檢測活組織中幽門螺桿菌的組合物、試劑盒和方法
2023-06-08 19:19:21
專利名稱：檢測活組織中幽門螺桿菌的組合物、試劑盒和方法
背景技術：
(a)發明領域本發明涉及引起腸胃失調的細菌源幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)(下面稱之為H.pylori)的檢測，特別涉及一種將銨離子定量測定的酚鹽方法用於常規脲酶的酶試驗而產生的檢測幽門螺桿菌用的組合物，和涉及使用該組合物的檢測試劑盒和方法。
(b)相關技術的描述幽門螺桿菌是已知的一種引起包括胃癌和胃十二指腸潰瘍的腸胃失調的細菌源，WHO已將幽門螺桿菌定為典型的致癌原。幽門螺桿菌的精確診斷，即準確檢測，應當有助於治癒這種幽門螺桿菌引起的腸胃失調。迄今為止所使用的幽門螺桿菌檢測方法可以主要分為兩種類型，即不使用內窺鏡的非侵襲性測試和使用內窺鏡得到檢測用活檢組織的侵襲性測試。
非侵襲性測試包括血清學測試和13C或14C呼吸測試。測定幽門螺桿菌抗體的血清學測試的問題在於抗體的存在不一定就表示疾病的發展，因為疾病治癒後抗體水平的降低要6個月以上。13C或14C呼吸測試應用的原理是當攝食由13C或14C標記的脲時，如果幽門螺桿菌存在的話，則其轉化為胃中標記的CO2，並且在呼出的空氣中檢測到。但是，該方法不經常使用，因為其涉及昂貴的儀器。
另一方面，比較通常使用的是侵襲性測試來檢測幽門螺桿菌。使用內窺鏡內窺期間採集的活檢組織樣品的侵襲性測試的檢測方法包括組織學方法、PCR(聚合酶鏈反應)方法、培養法和脲酶測試。組織學是通過一般的組織檢測證實幽門螺桿菌存在的方法；PCR方法是通過使用聚合酶鏈反應證實幽門螺桿菌存在的方法；培養法是直接培養來自活檢組織的幽門螺桿菌的方法。但是，問題在於所有這些方法都較困難而且耗費大量時間，所以不能商業化應用。
脲酶的酶測試是容易在內窺鏡室中使用的而且是最有效的方法，這是因為幽門螺桿菌產生的脲酶與其它微生物相比具有高得多的活性。也就是說，如果脲酶存在，則檢測試劑盒中加入的脲被分解，並且產生的氨引起pH增加，使pH指示劑反應和變色。幽門螺桿菌檢測方法就是測定脲酶的這一活性大小。目前使用脲酶酶測試的商售試劑盒是「CLOtest」(USPNo.4748113)，「Hpfast」(USP No.5439801)，和「Pyloritek」(USP No.5314804和5420016)。「CLOtest」中使用的組合物含有10-40g/l脲、1-5g/l殺細菌劑、有效量的pKa6.5-8.5指示劑(酚紅)和餘量的是水，pH為5.0-6.5。但是CLOtest的問題在於因為上述組合物和幽門螺桿菌產生的脲酶的反應速度慢，所以陽性比例隨著各個讀數者變化。因此，只有在大約24小時之後才可能診斷，並且在內窺鏡檢查日不能得到診斷結果，這很不方便，需要患者再次到醫院。此外，多於24個小時之後，出現各種顏色使得精確診斷困難。Hpfast在原理上類似於CLOtest，但是不同之處在於加入了細胞壁去汙劑並且用酚紅、甲基紅、和溴麝香草酚藍的混合物作為指示劑。使用Hpfast，從pH6.2的深綠色測得幽門螺桿菌陽性和pH6.0的淺綠色測得幽門螺桿菌陰性。但是，深綠色和淺綠色的精確讀數困難。Pyloritek使用了多層試驗裝置，不同於上面提到的CLOtest和Hpfast，其主要特徵在於脲酶進行反應的部分和反應產物作為氨檢測的部分是在不同的層上，並且各層的pH是不同的。儘管Pyloritek可以在一個小時內產生診斷結果，但是如果測定時間超過一小時，則假陽性比例增大。因此，如果在內窺鏡檢查期間不遵守精確的時間，則假陽性的可能性增加。
此外，上面提到的包括CLOtest和Pyloritek等的脲酶酶方法還能與例如人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)、唾液球鏈菌(Streptococcus salivarius)、產氣假桿菌(E.aerofacienes)、發酵乳細菌(L.fermentum)等這些桿菌所具有的少量低活性的脲酶發生反應，並且在長的鑑定時間情況下假陽性比例會增大。
發明概述本發明的目的是要解決上面提到的常規技術中的問題，通過提供幽門螺桿菌檢測組合物、幽門螺桿菌試劑盒、和使用上述組合物快速和精確測定是否存在引起腸胃失調細菌源的幽門螺桿菌感染的方法。本發明還提供在一定時間過後的相同試驗結果，並且其可以容易地在內窺鏡室中使用。
為了實現上述本發明目的，本發明首先提供檢測幽門螺桿菌的檢測組合物，該組合物含有0.5-4vol％脲、0.05-0.2vol％KH2PO4、0.8-1.7vol％酚鹽試劑溶液、0.002-0.005vol％具有pKa值是6.5-8.5的指示劑和平衡量的水。在上述的組成中，所述0.8-1.7vol％酚鹽試劑溶液優選的組成為0.5-1vol％硫酸錳溶液、0.2-0.5vol％次氯酸鹽試劑和0.1-0.2vol％酚鹽試劑，並且上述指示劑優選是酚紅。此外，所述組合物更優選含有0.5-2vol％膠凝劑。特別是所述組合物最優選含有2vol％脲、0.05vol％KH2PO4、1vol％硫酸錳溶液、0.5vol％次氯酸鹽試劑、0.2vol％酚鹽試劑、0.0025vol％酚紅、1vol％瓊脂和平衡量的水。並且所述組合物的pH優選為6.0-7.8。
其次，本發明得到了上述組合物並且提供了一種檢測幽門螺桿菌的試劑盒，該試劑盒包括活檢組織取樣試驗裝置、向所述成分中進一步加入10-20μl0.1N氫氧化鈉溶液而產生的陽性對照、和由不放活檢組織的成分製得的陰性對照。
第三，本發明提供一種從活檢組織中檢測幽門螺桿菌的方法，其檢測步驟包括用所述組合物等活檢組織反應，和觀察所述組合物的顏色變化。
附圖的簡要說明插入說明書並且構成說明書的一部分的這些附圖詳細說明了本發明的實施方案，並且與說明書一起來解釋本發明的原理
圖1是本發明的檢測試劑盒的透視圖；圖2是本發明的檢測試劑盒的截面圖；和圖3是說明本發明的檢測試劑盒的應用例的附圖。
優選實施方案的詳細描述在下面的詳細描述中，通過簡要說明本發明的發明人所設計的最佳方式只是表明和描述了本發明的優選實施方案。人們將會理解，本發明能作各種明顯相關的改變，而所有的各種改變均不能脫離本發明的範圍。因此，該附圖和說明書被認為是舉例說明發明的實質而不是限制。
下面，解釋本發明的更詳細的細節在檢測幽門螺桿菌中，發明人試圖顯著地降低由讀數的主觀性所造成的假陽性比例，為此將脲酶測試從傳統所用的方法改變為使用一種快速變化顏色的組合物，通過該測試結果同時進行陽性對照和陰性對照的比較就能迅速做出準確的測定。也就是說，因為使用脲酶測試的試劑盒檢測由OH-離子引起的pH增加(該OH-是由水和簡單分解脲而生成氨的反應所產生的)，為了提高pH變化的速度，發明人試圖減少銨離子本身。為此，發明人使用了在銨離子定量測定中所使用的酚鹽方法(「水和廢水的檢測的標準方法」(Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater)第9版，1995，American Public Health Association，pp.4-80--4-82)。
通過脲酶的脲分解過程如下面的反應式表示[反應式1]
(脲)
總反應本發明的這些成分由於上述脲分解過程的產物(即銨離子)轉化為靛酚藍使脲繼續分解，因此能很快提高pH。為了實現上述目的而使用的酚鹽方法是測定水溶液中氨濃度的非常有效的方法。酚鹽方法使用的原理是在錳催化劑存在下氨與次氯酸鹽鹼反應，使酚變為靛酚藍，這可以由如下反應式描述[反應式2]
即，為了快速提高pH，在常規脲酶酶測試所使用的成分中加入酚鹽試劑溶液，並且通過上述脲酶將脲分解過程中產生的銨離子轉化為靛酚藍，從而本發明中這些成分能使反應速度提高得更快。
另外，成分中有NaOCl，其起著降低假陽性的作用，這是由於來自桿菌的脲酶提高濃度之後而引起的，因為其對弱的脲酶活性具有抑制作用。這也使測定結果在較長測定時間之後獲得。
在本發明中，酚鹽試劑溶液的加入量被調節在一定範圍內，使得幽門螺桿菌脲酶活性不受到抑制並且pH指示劑的顏色變化不受影響。本發明成分和各成分可能的含量範圍如下0.5-4vol％脲，0.05-0.2vol％KH2PO4，0.8-1.7vol％酚鹽試劑溶液，0.002-0.005vol％pKa值為6.5-8.5的指示劑和平衡量的水。
上述組合物中，脲起著幽門螺桿菌產生的脲酶底物的作用，對於測定幽門螺桿菌產生的脲酶的活性，大約0.5-4vol％含量是合適的水平。起著緩衝液作用的KH2PO4含量應當是0.05-0.2vol％，即在低於0.05vol％時不能獲得所需pH範圍，並且在高於0.2vol％下有抑制pH變化的趨勢。起著將銨離子轉化為靛酚藍並且抑制其它微生物的脲酶活性作用的酚鹽試劑溶液含量應當是0.8-1.7vol％，即在低於0.8vol％下不足以起到減少銨離子而提高pH變化速度的作用和對其它微生物的脲酶活性的抑制作用，但高於1.7vol％時，pH提高得太高，並且其它微生物以及幽門螺桿菌的脲酶活性有被抑制的趨勢。pKa值是6.5-8.5的指示劑起著對pH變化敏感的作用，在本發明中酚紅是最合適的，對於精確測定，優選在0.002-0.005vol％之間。酚紅具有在酸性溶液中表現出黃色和在鹼性溶液中為紫紅色的特徵。
上述酚鹽試劑溶液含有用作催化劑的硫酸錳溶液、用作與銨離子反應的反應物次氯酸鹽試劑和酚鹽試劑，其所需的具體組成為1vol％硫酸錳溶液，0.5vol％次氯酸鹽試劑和0.2vol％酚鹽試劑。此外，該組成中進一步需要含有0.5-2vol％膠凝劑，例如瓊脂，因為這樣其可以軟凝膠形式方便地使用。優選將成分pH控制在6.0-7.8範圍內，因為在該範圍內有助於精確測定。
本發明組合物的具體組成和含量範圍如下2vol％脲，0.05vol％KH2PO4，1vol％硫酸錳溶液，0.5vol％次氯酸鹽試劑，0.2vol％酚鹽試劑，0.0025vol％酚紅，1vol％瓊脂和平衡量的水。
另一方面，本發明中使用的酚鹽試劑溶液的貯存溶液所需的成分和含量如下硫酸錳溶液；0.05vol％MnSO4.H2O，和平衡量的蒸餾水，次氯酸鹽試劑；1vol％NaOCl，和平衡量的水，酚鹽試劑；2.5vol％NaOH，8vol％苯酚，和平衡量的蒸餾水。
本發明將內窺鏡獲得的活檢組織放置在由上述成分製備的凝膠上並觀察顏色變化。由上述成分製備凝膠，並且通過向上述成分加入少量的可以表現出陽性結果的NaOH(即10-20μl 0.1N NaOH溶液)來製備陽性對照凝膠。通過比較其中根本沒有加入NaOH的陰性對照凝膠的顏色可以測定是否存在幽門螺桿菌感染。因此，帶有陽性和陰性對照一起放置，用指示陽性或陰性的顏色來觀察結果並進行比較，該測定裝置能減少由於讀數者主觀性所帶來的錯誤測定結果。
本發明的檢測試劑盒的透視圖在圖1中表示，側面圖在圖2中表示。根據本發明的測定試劑盒的應用實施例也在圖3中表示。參照上述圖1-3，1是蓋，2是容器，最好用丙烯酸材料製備的透明容器，3是本發明的檢測組合物，4是測試裝置，5是活組織檢查樣品區域，該區域需要進行不透光處理，使得從側面看不到活檢樣品，6是陰性對照，7是陽性對照和8是活檢樣品。
以下描述了本發明所要求的實施例和對照例。但是，下面描述的實施例只是本發明許多實施例中的一部分，本發明並不限制於下面描述的實施例。製備幽門螺桿菌檢測組合物首先製備下面描述的貯備溶液的組合物20vol％脲，2vol％KH2PO4，0.01vol％酚紅，和2vol％瓊脂。
在向50mg MnSO4.H2O加蒸餾水製備100ml硫酸錳溶液的同時，通過向10ml 10％NaOCl加蒸餾水製備100ml次氯酸鹽試劑，並且用濃的次氯酸將pH調節到6.8。向2.5gNaOH和8ml苯酚加入蒸餾水製備100ml酚鹽試劑。上述瓊脂溶液高壓滅菌處理(121℃，1.5大氣壓)15分鐘後，將其單獨置放，直到在55℃水罐中使用，製備下述2×試劑。
將上述10ml脲貯備溶液，2.5ml KH2PO4貯備溶液，25ml酚紅貯備溶液，1ml硫酸錳溶液，0.5ml次氯酸鹽試劑和0.2ml酚鹽試劑並加入蒸餾水製備50ml混合物。通過0.2μm過濾器過濾上述製備的2×試劑的桿菌後，混合相同量2％瓊脂溶液。其結果是，各成分的終濃度如下(此時最終pH是7.5)2％脲，0.05％KH2PO4，0.0005％硫酸錳，0.005％NaOCl，0.2％酚鹽試劑(0.005％NaOH，0.016％苯酚)，0.0025％酚紅和1％瓊脂。製備幽門螺桿菌檢測試劑盒將自實施例1製備的組合物注射到裝有從內窺鏡獲得的活檢組織測定裝置多孔板的一個孔中，向另一個孔注入製備的組合物並向上述組合物進一步加入10μl 0.1N NaOH而製備陽性對照，將上述組合物注射到另一個孔中而製備陰性對照，從而製備幽門螺桿菌檢測試劑盒。上述檢測試劑盒稱之為「PET(Pylori Easy Test)試劑盒」。獲得患者活檢組織後，同時在該活檢組織上使用CLOtest和實施例2的PET，並且比較每小時的陽性比例，結果描述於下面的表1。每小時陽性比例
※7讀數難以測定。
結果，PET可確定在一個小時內總陽性76.9％和3小時之後100％。另一方面，CLOtest只證實陽性的17.6-30％和只有在24小時之後為100％。但是，24小時之後出現不能被明確區分的難以辨別的顏色，並且根據觀察者的不同陽性比例從38.4％(10/26)至65.3％(17/26)變化。因此可見在本發明使用PET的情況下快速測定是可能的。
此後，我們觀察了PET結果與PCR方法的一致性程度。這裡，PCR方法使用了26kDa蛋白質基因的擴增方法，這已知是幽門螺桿菌測定中最獨特和敏感的方法(Ho，S.等，1991，用於人和動物中幽門螺桿菌測定的直接聚合酶鏈反應(Direct Polymerase Chain Reaction Test for detection ofH.Pyori in Human and Animal)，臨床微生物學雜誌(J.Clin.Microbiol)，29pp2543-2549)。結果在下面的表2中描述與PCR方法一致性比
面的表2中看出，使用發明PET時，所有26份活檢組織與PCR方法的結果相一致，並且一致性比例範圍對於CLOtest是61.5-80.7％之間。因此，我們可以看到，判斷本發明PET比CLOtest更精確是可能的。內窺鏡檢查獲得的活檢組織在-20℃冷凍1星期，然後根據試驗例1中相同的方法進行PET和CLOtest的試驗，比較結果在表3和表4中表示。每小時的陽性比例
表4]與PCR的一致性
桿菌的脲酶活性降低到一定程度的活檢組織的精確測定是可能的，這一點是值得注意的。
本發明提供能快速精確地測定出是否存在幽門螺桿菌(引起腸胃失調的細菌源)感染的幽門螺桿菌檢測組合物，即使在時間已過去之後仍然可以獲得相同的結果，並且該組合物容易在內窺鏡室中使用。本發明提供幽門螺桿菌檢測試劑盒和使用幽門螺桿菌檢測組合物的方法。為了檢查PET的幽門螺桿菌特性，對內窺鏡檢查獲得的活檢組織中分離的幽門螺桿菌桿菌和人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)桿菌檢查了脲酶分解能力。
檢查方法包括首先培養幽門螺桿菌桿菌和人葡萄球菌桿菌，並且在滅菌蒸餾水中稀釋，這樣得到合適數目的桿菌，然後根據試驗例1中描述的相同的方法進行PET和CLOtest，並且比較。結果在表5中描述。幽門螺桿菌桿菌和人葡萄球菌桿菌的特性比較
從上述表5中注意到，如果使用本發明的PET，則能檢測出明顯不同的特性，即幽門螺桿菌的脲酶活性表現出快速反應和其它桿菌的脲酶活性表現出慢的反應。
以上已經詳細描述了本發明優選的實施方案，但應該清楚地理解，這裡所指出的對於本領域技術人員是很清楚的基本發明概念的很多變化和/或修改將落在權利要求書中所定義的本發明的構思和範圍內。
權利要求
1.用於檢測幽門螺桿菌的組合物，包括a)0.5-4vol％脲，b)0.05-0.2vol％KH2PO4，c)0.8-1.7vol％酚鹽試劑溶液，d)0.002-0.005vol％具有pKa值為6.5-8.5的指示劑，和e)平衡量的水。
2.權利要求1的組合物，其中所述檢測幽門螺桿菌的組合物中的0.8-1.7vol％酚鹽試劑溶液包括a)0.5-1vol％硫酸錳溶液，b)0.2-0.5vol％次氯酸鹽試劑，和c)0.1-0.2vol％酚鹽試劑。
3.權利要求1的組合物，其中所述組合物是檢測幽門螺桿菌的組合物，其中指示劑是酚紅。
4.權利要求1的組合物，其中所述組合物是進一步含有0.5-2vol％膠凝劑的檢測幽門螺桿菌的組合物。
5.權利要求4的組合物，其中所述組合物是檢測幽門螺桿菌的組合物，包括；a)2vol％脲，b)0.05vol％KH2PO4，c)1vol％硫酸錳溶液，d)0.5vol％次氯酸鹽試劑，e)0.2vol％酚鹽試劑溶，f)0.0025vol％酚紅，g)1vol％瓊脂，和h)平衡量的水。
6.權利要求1的組合物，其中所述組合物是pH為6.0-7.8的幽門螺桿菌檢測組合物。
7.檢測幽門螺桿菌的試劑盒，包括a)由放置活檢組織的權利要求4的組合物製成的測定裝置；b)在權利要求4的組合物中進一步加入10-20μl0.1N NaOH溶液而製得的陽性對照；和c)由沒有放置活檢組織的權利要求4的組合物製得的陰性對照。
8.檢測活檢組織中幽門螺桿菌的方法，包括下面的步驟a)使活檢組織與權利要求1的所述組合物反應；和b)觀察與組合物反應的所述活檢組織的顏色變化。
全文摘要
本發明公開了用於檢測幽門螺桿菌的組合物,包括0.5—4vol%脲、0.05—0.2vol%KH
文檔編號C12Q1/10GK1266461SQ99800633
公開日2000年9月13日 申請日期1999年4月2日 優先權日1998年4月3日
發明者李鍾和, 李學成, 盧姙奐, 金晸澤, 河泳七, 崔泰富 申請人:李鍾和, 李學成, 盧姙奐, 金晸澤, 河泳七, 崔泰富