一對短肽、蛋白質和多核苷酸、其宿主細胞及其應用的製作方法
2023-06-09 07:29:46 1
專利名稱：一對短肽、蛋白質和多核苷酸、其宿主細胞及其應用的製作方法
—對短肽、蛋白質和多核苷酸、其宿主細胞及其應用技術領域
本專利涉及基因工程領域，具體地說涉及一種可以對人IL2RG基因高效打靶的轉錄激活子樣效應因子核酸酶(TALEN)的合成及打靶方法。
背景技術：
IL2RG，又稱白細胞介素_2受體亞基Y，是一種細胞因子受體的亞基，是至少6種白細胞介素受體複合物(IL-2，IL-4，IL-7，IL-9，IL-15和IL-21)的組成部分。IL2RG基因一般定位在哺乳動物的X染色體上。
IL2RG基因突變會引起X-連鎖嚴重的組合免疫缺陷病(X-SCID)。200多種不同IL2RG基因突變已確定存在於人X-連鎖嚴重組合免疫缺陷病(X-SCID)患者基因組中，這些突變大多涉及一個或幾個DNA鹼基的變化。IL2RG基因突變後，導致相關的白細胞介素受體失去功能，重要的信號分子無法傳遞，淋巴細胞不能正常發育，缺乏功能成熟的淋巴細胞，人的免疫能力將徹底喪失。IL-7和IL-15突變後，T細胞和NK細胞群也將無法正常發育成熟。患者如果沒有進行骨髓移植或病原體隔離將在出生數月內死亡。對患者的細胞進行定向的基因組靶向修飾，然後導入患者體內可以治療該疾病。
但人們一直沒有找到簡單高效的方法對基因組進行靶向修飾，傳統的基因打靶依賴於細胞內自然發生的同源染色體隨機交換的基因打靶技術，效率非常低，通常只有10_6-10_8，這種打靶方法只在小鼠中得到了廣泛應用。而在其他模式動物及大型哺乳動物中都因效率太低而得不到應用。
近年發展很快的序列特異的核酸酶可以用於精確的基因組靶向修飾。一般序列特異的核酸酶由一個DNA識別結構域和一個非特異性核酸內切酶結構域構成。原理是首先由DNA識別結構域把核酸酶定位到需要編輯的基因組區域，然後非特異性核酸內切酶切斷雙鏈DNA從而造成DNA雙鏈斷裂(double-strand break, DSB)，引入的DSB激活的DNA自我修復可以引起基因的突變和促進該位點DNA的同源重組。鋅指核酸酶(Zinc-fingernucleases, ZFN)是現在研究最清楚也是應用最廣泛的序列特異性核酸酶。其原理是兩個鋅指蛋白特異識別兩段相隔5-7bp的DNA序列並把與之融合表達的非特異性DNA切割蛋白Fokl的兩個亞基定位到一起，DNA切割蛋白形成雙聚體時可以切斷該位置的雙鏈DNA，從而造成DSB。ZFN的出現使得基因組靶向修飾向前邁進了一大步。然而ZFN技術還存在靶向不確定性，效率低，脫靶率高等問題，研究者自行設計出特異和高效的靶向基因組目的序列的鋅指核酸酶仍然是制約ZFN廣泛應用的瓶頸。
2009 年兩個研究組發現植物病原體Xanthomonas中的一種可以調節植物基因表達的轉錄激活子樣效應因子(transcription activator-like effector, TALE)表現出DNA結合特異性，而其識別密碼具有模塊化和簡單化的特點，為科學家們開發出更簡易的新型基因組靶向技術帶來了新希望。
TALE與Fokl融合後即形成轉錄激活子樣效應因子核酸(transcriptionactivator-like effector nucleases, TALEN)。TALEN 的打革E原理與 ZFN 相同，只是識別特異的DNA的蛋白質不同。TALEs由數十個特異性識別DNA的串聯「蛋白模塊」和兩側的N-末端及C-末端序列組成。每個「蛋白模塊」包含34個胺基酸，第12和13位殘基是靶向識別的關鍵位點，被稱為重複可變的d1-residUes(RVDs)位點。然而不同於每個鋅指蛋白識別特異性的三聯體鹼基，TALEs上的每個RVDs僅能識別一個鹼基。
Sangamo BioSciences公司和哈佛大學的兩個研究小組分別利用TALEs技術進行了基因組靶向修飾相關研究，兩篇論文發表在同一期的《自然生物技術》(NaturalBiotechnology)雜誌上。
Edward Rebar領導的研究小組將帶有不同C-末端TALE的截短片段連接到核酸酶Fokl的催化結構域上，當研究人員將構建的TALENs靶向內源性的人類NTF3和CCR5基因時，證實TALENs能夠特異性地對這些基因片段進行剪切。哈佛大學研究小組開發了一種基於分層連接的策略來構建12個重複模塊的TALEs。他們在保留RVDs的基礎上減少了每個模塊的DNA序列，同時將剩餘序列的重複性降到最低。進而通過12重PCR研究人員獲得了帶有特異性連接序列的單體，並將其克隆到包含TALE N-末端和C-末端序列的骨架載體中。為了構建TALE轉錄因子，研究人員又將TALE融合到一個轉錄因子的激活域。在接下來的靶向性檢測中，研究人員證實其能特異地使四個檢測內源基因中的兩個基因表達上調。
今年七月MIT的Rudolf Jaenisch小組也驗證了 TALEN在人胚胎幹細胞和人IPSC中的打靶效果。其通過在五個位點的TALENs與之前其在相同位置的ZFNs的打靶效果作對t匕，得出五組TALENs在打靶效率和精確度上都與從Sangamo BioSciences公司購買的ZFNs相似，進一步驗證了 TALENs是非常好的基因組編輯工具。
但是，目前尚無對人IL2RG基因進行打靶的報導，因此本領域迫切需要開展對人IL2RG基因進行高效打靶的研究。發明內容
本專利的目的之一是提供一種可以對人IL2RG基因高效打靶的轉錄激活子樣效應因子核酸酶(TALEN)的基因序列、融合蛋白及其重組質粒載體和宿主細胞等。
本發明的第一方面提供一對短肽，所述一對短肽序列為SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2。
本發明第二方面，提供一對多核苷酸，所述一對多核苷酸分別編碼上述一對短肽。
上述一對多核苷酸分別為SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45。
本發明的第三方面，提供一對蛋白質，所述一對蛋白質能特異性地識別二段核苷酸序列，所述二段核苷酸序列分別選自下述二個核苷酸序列:
(I)SEQ ID N0:10或SEQ ID NO: 10序列的一個或二個核苷酸經過取代所衍生的核苷酸序列；
(2) SEQ ID N0:13或SEQ ID NO: 13序列的一個或二個核苷酸經過取代所衍生的核苷酸序列。
上述一對蛋白質為上述的一對短肽二端分別加上轉錄激活子樣效應因子胺基酸序列框架的N端和C端。
上述轉錄激活子樣效應因子胺基酸序列框架的N端和C端為人工改造的序列或天然的序列。
上述一對蛋白質序列分別為SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
本發明第四方面，提供一對多核苷酸，所述一對多核苷酸分別編碼上述一對蛋白質。
上述一對多核苷酸序列為SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41。
本發明第五方面，提供一對融合蛋白，所述一對融合蛋白為上述一對蛋白質分別與DNA切割蛋白融合而成。
上述DNA切割蛋白為DNA內切酶。
上述一對融合蛋白為上述一對蛋白質分別與DNA切割蛋白的二個亞基融合而成。
上述DNA切割蛋白為天然的或經過人工改造的FoklDNA內切酶。
上述一對融合蛋白序列為SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49。
本發明的第六方面，提供一對多核苷酸，所述一對多核苷酸分別編碼上述的一對融合蛋白。
上述一對多核苷酸序列分別SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47。
本發明的第七方面，提供一種含有上述一對多核苷酸中的任意一條多核苷酸的載體。
本發明第八方面，提供一種上述載體轉化的宿主細胞。
上述宿主細胞為人離體細胞。在具體實施例中，上述宿主細胞為293T細胞。
本發明的第九方面，提供一種含有上述一對多核苷酸中的任意一對多核苷酸的載體。
本發明的第十方面，提供一種用上述含有一對多核苷酸的載體轉化的宿主細胞。
上述宿主細胞為人離體細胞。在具體實施例中，上述宿主細胞為293T細胞。
本發明的第十一方面，提供上述一對融合蛋白在製備治療人IL2RG基因突變所致的疾病的藥物中的應用。優選的，所述一對融合蛋白序列為SEQ ID N0:48和SEQ ID NO:49。
本發明的第十二方面，提供上述編碼融合蛋白的一對多核苷酸在製備治療人IL2RG基因突變所致的疾病的藥物中的應用。優選的，所述一對多核苷酸序列為SEQ ID NO:46 和 SEQ ID NO -Al0
本發明的第十三方面，提供一種人IL2RG基因打靶方法，所述基因打靶方法包括以下步驟:
I)將表達上述一對融合蛋白的任意一對多核苷酸或該對多核苷酸的質粒轉入人離體細胞；
2)人離體細胞在37°C下，培養3-7天，經PCR測序鑑定，靶位點發生突變的細胞即打靶細胞。
本發明的第十四方面，提供一種人IL2RG基因打靶方法，所述基因打靶方法包括以下步驟:
1)將表達上述一對融合蛋白的任意一對多核苷酸或含有該對多核苷酸的質粒轉入人離體細胞；
2)人離體細胞培養3-7天，其中至少一天在30°C下培養，其餘時間為37°C培養，經PCR測序鑑定，靶位點發生突變的細胞即打靶細胞。
本發明的第十五方面，提供一種人IL2RG基因打靶方法，所述基因打靶方法包括以下步驟:
I)將表達上述一對融合蛋白的任意一對多核苷酸或含有該對多核苷酸的質粒與抗puro的多核苷酸或其質粒共同轉入人離體細胞；
2)37°C下，puro培養基篩選出表達抗puro蛋白的人離體細胞；
3) 37°C下，人離體細胞培養3-7天，經PCR測序鑑定，靶位點發生突變的細胞即打靶細胞。
本發明的第十六方面，提供一種人IL2RG基因打靶方法，所述基因打靶方法包括以下步驟:
I)將表達上述一對融合蛋白的任意一對多核苷酸或含有該對多核苷酸的質粒與抗puro的多核苷酸或其質粒共同轉入人離體細胞；
2)37°C下，puro培養基篩選出表達抗puro蛋白的人離體細胞；
3)人離體細胞培養3-7天，其中至少一天在30°C下培養，其餘時間為37°C培養，經PCR測序鑑定，靶位點發生突變的細胞即打靶細胞。
優選的，上述四個基因打靶方法中，所述一對融合蛋白序列為SEQ ID N0:48和SEQID NO:49o
優選的，上述四個基因打靶方法中，所述一對多核苷酸序列為SEQ ID Ν0:46和SEQID NO:47ο
上述基因打靶方法中的篩選鑑定為，利用puro篩選出成功轉入目標多核苷酸或目標質粒的轉染細胞，非轉染細胞不能存活。PCR測序鑑定，IL2RG基因發生突變的細胞即為打靶細胞。
為實現上述目的，本研究經大量實驗，獲得一對轉錄激活子樣效應因子核酸酶:IL2RG-TALEN-L和IL2RG-TALEN-R，由兩個可以分別識別人IL2RG基因exon2上相鄰的二段核苷酸的DNA識別結構域分別與一個經人工改造的核酸內切酶Fokl的兩個異源亞基融合得到的融合蛋白。
根據本專利，所述的一對轉錄激活子樣效應因子核酸酶為IL2RG-TALEN-L和IL2RG-TALEN-R，其核苷酸分別具有SEQ ID NO:46和SEQ ID N0:47所示的序列。
根據本專利，所述的一對轉錄激活子樣效應因子核酸酶為IL2RG-TALEN-L和 IL2RG-TALEN-R,分別識別人 IL2RG 基因 exon2 上的 5』 tcagtgttttgtgtt 3，和5』 gctgttccaagtgcaat 3』 序列。
圖1:人工設計的轉錄激活子樣效應因子核酸酶(TALEN)識別的DNA序列及位點
圖2:18個識別模塊連接策略示意圖
A =PCR為每個識別模塊添加酶切識別序列及連接結頭過程示意圖
B.PCR為每個識別模塊添加酶切識別序列及連接結頭之後示意圖
C.PCR擴增6重複模塊與中間載體示意圖
D.最終構建的TALEN示意圖
圖3:中間載體 pCMV-NLS-TALE backbo ne-Fokl (R) -1ntermediate 的不意圖
圖4:最終載體 pEFla-NLS-TALE backbone-Fokl (R) -pA 的示意圖
圖 5:載體 pEFl-NLS-TALE backbone-Fokl (L) -1RES-PURO-pA 的示意圖
圖 6:最終的 TALEN 質粒 pEFla-NLS-TALE backbone N terminal-1L2RG_TALEN-Ll-TALE backbone C terminal-Fokl (L)-1RES-PURO-pA 的不意圖
圖7:T7Endonuclease I酶切變性雜交處理的打靶位點DNA PCR片段的電泳圖
圖8:IL2RG基因在打靶位點的基因型變化，-表示鹼基缺失，小寫字母cgag表示喊基插入具體實施方式
實施例1TALENs樽塊序列的設計
1.NCBI下載人IL2RG的基因組序列(編號NC_000023.10)，選擇exon2為打靶目標。
2.設計引物並PCR擴增基因組上打靶位點片段，並測序。
PCR引物及測序引物設計如表I
權利要求
1.一對短肽，其特徵在於，所述一對短肽序列為SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
2.—對多核苷酸,其特徵在於,所述一對多核苷酸分別編碼如權利要求1所述的一對短肽。
3.如權利要求2所述的一對多核苷酸，其特徵在於，所述一對多核苷酸為SEQID NO:44 和 SEQ ID NO:45。
4.一對蛋白質，其特徵在於，所述一對蛋白質能特異性地識別二段核苷酸序列，所述二段核苷酸序列分別選自下述二個核苷酸序列: (1)SEQID N0:10或SEQ ID NO: 10序列的一個或二個核苷酸經過取代所衍生的核苷酸序列；(2)SEQ ID NO:13或SEQ ID NO: 13序列的一個或二個核苷酸經過取代所衍生的核苷酸序列。
5.一對蛋白質，其特徵在於，所述一對蛋白質為權利要求1所述的一對短肽二端分別加上轉錄激活子樣效應因子胺基酸序列框架的N端和C端。
6.如權利要求5所述的一對蛋白質，其特徵在於，所述轉錄激活子樣效應因子胺基酸序列框架的N端和C端為人工改造的序列或天然的序列。
7.如權利要求5或6所述的一對蛋白質，其特徵在於，所述一對蛋白質序列分別為SEQID NO:3 和 SEQ ID NO:4。
8.—對多核苷酸,其特徵在於，所述一對多核苷酸分別編碼如權利要求5或6所述的一對蛋白質。
9.一對多核苷酸,其特徵在於,所述一對多核苷酸分別編碼如權利要求7所述的一對蛋白質。
10.如權利要求9所述一對多核苷酸,其特徵在於,所述一對多核苷酸序列為SEQIDNO:40 和 SEQ ID NO:41。
11.一對融合蛋白，其特徵在於，所述一對融合蛋白為權利要求5或6所述一對蛋白質分別與DNA切割蛋白融合而成。
12.如權利要求11所述一對融合蛋白，其特徵在於，所述DNA切割蛋白為DNA內切酶。
13.如權利要求11所述一對融合蛋白，其特徵在於，所述一對融合蛋白為權利要求5或6所述一對蛋白質分別與DNA切割蛋白的二個亞基融合而成。
14.如權利要求13所述一對融合蛋白，其特徵在於，所述DNA切割蛋白為天然的或經過人工改造的FoklDNA內切酶。
15.如權利要求11-14任一權利要求所述一對融合蛋白，其特徵在於,所述一對融合蛋白序列為 SEQ ID NO:48 和 SEQ ID NO:49。
16.—對多核苷酸,其特徵在於,所述一對多核苷酸分別編碼如權利要求12-14任一權利要求所述的一對融合蛋白。
17.—對多核苷酸,其特徵在於,所述一對多核苷酸分別編碼如權利要求15所述的一對融合蛋白。
18.如權利要求17所述一對多核苷酸,其特徵在於,所述一對多核苷酸序列為SEQIDNO:46 或 SEQ ID NO:47。
19.一種含有權利要求2_3、8_10、16-18任一權利要求所述一對多核苷酸中的任意一條多核苷酸的載體。
20.一種用權利要求19所述載體轉化的宿主細胞。
21.如權利要求20所述宿主細胞，其特徵在於，所述宿主細胞為人離體細胞。
22.如權利要求20所述宿主細胞，其特徵在於，所述宿主細胞為293T細胞。
23.—種含有權利要求2-3、8_10、17或18任一權利要求所述一對多核苷酸中的任意一對多核苷酸的載體。
24.一種用權利要求23所述載體轉化的宿主細胞。
25.如權利要求24所述宿主細胞，其特徵在於，所述宿主細胞為人離體細胞。
26.如權利要求24所述宿主細胞，其特徵在於，所述宿主細胞為293T細胞。
27.一種如權利要求15所述一對融合蛋白在製備治療人IL2RG基因突變所致的疾病的藥物中的應用。
28.一種權利要求18所述一對多核苷酸在製備治療人IL2RG基因突變所致的疾病的藥物中的應用。
29.—種人IL2RG基因打靶方法，其特徵在於，所述基因打靶方法包括以下步驟: 1)將權利要求17或18所述一對多核苷酸或含有權利要求17或18所述一對多核苷酸的質粒轉入人離體細胞； 2)人離體細胞在37°C下，培養3-7天，經PCR測序鑑定，靶位點發生突變的細胞即打靶細胞。
30.一種人IL2RG基因打靶方法，其特徵在於，所述基因打靶方法包括以下步驟: 1)將權利要求17或18所述一對多核苷酸或含有權利要求17或18所述一對多核苷酸的質粒轉入人離體細胞； 2)人離體細胞培養3-7 天，其中至少一天在30°C下培養，其餘時間為37°C培養，經PCR測序鑑定，靶位點發生突變的細胞即打靶細胞。
31.一種人IL2RG基因打靶方法，其特徵在於，所述基因打靶方法包括以下步驟: 1)將權利要求17或18所述一對多核苷酸或含有權利要求17或18所述一對多核苷酸的質粒與抗puro的多核苷酸或其質粒共同轉入人離體細胞； 2)37°C下，puro培養基篩選出表達抗puro蛋白的人離體細胞；3)37°C下，人離體細胞培養3-7天，經PCR測序鑑定，靶位點發生突變的細胞即打靶細胞。
32.—種人IL2RG基因打靶方法，其特徵在於，所述基因打靶方法包括以下步驟: 1)將權利要求17或18所述一對多核苷酸或含有權利要求17或18所述一對多核苷酸的質粒與抗puro的多核苷酸或其質粒共同轉入人離體細胞； 2)37°C下，puro培養基篩選出表達抗puro蛋白的人離體細胞； 3)人離體細胞培養3-7天，其中至少一天在30°C下培養，其餘時間為37°C培養，經PCR測序鑑定，靶位點發生突變的細胞即打靶細胞。
全文摘要
本發明提供了一對短肽、蛋白質和多核苷酸、其宿主細胞及其應用，提出了一種可以對人細胞內源的IL2RG基因高效打靶的轉錄激活子樣效應因子核酸酶(TALEN)基因的人工合成方法，以及用含有該基因的重組質粒進行定向打靶的方法。所述的轉錄激活子樣效應因子核酸酶含有一對轉錄激活子樣效應因子(TALEs)蛋白及分別與其融合的DNA內切酶的催化亞基，可以分別識別人IL2RG基因exon 2上的兩個相鄰位點。在對TALEs的胺基酸序列進行設計的基礎上，合成了編碼該TALEN的核苷酸序列及構建了包含該核苷酸序列的載體，通過用TALENs質粒轉染細胞，可以大大地提高細胞打靶的效率。
文檔編號C12N9/22GK103184202SQ20111044608
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月28日 優先權日2011年12月28日
發明者肖磊, 趙金龍 申請人:浙江大學