一種可溶性大腸桿菌表達質粒及其用途的製作方法

2023-06-09 02:22:41 4

專利名稱：一種可溶性大腸桿菌表達質粒及其用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程領域，涉及在大腸桿菌中以可溶性形式高效表達蛋白質/多肽的重組質粒載體及應用。本發明進一步涉及該重組質粒載體在製備蛋白質/多肽藥物、診斷抗原、以及疫苗等方面的應用。
背景技術：
DNA重組技術又稱基因工程，為大量獲得蛋白質/多肽(以下所稱「蛋白質」和「多肽」通用)提供了技術支持。已有不少蛋白質類藥物、疫苗、診斷試劑採用基因工程方法生產。要獲得大量的具有生物學活性的蛋白質，選擇合適的表達系統是關鍵。在眾多的表達系統之中，大腸桿菌表達系統是目前應用最為廣泛的經典表達系統，具有結構簡單、易操作、成本低廉的優點。但採用大腸桿菌高效表達外源蛋白質時，外源蛋白質經常以不溶性的包涵體形式存在。包涵體要用變性劑溶解，再通過復性過程才能得到在緩衝液中溶解的蛋白質。經過復性處理的目標蛋白質不一定能完全恢復原來的生物學活性，有時甚至完全得不到有活性的蛋白質。復性處理工藝也使目標蛋白質的製備成本上升。
將目標蛋白質與某一伴侶蛋白(或稱載體蛋白)形成融合蛋白質，使其以可溶性形式表達，是避免形成包涵體的一種最常見的策略。目前使用最多的伴侶蛋白是大腸桿菌的硫氧還蛋白(thioredoxin，簡稱Trx)(La Vallie et al，1993，Biotechnology，11187-193)。使用硫氧還蛋白作為載體蛋白的蛋白質表達系統已經由美國Invitrogen公司開發成為商品，並得到廣泛使用。然而在大腸桿菌的最適生長溫度37℃條件下，Trx不能保證融合蛋白以可溶性的形式存在，特別是目標蛋白比較大時，更是如此。雖然可以用較低的溫度(比如15℃)增加融合蛋白的可溶性，但低溫時的表達效率太低，不適合大量表達目標蛋白質。
此外，還有另外幾個伴侶蛋白用於融合表達，如分子量為40kDa的麥芽糖結合蛋白(maltose-binding protein，簡稱MBP)(Guan et al，1988，Gene，6721-30)和分子量大小為26kDa的穀胱甘肽巰基轉移酶(glutathione S-transferase，簡稱GST)(Smith et al，1988，Gene，1988，6731-40)。但它們形成可溶性融合蛋白的能力比Trx還要差。其它還有一些含原核基因引導序列的分泌型表達載體，如含ompA、pelB、CBD、DsbA/C、β-半乳糖酶、鹼性磷酸酶等基因的引導序列的表達載體，但多受到通用性、穩定性等因素的困擾，目前應用的並不多。
最近美國Invitrogen公司又開發了另一個可溶性大腸桿菌表達系統。他們以大腸桿菌的NusA作為伴侶蛋白，融合蛋白的可溶性和穩定性都獲得了改善(Marco et al，2004，Biochemical and Biophysical ResearchCommunications，322766-771)。但NusA蛋白由495個胺基酸殘基組成。採用該系統生產蛋白質藥物，一般要在獲得融合蛋白之後，將目標蛋白質從融合蛋白上裂解下來。因為NusA蛋白本身太大，該系統的效率將會受到影響。
國內楊海傑等(2003，廈門大學學報(自然科學版)，42(4)410-415)以opmT基因的引導序列為伴侶基因構建了分泌型表達載體pTO-OT。該系統表達的重組蛋白主要存在於胞內，可溶性的蛋白僅佔總目的蛋白的20-30％。

發明內容
(一)要解決的技術問題本發明的目的旨在提供一種可溶性大腸桿菌重組質粒載體以克服上述缺陷。
(二)技術方案本發明以大腸桿菌表達系統為基礎構建重組質粒載體(命名為pMB)，圖1是可溶性表達質粒pMB結構示意圖。該重組質粒具有以下特徵
(1)含有SEQ ID NO1的核苷酸序列或者SEQ ID NO1中一個或幾個核苷酸殘基的替換、缺失、添加或插入形成的核苷酸序列。SEQ IDNO1又稱為msyB基因，由378個鹼基對組成，是大腸桿菌基因組中的固有序列。
(2)其表達產物具有SEQ ID NO2的胺基酸序列或者SEQ ID NO2中一個或幾個胺基酸殘基的替換、缺失、添加或插入形成的胺基酸序列。
採用DNA重組技術構建本發明質粒載體的步驟如下(1)選用來源於大腸桿菌基因組的msyB基因作為伴侶基因，採用PCR方法，從大腸桿菌基因組中擴增msyB基因；(2)將msyB基因插入質粒中，使msyB基因置於蛋白質表達調控元件的控制之下，獲得含有msyB基因的表達質粒；(3)將目標蛋白的編碼基因插入表達質粒中，獲得含有融合基因的重組質粒。
其中步驟(1)中是根據msyB基因序列設計1對引物msyBup/msyBdn，用於擴增msyB基因，在引物msyBup/msyBdn兩端分別加上Kpn I/EcoRI酶切位點，引物序列如下msyBup5′-ATT GGT ACC GTG ATG ACCATG TAC GCA ACG-3′，msyBdn5′-ATT GAA TTC ATT GAA GGCAGAACG TTC ATC CCA CTC ATC-3′。為了便於將目標蛋白從融合蛋白上裂解下來，在msyB的3′端插入了一段序列ATT GAA GGC AGA，這是Xa的作用位點。
用大腸桿菌菌液為模板，或者以大腸桿菌總DNA為模板，用特異性引物msyBup/msyBdn擴增msyB基因片段。PCR反應體系的組成和溫度循環條件根據常規方法確定。msyB基因的長度為378bp，因此，PCR產物在瓊脂糖凝膠電泳檢測時可觀察到400bp左右的特異性條帶。
其中步驟(2)中選用的質粒，稱為基礎質粒，比如pET-32a(美國Invitrogen公司產品，購自廣州美津生物技術有限公司)，具有調控蛋白質表達的基本元件，能保證融合蛋白在大腸桿菌中正確表達。將PCR產物酶切消化，同時將基礎質粒用相應的限制性內切酶和CIAP進行消化；在DNA連接酶的作用之下，將已經消化的基礎質粒和msyB基因的PCR產物連接，連接產物直接用於轉化大腸桿菌DH5α。在具有氨卞青黴素(或其它抗生素)存在的培養基中，篩選出陽性克隆，再經過PCR篩選、酶切鑑定和序列測定，獲得具有msyB基因的表達質粒，命名為pMB。用特異性引物msyBup/msyBdn進行PCR，可以擴增出400bp左右DNA條帶的克隆為陽性克隆。將陽性克隆用LB培養基(含1μg/ml氨卞青黴素，Amp)在37℃繼續培養，然後抽取質粒，用限制性內切酶對質粒進行消化，應該獲得預期大小的DNA片段。對重組質粒進行序列測定，應該含有msyB基因的完整序列(SEQ ID NO1)，且讀碼框正確。
其中步驟(3)中是採用特異性引物擴增目標蛋白的編碼基因(目標基因)，然後採用(1)的步驟，將目標蛋白的編碼基因插入表達質粒pMB中，使目標基因置於msyB基因的3′端，msyB基因和目標基因形成融合基因。將目標基因的PCR產物酶切消化，同時將表達質粒pMB用相應的酶進行消化；在DNA連接酶的作用之下，將已經消化的質粒pMB和目標基因的PCR產物連接，連接產物直接用於轉化大腸桿菌DH5α。在具有氨卞青黴素(或其它抗生素)存在的培養基中，篩選出陽性克隆，再經過PCR篩選、酶切鑑定、和序列測定，獲得具有融合基因的表達質粒，命名為pMB-X。用特異性引物進行PCR，可以擴增出預期大小DNA條帶的為陽性克隆。將陽性克隆用LB培養基(含1μg/ml氨卞青黴素，Amp)在37℃繼續培養，然後抽取質粒，用限制性內切酶對質粒進行消化，可獲得預期大小的DNA片段。對重組質粒進行序列測定，其含有融合基因的序列(序列1)，且讀碼框正確。
用經酶切鑑定和序列測定的本發明的重組質粒轉化合適的大腸桿菌菌株BL21(DE3)(美國stratagene公司產品，購自廣州美津生物技術有限公司)，獲得表達融合蛋白的基因工程菌。在IPTG(或其它合適的誘導條件)的誘導之下，獲得的融合蛋白中，目標蛋白位於msyB蛋白的C端。為了便於獲得純的目標蛋白，可以在msyB與目標蛋白之間設計一蛋白酶特異性消化位點，這樣在純化融合蛋白之後，就可以通過特異性蛋白酶消化，將目標蛋白從融合蛋白上裂解下來。
本發明提供的重組質粒具有重要的應用價值。應用之一是採用所述的可溶性表達質粒，表達作為免疫原使用的蛋白質或多肽。採用該表達質粒表達的蛋白質或多肽可以直接作為免疫原免疫動物，也可以純化之後免疫動物，或與佐劑配合之後免疫動物。有時為了減少免疫的副作用，如果目標蛋白足夠大，也可以用特定蛋白酶處理融合蛋白，將目標蛋白與伴侶蛋白裂解，收集、純化目標蛋白，然後用相應的目標蛋白作為抗原免疫動物或人。
本發明提供的重組質粒的第二個應用，是採用該系統表達蛋白質類藥物。採用該表達方法表達的融合蛋白，經特定蛋白酶作用之後，將目標蛋白與伴侶蛋白裂解，收集、純化目標蛋白，就可以獲得相應的蛋白質。
本發明提供的重組質粒的另一個應用，是採用所述的表達方法，獲得蛋白質抗原，用於檢測人或者動物血清中的特異性抗體。
(三)有益效果本發明具有明顯的優點和效果(1)和目前已經存在的大腸桿菌可溶性表達系統相比，採用本發明提供的表達系統表達目標蛋白，融合蛋白中可溶性蛋白比例超過90％。本系統採用msyB蛋白作為融合蛋白的伴侶蛋白，大大提高了融合蛋白的可溶性。msyB蛋白是大腸桿菌本身的蛋白，是一種高度可溶性多肽，在大腸桿菌中表達量高，其作為伴侶蛋白具有穩定性好、可溶性強和表達水平高的特性。當被誘導表達時，msyB多肽作為載體可與外源蛋白一道分泌到大腸桿菌的細胞質中，大大增加了外源蛋白的可溶性，且表達的外源蛋白能夠正確摺疊。
(2)本發明提供的表達系統是在目前廣泛使用的大腸桿菌質粒的基礎上改造的，因此該表達質粒具有大腸桿菌質粒本身所具有的其它優點，比如可以利用組氨酸標籤(6 x His Tag)進行親和層析純化目標蛋白。
(3)因為msyB蛋白本身具有大小合適、可溶性強的特點，本發明提供的表達質粒還具有適用範圍廣，表達蛋白容量大的優點。
(4)由於採用本發明提供的表達質粒表達的融合蛋白中90％以上都是可溶性的，因此融合蛋白的純化工藝大為簡化，蛋白製備成本大大降低。


圖1是可溶性表達質粒pMB結構示意圖。目標蛋白位於msyB蛋白的C端，兩者之間有可裂解位點。msyB蛋白的N端有一6x His標籤，方便採用Ni柱親和層析純化融合蛋白。融合基因位於蛋白質表達調控元件的控制之下。
圖2是msyB基因PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。M為DNA分子量標準DL2000，1-5為PCR產物。
圖3是表達質粒pMB示意圖。
圖4是禽流感病毒(H9N2)非結構蛋白NS1基因PCR產物電泳圖。M為DNA分子量標準DL2000，1-4為PCR產物。
圖5是重組質粒pMB-NS1的酶切鑑定圖譜。M1為DNA分子量標準DL15000，M2DNA分子量標準DL2000，1、2為經限制性內切酶EcoRI和Xho I消化的質粒。
圖6為不同時間NS1誘導表達產物的SDS-PAGE分析。M為蛋白質分子量標準，1為空質粒對照，2為0h誘導，3-7分別為誘導表達1、2、3、4、5h的NS1產物。
圖7是融合蛋白NS1的可溶性分析。M為蛋白質分子量標準，1為空質粒對照，2為細菌裂解上清，3為細菌裂解沉澱。
圖8是融合蛋白NS1的Western blot分析。M為預染色的蛋白質分子量標準；1為NS1融合表達產物。
圖9是融合蛋白NS1的純化。1為空質粒對照，2為裂解液洗脫產物，3為洗滌液洗脫產物，4為洗脫液洗脫產物。
圖10是FMDV 3B基因PCR產物電泳圖。M為DNA分子量標準DL2000，1-4為PCR產物。
圖11是重組質粒pMB-3B的酶切鑑定圖譜。M1為DNA分子量標準DL15000，M2DNA分子量標準DL2000，1、2為經限制性內切酶EcoRI和Xho I消化的質粒。
圖12是融合蛋白3B的可溶性分析。M為蛋白質分子量標準，1為細菌裂解沉澱，2為細菌裂解上清。
圖13是融合蛋白3B的Western blot分析。M為預染色的蛋白質分子量標準；1為3B融合表達產物。
圖14是融合蛋白3B的純化。1為細菌裂解產物沉澱，2為裂解上清；3、4、5為純化產物。
具體實施例方式
通過下面給出的本發明的具體實施例可以進一步清楚地理解本發明，但下述實施例不是對本發明的限定。
實施例1 msyB基因的PCR擴增根據msyB基因序列設計1對引物msyBup/msyBdn，用於擴增msyB基因，msyB基因的理論長度為378bp。在引物msyBup/msyBdn兩端分別加上Kpn I/EcoR I酶切位點，引物序列如下msyBup5′-ATT GGTACC GTG ATG ACC ATG TAC GCAACG-3′，msyBdn5′-ATT GAA TTCATT GAA GGC AGA ACG TTC ATC CCA CTC ATC-3′。為了便於將目標蛋白從融合蛋白上裂解下來，在msyB的3′端插入了一段序列ATT GAAGGC AGA，這是Xa的作用位點。
用大腸桿菌菌液為模板，或者以大腸桿菌總DNA為模板，用特異性引物msyBup/msyBdn擴增msyB基因片段。PCR反應體系的組成如下10×PCR buffer 10μL，dNTPs 8μL，msyBup 1μL，msyBdn 1μL，ExTaq 1μL，加ddH2O補至100μL。PCR反應程序為94℃預變性3min；94℃ 40s，55℃ 40s，72℃ 1min，30個循環；72℃後延伸10min。
PCR產物在含有溴化乙啶的1％瓊脂糖凝膠電泳檢測時可觀察到400bp左右的特異性條帶(圖2)。克隆的msyB基因的核苷酸序列如SEQID NO1所示，長度為378bp，msyB基因的胺基酸序列如SEQ ID NO2所示，長度為125個胺基酸。
實施例2表達質粒pMB的構建將msyB基因的PCR產物用限制性內切酶Kpn I和EcoR I進行酶切消化，同時將質粒pET-32a(美國Invitrogen公司產品，購自廣州美津生物技術有限公司)用同樣的酶進行酶切消化，在T4連接酶的作用下連接，將連接產物轉化DH5α感受態細胞。轉化方法為CaCl2法。經氨卞青黴素抗性(Ampr)篩選，獲得插入了msyB基因的重組子。然後用特異性引物msyBup/msyBdn進行PCR篩選。對PCR篩選陽性的細菌，挑取單菌落接種於3mL LB培養基(含1μg/ml氨卞青黴素)中，37℃，200r/m振搖培養16～20小時。離心收集菌體，抽提質粒，再經限制性內切酶消化和序列測定，獲得的重組質粒命名為pMB。pMB載體大小約為6291bp，有6x His融合標籤，有Xa的裂解位點。
實施例3表達NS1融合蛋白的重組質粒pMB-NS1的構建根據Genbank中的禽流感病毒(AIV)非結構蛋白NS1基因序列，設計1對引物用於擴增NS1基因，在上遊引物NS1up(5′-ATG AAT TCTATG GAT TCC AAC ACT G-3′)的5′端加入EcoR I酶切位點，下遊引物NS1dn(5′-ATC TCG AGG TCA AAC TTC TGA CTC-3′)的5′端加入Xho I酶切位點。PCR擴增NS1基因，長度為654bp。克隆的NS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO3所示，NS1基因的胺基酸序列如SEQID NO4所示，長度為232個胺基酸。
然後將NS1基因插入pMB質粒中，獲得重組的pMB-NS1質粒，具體操作如下參照RizolLS Reagent(GibcoBRL公司產品)說明書提取病毒RNA，以NS1up/NS1dn為引物，在AMV反轉錄酶作用下合成AIV NS1基因的cDNA，反轉錄(RT)產物直接用作PCR擴增NS1基因的模板。按常規方法擴增NS1基因，反應條件為94℃預變性3min；94℃變性40s，50℃退火90s，72℃延伸90s，循環30次，最後72℃延伸10min。PCR產物用1.5％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mL溴化乙錠，EB)電泳檢測，在紫外燈下可以觀察到特異性條帶(圖4)。
純化的PCR產物用限制性內切酶EcoR I和Xho I在37℃消化3小時，反應體系如下10×buffer M 15μL，Xho I 5μL，EcoR I 5μL，NS1 PCR產物30μL，加ddH2O補至l00μL。用上述兩種限制性內切酶和CIAP在相同條件下消化pMB質粒。純化回收消化的NS1 PCR產物和pMB質粒，在T4 DNA連接酶的作用下進行連接，4℃過夜，連接反應體系如下10×連接buffer 1μL，消化的PCR產物2μL，消化的pMB質粒2μL，T4DNA連接酶1μL，加ddH2O補至總體積10μL。
用連接產物直接轉化E.coli DH5α感受態細胞，轉化方法為CaCl2法。經Ampr抗性篩選，獲得插入了NS1基因的重組子。然後用特異性引物NS1up/NS1dn進行PCR篩選。對PCR篩選陽性的細菌，挑取單菌落接種於3mL LB培養基(含1μg/m1氨卞青黴素)中，37℃，200r/m振搖培養16-20小時。離心收集菌體，抽提質粒，再經限制性內切酶消化(圖5)和序列測定，獲得的重組質粒命名為pMB-NS1。
實施例4 NS1基因在大腸桿菌BL21中的表達及表達產物分析取質粒pMB-NS1轉化大腸桿菌BL21(DE3)(美國stratagene公司產品，購自廣州美津生物技術有限公司)感受態細胞，轉化方法為CaCl2法。經Ampr抗性篩選，以及採用特異性引物NS1up/NS1dn進行PCR篩選，陽性菌落為含有質粒pMB-NS1的基因工程菌，命名為E-NS1。挑取陽性菌落接種3mL LB液體培養基(含有100μg/mL Amp)，37℃ 220r/min振搖過夜；次日，以1％的濃度接種10mL LB液體培養基(含有100μg/mL氨卞青黴素)，37℃ 200r/min振搖至OD600＝0.5時，加入終濃度為1mmol/L IPTG進行誘導表達，取誘導6h的菌液1mL，12000r/min離心2min，棄上清，細菌沉澱中加600μL裂解緩衝液，冰浴10min，然後超聲裂解細菌工作時間4s，間隔時間10s，功率400w，循環10次。將細菌裂解液於4℃ 12 000r/min離心10min，分別收集上清液和沉澱。上清液中加入150μL的5×SDS上樣緩衝液，100℃處理5min，用於SDS-PAGE電泳。沉澱中加入750μL 1×SDS上樣緩衝液，100℃處理5分鐘，進行SDS-PAGE電泳。根據沉澱和上清液中融合蛋白的相對量來判斷蛋白的可溶性。用感染了禽流感病毒的陽性血清對表達的融合蛋白進行Western Blot分析。
SDS-PAGE方法如下參照汪家政等(2000)編《蛋白質手冊》方法製備SDS-聚丙烯醯胺凝膠(SDS-PAG)。成層膠濃度為5％，分離膠濃度為12％。將待檢樣品煮沸5min，取10μL加入凝膠點樣孔中，在電場作用下進行電泳。電泳緩衝液為Tris-甘氨酸。電壓為80v/cm，待溴酚藍到達成層膠底部時電壓升高到160v/cm。待溴酚藍接近凝膠底部時，停止電泳，取下凝膠，置於1％考馬斯亮藍溶液中染色過夜，用脫色液脫色。電泳結果(圖6、圖7)表明，NSl融合蛋白的分子量約為59kD，用VL凝膠成像系統BiolD++程序對電泳結果進行掃描分析，融合蛋白佔細菌總蛋白的45％。經蛋白可溶性分析表明，細菌裂解上清液中目標蛋白佔總蛋白量的41.2％，沉澱中目標蛋白佔總蛋白量的3.8％，初步估算細菌中目標蛋白的可溶性部分佔91％以上。
Western Blot分析方法如下SDS-PAGE電泳結束後，不對凝膠進行染色。剪一張與凝膠相同大小的硝酸纖維素膜及兩張濾紙，與電泳之後的凝膠一起在室溫浸泡在轉移緩衝液中15min，按海綿-濾紙-凝膠-硝酸纖維素膜-濾紙-海綿的順序安裝轉印夾。將夾中有膜的一側接正極，並在15V的電壓下轉移1.5h。用鑷子夾取硝酸纖維素膜，轉移至5％脫脂奶粉/PBS溶液4℃封閉過夜。翌日，用TBS漂洗硝酸纖維素膜1遍，將硝酸纖維素膜裝入塑膠袋，加入5mL以1∶100稀釋於1％脫脂奶粉/PBS中的感染了H9N2禽流感活病毒的小鼠血清，封口，塑膠袋放在平緩搖動的搖床上，25℃溫育1h。剪開塑膠袋，廢棄液體，漂洗硝酸纖維素膜3次，每次10min。將硝酸纖維素膜裝入另一新塑膠袋，加入5mL以1∶1000稀釋於1％脫脂奶粉/PBS中的辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG(二抗)，排除氣泡密封袋口，25℃搖床搖動溫育1h。棄二抗，TBS洗滌硝酸纖維素膜3次，每次10min。把硝酸纖維素膜移至一平皿，加入底物液，觀察反應過程，待蛋白帶的顏色深度達到要求，立即用清水漂洗濾膜，然後將濾膜轉移至內裝適量PBS液的平皿中，在59kD位置可見一特異性條帶(圖8)。Western Blot結果表明表達產物都能與相應的抗體進行反應。
收集IPTG誘導表達的E-NS1菌體，於0℃冰浴上進行超聲破碎、離心後，用50％ Ni-NTA純化樹脂在非變性條件下進行純化。具體操作如下將100ml工程菌E-NS1在IPTG誘導下表達4h，取樣，4℃10 000r/m離心10min，收集菌體並保存在-20℃；將保存的細菌菌體沉澱置冰浴上解凍15min，然後向細菌沉澱中加入200mL裂解緩衝液(LysisBuffer)，冰浴10min，然後超聲裂解細菌工作時間4s，間隔時間10s，功率400w，循環30次。將細菌裂解液於4℃ 12 000r/min離心10min，收集上清液。
在層析柱中預先加入5～10mL PBS液，將純化樹脂50％Ni-NTA混勻，取出3mL緩慢逐滴加入，沉澱4～6h後，用5倍於純化柱體積的LysisBuffer平衡純化柱(流速≤1.5mL/min，純化過程的流速都如此)。待LysisBuffer即將全部進入純化樹脂之時，沿著管壁緩慢加入表達的細菌裂解上清，待上清完全進入柱床之後，用2倍於純化柱體積的Lysis Buffer過柱，收集樣品。用5倍於純化柱體積的Wash Buffer洗柱、備樣。最後用1mL Elution Buffer過柱4次，依次收集過柱液，同時備樣，將以上樣品進行SDS-PAGE分析。在SDS-PAGE圖(圖9)上可見，純化後的蛋白只有一條帶。純化的目的蛋白用凝膠成像系統BioID++程序對電泳結果進行掃描分析，純度達98％以上。純化蛋白的濃度為2.25mg/mL；誘導表達1L菌液，可獲得純化蛋白45mg。
結果表明，NS1基因插入pMB表達載體後，以融合蛋白的形式在大腸桿菌中獲得表達，表達量為細菌總蛋白的45％。蛋白可溶性分析表明，NS1基因在pMB中表達後，融合蛋白主要以可溶性形式存在。融合蛋白可溶性組分佔細菌裂解上清的41.2％，不溶組分佔細菌裂解沉澱的3.8％。重組蛋白的可溶性組分超過目標蛋白90％。
實施例5表達口蹄疫病毒非結構蛋白3B的重組質粒pMB-3B的構建根據Genbank中的FMDV 3B基因序列，設計一對引物用於擴增3B基因閱讀框架，在上遊引物3Bup(5′-ATG AAT TCG GAC CCT ACG CCGGGC CAC TC-3′)的5′端引入EcoR I酶切位點，下遊引物3Bdn(5′-ATCTCG AGC TCA GTG ACA ATC-3′)的5′端引入Xho I酶切位點。PCR擴增3B基因，長度為213bp；然後將3B基因插入pMB質粒中，獲得重組的pMB-3B質粒，具體操作如下參照RizolLSReagent說明提取病毒RNA，以3Bup/3Bdn為引物，在AMV反轉錄酶作用下合成FMDV 3B基因的cDNA，RT產物直接用於PCR擴增3B基因的模板。按常規方法擴增3B基因，反應條件為94℃預變性3min；94℃變性40s，55℃退火90s，72℃延伸90s，循環30次，最後72℃延伸10min。PCR產物用1.5％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mL溴化乙錠，EB)電泳檢測PCR產物，在100V的電壓下進行電泳，20min後在紫外燈下觀察結果。克隆的口蹄疫病毒非結構蛋白3B基因的核苷酸序列如SEQ ID NO5所示，長度為213bp。3B基因的胺基酸序列如SEQID NO6所示，長度為71個胺基酸。
用EcoR I和Xho I雙酶切純化的PCR產物，37℃作用3h，反應體系如下10×buffer M 15μL，Xho I 5μL，EcoR I 5μL，3B PCR產物30μL，ddH2O補至100μL。同時用上兩種酶酶切pMB質粒。純化回收酶切後的3B PCR產物和pMB質粒，在T4 DNA連接酶的作用下進行連接，4℃連接過夜，反應體系如下10×連接buffer 1μL，PCR酶切回收產物2μL，pMB質粒回收產物2μL，T4 DNA連接酶1μL，ddH2O補至10μL。
將連接產物轉化E.coli DH5α感受態細胞，取菌液塗布LB固體培養基(含有100μg/mL Amp)上，37℃培養12～16h。從平板上挑取5個單菌落接種3mL含100μg/mL Amp的LB培養液中，37℃振搖培養12h後，取菌液用引物3Bup/3Bdn進行PCR檢測，同時設立空白對照，反應體系如下10×PCR buffer 2uL，菌液0.5uL，dNTPs 2uL(2.5mM)，3Bup 0.5uL(20uM)3Bldn 0.5uL(20uM)，EX Taq 0.1uL(5U/uL)，ddH2O補至20uL。按常規方法擴增3B基因，反應條件為94℃預變性3min；94℃變性40s，50℃退火90s，72℃延伸90s，循環30次，最後72℃延伸10min。PCR產物用1.5％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mL溴化乙錠，EB)電泳檢測PCR產物，在100V的電壓下進行電泳，20min後在紫外燈下，可見特異性條帶(圖10)。
將PCR鑑定為陽性的菌落置37℃ 220r/m過夜振蕩培養，收集菌體，提取質粒。用EcoR I和Xho I雙酶切質粒，反應體系如下10×buffer M2.5ml，Xho I 0.75μL，EcoR I 0.75μL，重組質粒10μL，ddH2O補至25μL。離心混勻後，37℃反應2小時，用1.0％瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，紫外燈下可見兩條預期大小的DNA條帶(圖11)。取質粒酶切鑑定正確的轉化子菌液送上海博亞公司進行DNA序列測定。將測序鑑定正確的表達質粒命名為pMB-3B。
實施例6 3B基因在大腸桿菌BL21中的可溶性表達用質粒pMB-3B轉化大腸桿菌BL21感受態細胞，轉化方法為CaCl2法。將菌液均勻塗布在LB固體培養基(含有100μg/mL Amp)上，37℃培養12～16小時。挑取菌落接種3mL LB液體培養基(含有100μg/mLAmp)，37℃ 220r/min振搖過夜；次日，以1％的濃度接種10mL LB液體培養基(含有100μg/mL Amp)，37℃ 220r/min振搖至OD600＝0.5時，加入終濃度為1mmol/L IPTG進行誘導表達，取誘導表達6h的菌液1mL，12000r/min離心2min，棄去上清液，細菌沉澱中加600μL裂解緩衝液，冰浴10min，然後超聲裂解細菌工作時間4s，間隔時間10s，功率400w，循環10次。結束後，4℃ 12,000r/m離心10min，收集上清和沉澱。上清液中加入150μL的5×SDS上樣緩衝液，100℃處理5min，用於SDS-PAGE電泳。沉澱加入750μL 1×SDS上樣緩衝液，100℃處理5分鐘，進行SDS-PAGE電泳，根據沉澱和上清液中各自的融合蛋白的量來判斷蛋白的可溶性。電泳方法同實施例4。電泳結果(圖12、13)表明，3B融合蛋白的分子量為42kD；用VL凝膠成像系統BioID++程序對電泳結果進行掃描分析，融合蛋白的表達量為50％。經蛋白可溶性分析可以看出，細菌裂解上清液中目標蛋白佔總蛋白量的48.2％，沉澱中目標蛋白佔總蛋白量的0％，初步估算細菌中目標蛋白的可溶性組分達100％。
將表達產物在5％濃縮膠濃度和12％分離膠中進行SDS-PAGE電泳。然後在「半乾式」電轉印儀上50mA穩流電轉移90min。電泳將要結束後，用鑷子夾取硝酸纖維素膜，轉移至5％脫脂奶粉/TBS溶液4℃封閉過夜。翌日，用TBS漂洗硝酸纖維素膜1遍，將硝酸纖維素膜裝入塑膠袋，加入5mL以1∶100稀釋於1％脫脂奶粉/PBS中的感染了FMDV活病毒的小鼠血清，封口，塑膠袋放在平緩搖動的搖床上，25℃溫育1h。剪開塑膠袋，廢棄液體，漂洗硝酸纖維素膜3次，每次10min。將硝酸纖維素膜裝入另一新塑膠袋，加入5mL以1∶1000稀釋於1％脫脂奶粉/PBS中的羊抗小鼠IgG(二抗)(華美公司)，排除氣泡密封袋口，25℃搖床搖動溫育1h。棄二抗，TBS洗滌硝酸纖維素膜3次，每次10min。把硝酸纖維素膜移至一平皿，加入底物液，觀察反應過程，待蛋白帶的顏色深度達到要求，立即用清水漂洗硝酸纖維素膜，然後將硝酸纖維素膜轉移至內裝適量PBS液的平皿中。在42kD位置可見一特異性條帶(圖13)。Western Blot結果表明表達產物都能與相應的抗體進行反應。
在層析柱中預先加入5-10mL PBS液，將純化樹脂50％Ni-NTA混勻，取出3mL緩慢逐滴加入，沉澱4～6h後，用5倍於純化柱體積的LysisBuffer平衡純化柱(流速≤1.5mL/min，純化過程的流速都如此)。待LysisBuffer即將全部進入純化樹脂之時，沿著管壁緩慢加入表達的細菌裂解上清，待上清完全進入柱床之後，用2倍於純化柱體積的Lysis Buffer過柱，收集樣品。用5倍於純化柱體積的Wash Buffer洗柱，備樣。最後用1mL Elution Buffer過柱4次，依次收集過柱液，同時備樣，將以上樣品進行SDS-PAGE分析。SDS-PAGE電泳圖上，純化的蛋白只有一條帶(圖14)。目的蛋白用凝膠成像系統BioID++程序對電泳結果進行掃描分析，純度達98％以上。純化蛋白的濃度為2.67mg/mL；誘導表達1L菌液，可獲得純化蛋白為66.7mg。
結果表明，3B基因插入到pMB表達質粒中，以融合蛋白的形式在大腸桿菌中獲得表達，表達量為細菌總蛋白的50％。3B基因在pMB中表達後，融合蛋白主要以可溶性形式存在。融合蛋白可溶性組分佔細菌裂解上清的46.2％，不溶組分佔細菌裂解沉澱的0％。重組蛋白的可溶性組分超過目標蛋白90％。
序列表SEQUENCE LISTING110華南農業大學120一種可溶性大腸桿菌表達質粒及其用途130
1606170PatentIn version 3.32101211378212DNA213Escherichia coli220
221CDS222(1)..(378)4001gtg atg acc atg tac gca acg ctt gaa gaa gcc att gac gct gca cgc 48Val Met Thr Met Tyr Ala Thr Leu Glu Glu Ala Ile Asp Ala Ala Arg1 5 10 15gaa gaa ttt ctt gca gac aac ccc ggc atc gac gcc gaa gat gcg aat 96Glu Glu Phe Leu Ala Asp Asn Pro Gly Ile Asp Ala Glu Asp Ala Asn20 25 30gtg caa cag ttc aat gcc caa aaa tac gtt ttg cag gac ggc gac atc 144Val Gln Gln Phe Asn Ala Gln Lys Tyr Val Leu Gln Asp Gly Asp Ile35 40 45atg tgg caa gtt gag ttt ttt gcc gac gaa ggg gaa gaa ggt gaa tgt 192Met Trp Gln Val Glu Phe Phe Ala Asp Glu Gly Glu Glu Gly Glu Cys50 55 60tta cct atg ctt agc ggt gaa gcc gcg caa agt gtt ttt gat ggc gac 240Leu Pro Met Leu Ser Gly Glu Ala Ala Gln Ser Val Phe Asp Gly Asp
65 70 75 80tat gat gag ata gag ata cgc cag gag tgg cag gaa gag aat aca tta 288Tyr Asp Glu Ile Glu Ile Arg Gln Glu Trp Gln Glu Glu Asn Thr Leu85 90 95cat gaa tgg gac gag ggg gaa ttt cag ctt gag cca ccg ctg gat acc 336His Glu Trp Asp Glu Gly Glu Phe Gln Leu Glu Pro Pro Leu Asp Thr100 105 110gag gaa gga cgc gca gca gct gat gag tgg gat gaa cgt taa 378Glu Glu Gly Arg Ala Ala Ala Asp Glu Trp Asp Glu Arg115 120 1252102211125212PRT213Escherichia coli4002Val Met Thr Met Tyr Ala Thr Leu Glu Glu Ala Ile Asp Ala Ala Arg1 5 10 15Glu Glu Phe Leu Ala Asp Asn Pro Gly Ile Asp Ala Glu Asp Ala Asn20 25 30Val Gln Gln Phe Asn Ala Gln Lys Tyr Val Leu Gln Asp Gly Asp Ile35 40 45Met Trp Gln Val Glu Phe Phe Ala Asp Glu Gly Glu Glu Gly Glu Cys50 55 60Leu Pro Met Leu Ser Gly Glu Ala Ala Gln Ser Val Phe Asp Gly Asp65 70 75 80Tyr Asp Glu Ile Glu Ile Arg Gln Glu Trp Gln Glu Glu Asn Thr Leu85 90 95
His Glu Trp Asp Glu Gly Glu Phe Gln Leu Glu Pro Pro Leu Asp Thr100 105 110Glu Glu Gly Arg Ala Ala Ala Asp Glu Trp Asp Glu Arg115 120 1252103211654212DNA213Avian influenza virus220
221CDS222(1)..(654)4003atg gat tcc aac act gtg tca agt ttc cag gta gac tgc ttt ctt tgg 48Met Asp Ser Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu Trp1 5 10 15cat gtc cgc aaa cga ttt gca gac caa gaa ctg ggt gat gcc cca ttt 96His Val Arg Lys Arg Phe Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala Pro Phe20 25 30cta gac cgg ctt cgc cga gat cag aag tcc cta aaa gga aga ggc agc 144Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Lys Gly Arg Gly Ser35 40 45act ctt ggt ctg gac atc aga acc gcc act cgt gaa gga aag cat ata 192Thr Leu Gly Leu Asp Ile Arg Thr Ala Thr Arg Glu Gly Lys His Ile50 55 60gtg gag cgg att ctg gag gaa gag tca gat gag gca ctt aaa atg act 240Val Glu Arg Ile Leu Glu Glu Glu Ser Asp Glu Ala Leu Lys Met Thr65 70 75 80act gct tca gtg cca gct cca cgc tac cta act gac atg act ctt gaa 288Thr Ala Ser Val Pro Ala Pro Arg Tyr Leu Thr Asp Met Thr Leu Glu85 90 95
gaa atg tca aaa gat tgg tta atg ctc att ccc aaa cag aaa gtg aca 336Glu Met Ser Lys Asp Trp Leu Met Leu Ile Pro Lys Gln Lys Val Thr100 105 110ggg tcc ctt tgc att aga atg gac caa gct ata gtg gat aaa aac atc 384Gly Ser Leu Cys Ile Arg Met Asp Gln Ala Ile Val Asp Lys Asn Ile115 120 125aca ttg aaa gca aac ttc agt gtg att ttt aat cga ctg gaa gct cta 432Thr Leu Lys Ala Asn Phe Ser Val Ile Phe Asn Arg Leu Glu Ala Leu130 135 140ata cta ctt aga gct ttt aca gac gaa gga aca ata gtg ggt gaa atc 480Ile Leu Leu Arg Ala Phe Thr Asp Glu Gly Thr Ile Val Gly Glu Ile145 150 155 160cat act gat gag gat gtc aaa aat tca cca tta cct tct ctt cca gga 528His Thr Asp Glu Asp Val Lys Asn Ser Pro Leu Pro Ser Leu Pro Gly165 170 175gca att ggg gtc ctc atc gga gga ttt gaa tgg aat gat aac aca gtt 576Ala Ile Gly Val Leu Ile Gly Gly Phe Glu Trp Asn Asp Asn Thr Val180 185 190cga gtc tct gaa act cta cag aga ttc gct tgg aga aac agc gat gag 624Arg Val Ser Glu Thr Leu Gln Arg Phe Ala Trp Arg Asn Ser Asp Glu195 200 205aat ggg aga cct cca ctc cct cca aag tag 654Asn Gly Arg Pro Pro Leu Pro Pro Lys210 2152104211217212PRT213Avian influenza virus4004Met Asp Ser Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu Trpl 5 10 15
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212PRT213Foot-and-mouth disease virus4006Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Leu Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys1 5 10 15Val Lys Pro Pro Gln Gln Glu Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Leu Glu Arg20 25 30Gln Lys Pro Leu Arg Val Arg Ala Pro Ala Pro Val Val Lys Glu Gly35 40 45Pro Tyr Glu Gly Pro Val Lys Lys Pro Ala Ala Leu Lys Val Lys Ala50 55 60Arg Asn Leu Ile Val Thr Glu65 70
權利要求
1.一種可溶性大腸桿菌重組質粒，其特徵在於它含有下列核苷酸序列a)SEQ ID NO1；或b)SEQ ID NO1中一個或幾個核苷酸殘基的替換、缺失、添加或插入形成的核苷酸序列。
2.如權利要求1所述的可溶性大腸桿菌重組質粒，其特徵在於它的表達產物的胺基酸序列為a)SEQ ID NO2；或b)SEQ ID NO2中一個或幾個胺基酸殘基的替換、缺失、添加或插入形成的胺基酸序列。
3.如權利要求1或2所述的可溶性大腸桿菌重組質粒在製備作為免疫原使用的蛋白質或多肽中的應用。
4.如權利要求1或2所述的可溶性大腸桿菌重組質粒在製備蛋白質類藥物中的應用。
5.如權利要求1或2所述的可溶性大腸桿菌重組質粒在製備用於檢測人或者動物血清中特異性抗體的蛋白質抗原中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種在大腸桿菌中以可溶性形式高效表達蛋白質/多肽的重組質粒及其應用。通過本發明提供的重組質粒在大腸桿菌中融合表達擬表達的蛋白質/多肽，融合蛋白/多肽的可溶性產物可以達到表達產物的90％以上。本發明還提供了該重組質粒在製備蛋白質/多肽藥物、診斷抗原、以及疫苗等方面的應用。
文檔編號A61K38/16GK1850977SQ20061007859
公開日2006年10月25日 申請日期2006年5月12日 優先權日2006年5月12日
發明者曹永長, 謝青梅, 李少璃, 陳麗, 覃健萍, 馬靜雲, 畢英佐 申請人:華南農業大學