水稻蛋白OsSRA2及其編碼基因與應用的製作方法

2023-06-09 03:40:26 1

專利名稱：水稻蛋白OsSRA2及其編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及功能基因組學領域，尤其涉及一種水稻蛋白0sSRA2及其編碼基因與 應用。
背景技術：
土壤鹽漬化對農業的威脅是一個全球性的問題。全世界共有10億公頃的鹽鹼地， 約佔世界陸地面積7. 6%，我國鹽鹼地近1億多公頃，農業耕地因鹽漬化引起的減產、棄耕 地就近333. 5萬公頃。近年來，我國設施農業的快速發展，特別是蔬菜和花卉大棚生產面積 不斷擴大，據統計，2005年全國蔬菜、花卉、瓜果等作物設施栽培面積達210萬公頃。設施農 業的發展為農業生產結構調整和提高農業生產效益發揮了重要作用，但是隨著設施栽培時 間延長，土壤次生鹽漬化的問題日益加劇，嚴重影響了設施栽培作物的產量和品質，效益也 隨之下降，從而影響設施農業的健康發展。解決設施栽培土壤鹽漬化一般採取以下兩種措 施，一是用石膏和硫磺等化學方法或用排水和灌溉洗鹽等物理方法改良土壤；二是通過常 規育種或生物技術手段培育耐鹽作物品種，而前者投入成本高。通過培育適宜在鹽鹼地區 栽培和設施栽培的農作物抗鹽新品種將不僅能有效解決設施栽培土壤鹽漬化問題，而且還 能通過有效利用部分鹽漬化土地而大大地緩解我國土地資源匱乏的問題。近年來，隨著模式植物擬南芥和水稻基因組測序完成，植物基因組學研究已轉入 到功能基因組學。目前一些研究功能基因組學的新方法和實驗技術體系如cDNA微陣列、 基因晶片、基因表達系統分析(serial analysis ofgene expression, SAGE)、基因高支除 (gene knockout)和RNAi分析均能有效分析大量基因的表達和功能模式，並在耐鹽性相 關功能基因資源發掘上取得了一定進展。一些與滲透調節相關基因已從不同植物種類中 被成功克隆並轉化應用，如脯氨酸合成相關基因P5CS(Kishor PBK, Hong Z，MiaoG H, Hu CAA, Verma DPS. Overexpression of P5CS increases prolineproduction and confers osmotolerance in transgenic plants. Plant Physiol, 1995,108 :1387_1394)禾口舌甘菜喊 脫氫酶BADH基因(肖崗，張耕耘，劉鳳華等，山菠菜甜菜鹼醛脫氫酶基因研究，科學通報， 1995,40(8) :741-745)。植物體內Na+離子平衡是植物自身耐鹽調節的重要機制。朱健康研究小組發現擬 南芥SOS基因系列的調控信號是植物自身調節Na+離子平衡的重要途徑之一。2005年，林 鴻宣研究小組與美國欒升教授合作，成功克隆了水稻耐鹽相關的數量性狀基因SKC1。該基 因能控制水稻植株地上部鈉離子和鉀離子的含量，維持鈉和鉀離子平衡，使過量鈉離子不 在莖葉等部位積累，並使鈉離子回流到根部，減輕鈉離子毒害，同時增加營養元素鉀離子， 從而增加水稻耐鹽性。

發明內容
本發明提供了一種水稻蛋白，名稱為0sSRA2，它是一個受鹽誘導表達方式的蛋白， 有助於提高水稻耐高鹽性能。
一種水稻蛋白，具有序列表中SEQ ID NO. 1所述的胺基酸序列。該蛋白具有抗壞血酸過氧化物酶活性，清除因高鹽脅迫產生過多的活性氧(超氧 離子或過氧化氫)，維持細胞體內活性氧水平在正常範圍內，保護幼苗、植株免遭因高鹽引 發的氧化損傷，提高植物抗逆能力。根據上述水稻蛋白0sSRA2的胺基酸序列，通過NCBI和TIGER資料庫搜索，比 對到編碼水稻抗壞血酸過氧化物酶蛋白的基因0sSRA2 (Qryza sativa Salt Responsive APX02)，基因0sSRA2的基因號為0s07g0694700 (ID 4344397)。該基因的開放閱讀框(ORF) 為 756bp, mRNA 長度為 1392bp。本發明還提供一種編碼上述水稻蛋白的基因以及該基因在提高植物耐鹽性能中 的應用。所述的植物優選為水稻、擬南芥、草莓、辣椒、茄子、一串紅或非洲菊。上述基因應用於提高植物耐高鹽的性能，具體操作優選如下(1)將編碼所述的水稻蛋白0sSRA2的基因連接到載體中，得到重組載體；(2)將重組載體通過農桿菌介導轉化到目標植物中；(3)篩選得到具有耐鹽性能的植株。本發明水稻蛋白可以提高水稻耐高鹽性能，若將編碼該蛋白的基因導入其它植物 當中，如草莓、辣椒、茄子、一串紅、非洲菊、擬南芥和水稻等，也有可能提高這些植物的耐高 鹽性能。通過上述手段，一方面可以增加作物在鹽鹼地上的產量，提高我國濱海地區的鹽鹼 地的利用；另一方面可以克服設施條件下蔬菜、花卉等植物因土壤返鹽的連作障礙，提高其 產量和品質，增加農民收入。
具體實施例方式基因的獲得(1)以雜交水稻耐鹽組合汕優10號和鹽敏感組合兩優培九為材料，將它們的種子 播在含IOOmM NaCl溶液浸溼濾紙培養皿中，置於30°C培養箱中發芽，每天更換鹽溶液，以 保持鹽濃度基本一致。待幼苗生長至10d，分別收集汕優10號和兩優培九幼苗的葉片。(2)用冷丙酮/三氯乙酸沉澱法(Salekdeh G H，Siopongco J， Wade L J, Ghareyazie B, Bennett J. A proteomic approach to analyzing drought-andsalt-responsiveness in rice. Field Crop Res,2002,76(2-3) : 199-219)快 速提取葉總蛋白，具體操作如下1)水稻葉片用液氮研磨成細粉，分裝入1.5ml離心管中，加入Iml蛋白提取液 1(含10%三氯乙酸和0.07% β-巰基乙醇的丙酮溶液)在-20°C沉澱粗蛋白lh，在4°C、 13000rpm下離心20min，取沉澱，棄上清；2)然後往沉澱中加入Iml蛋白提取液II (含0. 07% β -巰基乙醇的丙酮溶液)， 在_20°C懸浮粗蛋白丸lh，在4°C、13000rpm下離心20min，取沉澱，棄上清，再重複用蛋白提 取液II，在相同條件下懸浮提取3次後，真空抽乾沉澱；3)用裂解液(含 7mol/L 尿素、2mol/L 硫脲、4% Chaps (Ameresco 公司，美國)、 50mmol/L DTT(Promega公司，美國)和0. 5% pH3_10的40%兩性電解質)溶解沉澱，裂解 液用量為25 μ 1裂解液/mg沉澱，然後在室溫下放置lh，裂解期間不斷渦旋5-6次。
(2) Iflig Bradford ^ (Bradford M Μ. A rapid and sensitive method forthe quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle ofprotein-dye binding. Anal Biochem，1976，72 :248_54)用考馬斯亮蘭 G-250 (Sigma 公 司)測定上述裂解液中的蛋白含量，上述裂解液中的蛋白用雙向凝膠電泳(第一向採用 17cm pH7-10的IPGs幹膠條(Bio-Rad公司)聚焦，第二向採用變性/SDS-2D-PAGE分離) 分離。第一向等電聚焦分四步進行，第一步，電壓250V 15min ；第二步，電壓10000V 5h ； 第三步，電壓10000V，60000Vh ；第四步，電壓500V直到結束。在第一向等電聚焦向第二向轉換時，需要平衡膠條，分兩步進行，第一 步，在平衡液 1(含 6. Omol/L 尿素、2 % SDS(Promega 公司，美國)、0· 375mol/L pH 8. 8Tris-HCl(Promega公司，美國)、20%甘油和 130mmol/L DTT (Promega公司，美國))中平 衡 IOmin ；第二步，在平衡液 II (含 6. Omol/L尿素、2% SDS (Promega 公司，美國)、0. 375mol/ L pH 8. 8Tris-HCl(Promega 公司，美國)、20% 甘油和 135mmol/L 碘乙醯胺)中平衡 lOmin， 然後轉移到第二向SDS-2D-PAGE膠，跑膠採用恆流，每塊膠的電流24mA，運行5_6h。剝離凝膠，蒸餾水短暫洗滌兩次，放入膠體考馬斯亮藍染液(0. 12%考馬斯亮藍 G-250+10%硫酸銨+10%磷酸+20%乙醇)水平搖床上染色12h，然後用蒸餾水洗滌至背景 清晰。掃描後用PDQUEST (Bio-Rad公司)軟體分析膠圖匹配情況，結果發現在汕優10號 幼苗葉片中一個高表達蛋白點，估測其等電點和分子量分別為PI5. 21和27KD左右。(3)在膠上切下該高表達蛋白點，加入8μ 1 IOng/μ 1胰蛋白酶(Trypsin，Roche， 美國)進行膠內消化，然後置於4°C冰箱放置40min使膠片完全吸收酶液，再補加10 μ 1 25mM碳酸氫銨緩衝液(pH 8.0)，於371溫育12h，膠內蛋白質被酶解成肽段混合物。(4)在上述肽段混合物中加入30-50 μ 1 5% TFA(Merk公司，德國)於40°C提取上 述酶切肽段1小時一次，再用相同體積的50% CAN和2. 5% TFA(Merk公司，德國)溶液於 30°C提取1小時一次，最後用25 μ ICAN(Fischer公司，美國)超聲提取一次，合併3次提取 液。真空乾燥，然後用4μ1 0.5%三氟乙酸溶解，將0.6μ1溶解物用基質輔助雷射解吸離 子化飛行質譜(MALDI-T0F-MS)分析，獲得肽質量指紋(P印tide MassFingerprint，PMF)圖 譜，查詢Mascot資料庫，以較高分值(84)顯著(比對分高於60)比對到水稻0sSRA2蛋白， 匹配序列佔總胺基酸序列49 %。根據已有的水稻0sSRA2蛋白的胺基酸序列，通過NCBI和TIGER資料庫搜索，比對 到編碼水稻冷激蛋白基因，基因號為0s07g0694700。該基因的開放閱讀框(ORF)為756bp， mRNA 長度為 1392bp。基因克隆與轉化 以汕優10號幼苗(播後10天)總mRNA為模板，利用RT-PCR方法擴增到0sSRA2 基因的編碼序列。 具體操作如下首先，將mRNA反轉錄成第一鏈cDNA，所用反轉錄試劑盒為TaKaRa 公司的 High Fidelity PrimerScript RT-PCR Kit，反應體系 20 μ 1，依次加入 1 μ 1 20Μ 隨機引物(Random 6mers)、1 μ 1 IOmM dNTP、2 μ 1 總 RNA 和 DEPC 水至 10 μ 1，在 65°C變性 5 分鐘，迅速在冰上冷卻2分鐘，稍微離心，然後依次加入4μ 1 5 X PrimerScript RT buffer、0. 5μ 1 RNaseinhibitor、0· 5μ 1 PrimerScript RTase 和 5 μ 1 DEPC 水。輕微混合均勻， 30°C反應10分鐘，42°C反應30分鐘，95°C 5分鐘使酶失活。為了去掉與cDNA互補的RNA 鏈，加入1 μ 1 RNase H在37°C溫育20min，-20°C保存。然後以第一鏈cDNA為摸板擴增目 的基因0sSRA2，所用擴增配對引物0sSRA2-F，5，-TCTAGA ATGGGCAGCA AGTCGTACCC-3，，0sSRA2-R, 5，-GGTACCTTATTCCTCAGCAAATCCCA-3，，PCR 反應體系為 50 μ 1，依次加入 2 X PCR buffer 25 μ 1,2. 5mM dNTPs4yl、反轉 錄產物 2 μ 1、20μΜ 正向引物(0sSRA2-F) 1 μ 1、20μΜ 反向引物(0sSRA2-R) 1 μ 1、2· 5U/μ 1 Tag DNA聚合酶0. 5μ 1，最後加水至50μ 1。PCR反應條件預變性94°C 3min，變性94°C 15s， 退火55°C 15s，延伸72°C50s，30個循環，最後延伸72°C 10min，4°C保存。擴增後將0sSRA2基因裝入pMD19_T載體中pMD19_T載體由TakaRa公司生產。將 回收純化的0sSRA2基因的DNA與pMD19-T載體進行連接反應，連接體系10μ 1，各組分分別 為0. 5μ1 pMD19-T載體、4. 5μ 1純化的0sSRA2基因的DNA、5y 1 Solution I。在 14°C_16°C 下連接8-12小時，然後將連接產物轉化到大腸桿菌DH5 α感受態細胞中。將0sSRA2基因裝 入PMD19-T載體後經測序正確，用TakaRa公司生產的EcoRI和HindIII酶切，操作如下酶 切體系 40 μ 1，包括4「 IlOXbuffer,8 μ 1 已插入 0sSRA2 基因的 pMD19_T 載體、1 μ 1 XbaI、 1 μ IKpnI和26 μ 1水，在37°C水浴中溫育6h。用北京博大泰克生物技術公司生產的Glassmilk kit回收基因片段，操作如下 上述混合DNA經凝膠電泳以後，從凝膠上切下所需DNA片段，放在1. 5ml的Eppendorf管中。 加入3倍體積的溶膠液，室溫下放置5min，期間輕搖Eppendorf管幾次使膠完全溶化。加入 10 μ 1玻璃奶，顛倒混勻，冰浴下放置IOmin0每隔2_3min混勻1次，12000rpm離心30s,吸 棄上清。加入250 μ 1漂洗液，用移液器吹打漂洗液，輕柔地將玻璃奶懸浮混勻，12000rpm離 心30s，吸棄上清。重複漂洗1次。用槍頭將剩餘的漂洗液吸乾淨。然後，放置於37°C溫箱 乾燥15-20min。加入20 μ 1的無菌蒸餾水，混勻，60°C水浴5min，12000rpm離心lmin，回收 上清液，即為純化的基因0sSRA2。將回收的基因片段連入Super 1300載體中，操作如下連接體系10 μ 1，包括 2μlSuperl300載體、6μl純化的基因的DNA、lμl 10XΤ4連接酶buffer和1 μ 1 Τ4連接 酶，在4-10°C下連接12h，然後將連接產物轉化到大腸桿菌DH5ci感受態細胞中，提取質粒
進行鑑定。基因片段連入Superl300載體後再轉入EHA105農桿菌中，操作如下取200 μ 1農 桿菌感受態細胞，加入5-10 μ 1構建好的質粒DNA，30°C冰浴30min，液氮中速凍lmin，37°C 水浴5min，然後加入Iml YEB培養基(1升YEB培養基含Ig酵母提取物、5g牛肉浸膏、5g蛋 白腖、5g 蔗糖和 0. 5g MgSO4 ·7Η20，ρΗ 7. 0)，28°C恢復培養 4h ； IOOOOg 離心 30s，棄上清， 加入0. Iml YEB培養基重新懸浮細胞，塗布於含有100 μ g/ml卡那黴素和125 μ g/ml利福 平的YEB平板(1升YEB培養基含Ig酵母提取物、5g牛肉浸膏、5g蛋白腖、5g蔗糖、0. 5g MgSO4 · 7H20 和 12g 瓊脂，ρΗ 7. 0)上，28°C培養約 48h。經鑑定正確後(挑取陽性克隆作為模板，用菌落PCR方法進行鑑定)，通過農杆 菌介導轉化模式植物水稻，操作如下接種含有目的質粒的農桿菌菌落於IOml YEB培養 基(含0. 酵母提取物、0. 5%牛肉浸膏、0. 5%蛋白腖、0. 5%蔗糖、0. 05% MgS04 · 7H20、1. 2%瓊脂、100 μ g/ml卡那黴素和125 μ g/ml利福平)中28°C、200rpm震蕩培養過夜，轉化 前一天按1 50接種於200ml含相同抗生素的YEB培養液中擴大培養至OD6tltl為0.6-0. 8。 取菌液，按1 % 2 %的比例，轉入新配製的無抗生素的YEB液體培養基中，6小時後，菌液 OD600為0. 2 0. 5時即可用於轉化。取粳稻品種愛知旭(Oryza sativa L cv Aichi Asahi)幼胚，用70%酒精浸泡 lmin，然後用0. 升汞溶液滅菌30min，再用無菌水衝洗3次，置無菌濾紙上吸乾，接種於 誘導培養基(NB培養基外加2mg. ^2,4-0)上誘導愈傷組織ll_13d後繼代，繼代後4d用於 共培養。愈傷組織在含有lOOmol. L—1乙醯丁香酮和含目的基因質粒的農桿菌的液體培養 基中培養20min，用濾紙吸去多餘的菌液後，轉到含乙醯丁香酮的固體培養基上26°C暗培 養2d，經共培養的愈傷組織轉移到選擇培養基(NB培養基外加2mg. Lld-DjOmg. L—1潮黴 素B和頭300mg. L—1頭孢噻肟)上。IOd後挑選成活的愈傷組織進行復篩，抗性愈傷轉移到 分化培養基(NB 培養基外加 2mg. Lld-DJmg. U\6~M,0. 5mg. L-1NAAdmg. L-1KTJOmg. Γ1 潮黴素B和頭SOOmg.L—1頭孢噻肟)上誘導出苗。培養溫度26°C，每天光照15h。抗性植株 轉到含 1/2N6 大量元素(1415mg. L-1KNO3Jl. 5mg. L-1NH4SO4^Smg. L-1CaCl2 · 2Η20、92· 5mg. L-1MgSO4 · 7H20、200mg. L-1KH2PO4^OOmg. L-1FeSO4 · 7H20 和 2. 2mg. L-1MnSO4 · 4H20)的無激素 培養基上使其生根。當試管苗長到約8cm高並有發達的根系時，即可移栽入土。單株收穫 Tl代種子。繁種並鑑定至T3代，獲得純合的轉基因52個株系。通過農桿菌介導浸花法轉化模式植物擬南芥，操作如下接種含有目的基因質粒 的農桿菌菌落於10ml YEB培養基(含0. 酵母提取物、0.5%牛肉浸膏、0.5%蛋白腖、 0. 5% 蔗糖、0. 05 % MgS04 · 7!120、1.2%瓊脂、10(^8/1111 卡那黴素和 125 μ g/ml 利福平) 中28°C、200rpm震蕩培養過夜，轉化前一天按1 50接種於200ml含相同抗生素的YEB 培養液中擴大培養至0D600為1. 2 1. 6，約6h，5000g離心15min集菌，重懸於滲透緩衝 液，使0D600為0. 8,200ml重懸液可使用3次。轉化所用浸泡液含有0. 5XMS大量元素、 0. 5XMS 微量元素、0. 5mg/L VB5、5%蔗糖、44nM 6-BA(Sigma 公司，美國)和 0. 03% Silwet L-77 (LEHLE SEEDS公司，美國)。將200ml含目的農桿菌的滲透轉化液置於一容器中，翻轉 種有擬南芥的花盆，使植株浸入含有待轉化農桿菌的滲透緩衝液中，浸5分鐘，緩慢取出花 盆，側放於託盤中，蓋上黑塑料布避光24小時，第二天取下塑料布，直立放置花盆。製備MS篩選平板(MS培養基外加80g/ml潮黴素和50g/ml氨苄青黴素)，轉化收 獲的Tl代種子經消毒後播種於篩選平板，每15cm的平板上可以篩選100 μ g左右的擬南芥 種子。4°C春化3天，平放在生長箱中培養(22°C恆溫，24h光照)，7-10天後挑選在篩選培 養基上根系和地上部生長正常的陽性植株，移入正常MS培養基緩苗3-5天後移植入土壤， 單株收穫T2代種子。繁種並鑑定至T3代，獲得純合的轉基因52個株系。基因功能鑑定取T3代純合轉基因株系和野生型(粳稻品種愛知旭)種子，均勻放在兩層用蒸餾 水潤溼的發芽紙上，在25°C光照條件下培養10d，觀察幼苗生長情況。然後將轉基因株系和 野生型的水稻幼苗分別移入含200mMNaCl或正常清水的發芽盒內，置於相同光溫條件的培 養箱中培養。培養5d後，觀察轉基因株系與野生型幼苗在高鹽脅迫下的表型。結果發現在 200mM NaCl處理下，野生型水稻幼苗葉片出現白化表型，嚴重時幼苗白化死亡，而轉0sSRA2 基因株系葉片仍保持綠色。葉片最大光化學效率測定(Fv/Fm)結果表明，在200mM NaCl下，
7野生型幼苗地上部最大光化學效率顯著降低，而轉0sSRA2基因株系幼苗地上部最大光化 學效率未出現明顯變化，說明0sSRA2基因在水稻中超量表達可以提高水稻幼苗耐鹽性。
T3代純合轉基因株系和野生型((ecotype Columbia))擬南芥種子用1 %次氯酸 鈉消毒，在4°C冰箱中春化3天，然後置於溫度22°C、溼度50%、連續24h光照的培養箱中 培養。培養7d後，觀察幼苗生長情況。待幼苗子葉完全展開後，將轉基因株系和野生型幼 苗移入含200mM NaCl和正常的MS固體培養基(含1 X大量元素、1 X微量元素、1 X鐵鹽、 3%蔗糖和0.8%瓊脂)上，然後置於相同光溫條件(22°C、溼度50%、連續24 h光照)的培 養箱中培養。培養12-15d後，觀察轉基因株系與野生型幼苗在高鹽脅迫下的表型。結果發 現在200mM NaCl下，野生型幼苗全部白化死亡，轉0sSRA2基因株系幼苗葉片仍保持綠色， 說明0sSRA2基因超量表達可以緩解擬南芥鹽害。
權利要求
一種水稻蛋白，具有序列表中SEQ ID NO1所述的胺基酸序列。
2.一種編碼權利要求1所述的水稻蛋白的基因，具有序列表中SEQ IDNO :2所述的核 苷酸序列。
3.編碼權利要求1所述的水稻蛋白的基因在提高植物耐鹽性能中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於所述的植物為水稻、擬南芥、草莓、辣椒、 茄子、一串紅或非洲菊。
5.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於，包括以下步驟(1)將編碼所述的水稻蛋白的基因連接到載體中，得到重組載體；(2)將重組載體通過農桿菌介導轉化到目標植物中；(3)篩選得到具有耐鹽性能的植株。
全文摘要
本發明公開了一種水稻蛋白OsSRA2，具有序列表中SEQ IDNO.1所述的胺基酸序列。本發明蛋白在水稻幼苗中過量表達，可以提高水稻和擬南芥幼苗耐高鹽能力。若將編碼該蛋白的基因轉化辣椒、茄子、草莓、一串紅、非洲菊等蔬菜、花卉等植物，有助於提高其耐高鹽性能，不僅可以增加蔬菜、花卉在鹽鹼地上的產量，提高我國濱海地區的鹽鹼地的利用；而且克服設施條件下因土壤返鹽引起的連作障礙，提高蔬菜、花卉等植物的產量和品質，促進農業增效和農民增收。
文檔編號C07K14/415GK101942015SQ20091015583
公開日2011年1月12日 申請日期2009年12月28日 優先權日2009年12月28日
發明者餘紅, 忻雅, 方獻平, 來文國, 王世恆, 王淑珍, 白宇傑, 童建新, 肖文斐, 鄭桂珍, 阮松林, 馬華升 申請人:杭州市農業科學研究院