一種質粒在大腸桿菌上進行轉化的方法
2023-06-09 02:17:36
一種質粒在大腸桿菌上進行轉化的方法
【專利摘要】本發明公開了一種質粒在大腸桿菌上進行轉化的方法。步驟如下：(1)挑取平板上活化的大腸桿菌DH5a接種於3mlLB培養液中，37°C振蕩培養過夜；(2)按1：150-200挑取過夜培養菌液接種於200mlLB培養液中，37°C振蕩培養2~2.5h(OD600約為0.4)；(3)培養物放入冰浴中冷卻lOmin。本發明的有益效果是，實驗簡單，費用較低，抗體的製備為將來檢測臨床器官和人工肝中的PERV的表達及傳播具有重要意義。
【專利說明】一種質粒在大腸桿菌上進行轉化的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種實驗方法，具體來說，一種質粒在大腸桿菌上進行轉化的方法。
【背景技術】
[0002]質粒是真核細胞細胞核外或原核生物擬核區外能夠進行自主複製的遺傳單位，包括真核生物的細胞器(主要指線粒體和葉綠體)中和細菌細胞擬核區以外的環狀脫氧核糖核酸(DNA)分子。現在習慣上用來專指細菌(大腸桿菌)、酵母菌和放線菌等生物中細胞核或擬核中的DNA以外的DNA分子。在基因工程中質粒常被用做基因的載體(Vector)。許多細菌除了擬核中的DNA外，還有大量很小的環狀DNA分子，這就是質粒(plasmid)(補充:部分質粒為RNA)。質粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四環素抗性基因或卡那黴素抗性基因等。有些質粒稱為附加體(episome)，這類質粒能夠整合進真菌的染色體，也能從整合位置上切離下來成為游離於染色體外的DNA分子。質粒在宿主細胞體內外都可複製，通過個些特性，人們可以把一些目的DNA片斷構建在質粒中，通過轉化入大腸桿菌中，不斷的複製，來得到目的產物。這就是轉化的目的。
【發明內容】
[0003]為克服上述技術問題，我們提出了以下技術方案:
一種質粒在大腸桿菌上進行轉化的方法，步驟如下:
(1)挑取平板上活化的大腸桿菌DH5a接種於3mlLB培養液中，37°C振蕩培養過夜；
(2)按1:150-200挑取過夜培 養菌液接種於200ml LB培養液中，37° C振蕩培養2~2.5h (0D600 約為 0.4)；
(3)培養物放入冰浴中冷卻IOmin；
(4)把每支離心管中菌體重新懸浮於IOml預冷(4°C)的lOOmmol/LCaCh溶液中，』冰浴中20min, 4° C SOOOrpm離心12min,收集菌體；
(5)把每支離心管中菌體懸浮於IOml預冷(4°C)的IOOmmoI/LCaCh溶液中；
(6)分裝在四支離心管中,4°C 3000rpm離心12min,收集菌體；
(7)再將每支離心管中菌體懸浮於2ml預冷的lOOmmol/LCaCb溶液分裝在1.5ml的離心管中；
(8 )取感受態細胞I ;;冰h解凍30iTiin、加入al pGEX-4T_l質粒載體；
(9)放入冰浴中30min，轉入42°C水浴90sec，再冰浴2min培養液，37° C振蕩培養
Ih;
(10)取己轉化的感受態細胞均勾鋪於含Amp的LB平板上，待平板中的液體吸收後，倒置平板，37° C恆溫培養過夜。
[0004]本發明的有益效果是，實驗簡單，費用較低，抗體的製備為將來檢測臨床器官和人工肝中的PERV的表達及傳播具有重要意義。【具體實施方式】
[0005]一種質粒在大腸桿菌上進行轉化的方法，步驟如下:
(1)挑取平板上活化的大腸桿菌DH5a接種於3mlLB培養液中，37°C振蕩培養過夜；
(2)按1:180挑取過夜培養菌液接種於200ml LB培養液中，37° C振蕩培養2h (0D600約為0.4)；
(3)培養物放入冰浴中冷卻IOmin；
(4)把每支離心管中菌體重新懸浮於IOml預冷(4°C)的lOOmmol/LCaCh溶液中，』冰浴中20min, 4° C SOOOrpm離心12min,收集菌體；
(5)把每支離心管中菌體懸浮於IOml預冷(4°C)的IOOmmoI/LCaCh溶液中；
(6)分裝在四支離心管中,4°C 3000rpm離心12min,收集菌體；
(7)再將每支離心管中菌體懸浮於2ml預冷的lOOmmol/LCaCb溶液分裝在1.5ml的離心管中；
(8 )取感受態細胞I ;;冰h解凍30iTiin、加入al pGEX-4T_l質粒載體；
(9)放入冰浴中30min，轉入42°C水浴90sec，再冰浴2min培養液，37° C振蕩培養
Ih;
(10)取己轉化的感受態細胞均勾鋪於含Amp的LB平板上，待平板中的液體吸收後，倒置平板，37° C恆溫培養過夜。
[0006]以上所述，僅為本發明較佳的【具體實施方式】，但本發明的保護範圍並不局限於此，任何熟悉本【技術領域】的技術人員在本發明披露的技術範圍內，根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.一種質粒在大腸桿菌上進行轉化的方法，其特徵在於，步驟如下:(1)挑取平板上活化的大腸桿菌DH5a接種於3mlLB培養液中，37°C振蕩培養過夜； (2)按1:150-200挑取過夜培養菌液接種於200ml LB培養液中，37° C振蕩培養2~2.5h (0D600 約為 0.4)； (3)培養物放入冰浴中冷卻IOmin； (4)把每支離心管中菌體重新懸浮於IOml預冷(4°C)的lOOmmol/LCaCh溶液中，』冰浴中20min, 4° C SOOOrpm離心12min,收集菌體； (5)把每支離心管中菌體懸浮於IOml預冷(4°C)的IOOmmoI/LCaCh溶液中； (6)分裝在四支離心管中,4°C 3000rpm離心12min,收集菌體； (7)再將每支離心管中菌體懸浮於2ml預冷的lOOmmol/LCaCb溶液分裝在1.5ml的離心管中； (8 )取感受態細 胞I ;;冰h解凍30iTiin、加入al pGEX-4T_l質粒載體；(9)放入冰浴中30min，轉入42°C水浴90sec，再冰浴2min培養液，37° C振蕩培養Ih; (10)取己轉化的感受態細胞均勾鋪於含Amp的LB平板上，待平板中的液體吸收後，倒置平板，37° C恆溫培養過夜。
【文檔編號】C12N1/21GK103614403SQ201310521935
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年10月30日 優先權日:2013年10月30日
【發明者】徐麗 申請人:徐麗