其中A為 菌落正面，B為菌落背面，C為菌體革蘭氏染色，D為菌體蘇丹黑染色。圖2為本發明巨大芽孢桿菌佤11^83{61^11111)8111-10菌株的163 rDNA電泳分析圖。圖3為巨大芽孢桿菌(B. megaterium) Bm-IO菌株生長和PHB產量圖。圖4為巨大芽孢桿菌(B. megaterium) Bm-IO菌體中提取的PHB粉末照片。
具體實施例方式實施例1從汙泥中分離高產PHB的巨大芽孢桿菌Bm-IO菌株(一)培養基牛肉膏蛋白腖培養基牛肉膏(20g)、蛋白腖(5g)、氯化鈉(5g)、水(1L)、pH 7.2。(二)方法採用梯度稀釋分離法。取0. 2g 土壤，加入5mL蒸餾水，85°C加熱15min，進行梯度 稀釋(KT1 10_4)，選擇合適的濃度(10_2)100yL塗布牛肉膏蛋白腖培養基平板，30°C培養 24h，出現圓形乳白色菌落。挑取單菌落，進一步分離、純化後，對所獲的菌株用蘇丹黑染色 法對PHB的進行定性測定(圖ID所述)。選取含有PHB的菌株編號，置4°C冰箱中保存，備 用。用牛肉膏蛋白腖試管斜面進行菌種活化傳代，菌株每4周轉接一次；菌種使用之前需先 活化。對選出的菌株進行形態、生理生化和16S rDNA序列鑑定。
Bm-IO菌株菌落乳白色不透明，圓形，較大、直徑約3 6mm，表面光滑，邊緣整齊， 無特殊氣味(如圖1A，B)。顯微鏡觀察細胞呈杆狀或近橢圓形杆狀，粗大，長度約3 5 μ m， 寬度約1. 2 1. 5μπι ；趨於扭曲的短鏈；周生鞭毛，具運動性；革蘭氏染色陽性(如圖1C)。 16S rDNA電泳和測序分析結果表明，其長度為1513bp，與巨大芽孢桿菌(B. megaterium)菌 株的同源性達99.7% (如圖2所示)。該菌株在牛肉膏蛋白腖培養基上，30°C IOd條件下， 經15代連續培養，其培養特徵、形態特徵和PHB產量均無明顯變化，表明該菌株的生物性狀 基本穩定。實施例2巨大芽孢桿菌(B. megaterium) Bm-IO菌株用於PHB製備的方法( 一 )菌株巨大芽孢桿菌(B. megaterium) Bm-IO菌株，菌株的保藏號為CCTCC NO :M209131。(二)方法從活化的牛肉膏蛋白腖試管斜面培養基上挑取適量菌種接入牛肉膏蛋白腖培養 液中，30°C活化培養24h ；250mL三角瓶中裝入50mL牛肉膏蛋白腖培養液，取培養24h的種 子培養液，按8%的接種量接種後，30°C，200r/min,搖瓶培養96h，可得PHB含量佔菌體乾重 的45% 55%的巨大芽孢桿菌菌體(如圖3所示)。PHB提取和定量分析將搖瓶所得培養液lOOOOr/min離心5min，收集菌體。無菌 水洗滌3次後再用丙酮洗滌一次，之後加氯仿與酒精的混合液(氯仿酒精=2 1)提取 PHB，然後40°C乾燥後可得到白色沉澱即為PHB(如圖4所示)，PHB在濃硫酸作用下解聚成 巴豆酸，在235nm處用紫外分光光度計測定其含量；精確定量採用氣相色譜法。
權利要求
高產聚 β 羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm 10菌株，其特徵在於高產聚 β 羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm 10菌株的保藏號為CCTCC NOM209131。
2.根據權利要求1所述的高產聚_羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm-IO菌株其特徵在 於該菌株菌落乳白色不透明，圓形，較大、直徑約3 6mm，表面光滑，邊緣整齊，無特殊氣 味；顯微鏡觀察細胞呈杆狀或近橢圓形杆狀，粗大，長度約3 5 μ m，寬度約1. 2 1. 5 μ m ； 趨於扭曲的短鏈；周生鞭毛，具運動性；革 >蘭氏染色陽性；16S rDNA電泳和測序分析結果表 明，其長度為1513bp。
3.根據權利要求1所述的高產聚羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm-IO菌株的篩選方法， 其特徵在於該方法如下取0. 2g 土壤，加入5mL蒸餾水，85°C加熱15min，進行ICT1 10_4 梯度稀釋，選擇10_2濃度100 μ L塗布牛肉膏蛋白腖培養基平板，30°C培養24h，出現圓形乳 白色菌落；挑取單菌落，進一步分離、純化後，獲得菌株。
4.根據權利要求3所述的高產聚-β-羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm-IO菌株的篩選方法， 其特徵在於牛肉膏蛋白腖培養基的配方包括牛肉膏20g、蛋白腖5g、氯化鈉5g、水1L，pH 7. 2。
5.根據權利要求1所述的高產聚羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm-IO菌株用於 聚-β-羥丁酸的製備。
6.根據權利要求1所述的高產聚羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm-IO菌株用於 聚- β -羥丁酸的製備方法，其特徵在於該方法包括以下的步驟①挑取適量菌種接入牛肉膏蛋白腖培養液中，30°C活化培養20 30h；裝入牛肉膏蛋 白腖培養液，取培養的種子培養液，按4 10%的接種量接種後，30°C，200r/min,搖瓶培養 80 120h，可得PHB含量佔菌體乾重的45% 55%的巨大芽孢桿菌菌體；②將搖瓶所得培養液lOOOOr/min離心5min，收集菌體，無菌水洗滌3次後再用丙酮洗 滌一次，之後加氯仿與酒精的混合液提取PHB，然後40°C乾燥後可得到白色沉澱即為PHB。
全文摘要
本發明屬於生物技術醫學及生活領域，尤其涉及一種高產聚-β-羥丁酸(PHB)的巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)Bm-10菌株及其用途。高產聚-β-羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm-10菌株，高產聚-β-羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm-10菌株的保藏號為CCTCC NoM209131。本發明從汙泥中篩選獲得高產聚-β-羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm-10菌株，該菌株可用於PHB的微生物製備，解決了現有技術中利用微生物法生產可降解塑料菌種產量低、成本高等問題。
文檔編號C12N1/20GK101921714SQ20091010227
公開日2010年12月22日 申請日期2009年9月10日 優先權日2009年9月10日
發明者周琴, 蔣冬花 申請人:浙江師範大學