一種定點突變改造的三磷酸胞苷合成酶的製作方法
2023-06-09 09:38:16
一種定點突變改造的三磷酸胞苷合成酶的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種定點突變改造的三磷酸胞苷合成酶，其胺基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。它是由胺基酸序列為SEQ?ID?NO：3所示的來源於穀氨酸棒桿菌ATCC13032的三磷酸胞苷合成酶進行定點突變改造得到，其第160位胺基酸由天冬氨酸突變成了穀氨酸，第162位胺基酸由穀氨酸突變成了丙氨酸，第168位胺基酸由穀氨酸突變成了賴氨酸。本發明所述的基因工程CTP合成酶大大降低了產物CTP對該酶的抑制，而且催化活力更加優良，為實現大規模生產CTP奠定了基礎。
【專利說明】一種定點突變改造的三磷酸胞苷合成酶
【技術領域】
[0001]本發明屬於基因工程【技術領域】，涉及一種定點突變方法製備具有耐受高濃度三磷酸胞苷(CTP)的三磷酸胞苷合成酶(CTP合成酶，簡稱CTPS)。
【背景技術】:
[0002]胞嘧啶核苷三磷酸(CTP)是一種高能磷酸化合物，是嘧啶合成途徑中非常重要的終產物。其參與機體細胞膜磷脂，卵磷脂等重要磷脂類化合物的合成代謝，也是合成DNA，RNA等重要物質前體。胞嘧啶核苷三磷酸合成酶(CTPs)在激活劑ATP，GTP，，Mg+及氨
基供體(穀氨醯胺或者氨)等存在下，能以UTP為底物，生成CTP.反應方程式如下:
【權利要求】
1.一種定點突變改造的三磷酸胞苷合成酶，其胺基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2.根據權利要求1所述的定點突變改造的三磷酸胞苷合成酶，其特徵在於，它是由胺基酸序列為SEQ ID N0:4所示的來源於穀氨酸棒桿菌ATCC13032的三磷酸胞苷合成酶進行定點突變改造得到，其第160位胺基酸由天冬氨酸突變成了穀氨酸，第162位胺基酸由穀氨酸突變成了丙氨酸，第168位胺基酸由穀氨酸突變成了賴氨酸。
3.編碼權利要求1所述的定點突變改造的三磷酸胞苷合成酶的基因，其特徵在於其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
4.一種重組質粒，其包含了權利要求3所述的核苷酸序列。
5.一種重組細胞，其包含了權利要求4所述的重組質粒。
6.權利要求1所述的定點突變改造的三磷酸胞苷合成酶在合成三磷酸胞苷中的應用。
7.根據權利要求6所述的應用，其特徵在於，用二甲苯處理過的菌體細胞I~2g加到10~15ml全細胞催化反應液中，全細胞催化反應液初始組分如下:以pH7.0~8.01 OOmmol/L Tris-HCl 緩衝液為溶劑，添加 15 ~30mmol/L 穀氨醯胺、20 ~50mmol/L ATP、20 ~50mmo/L MgSO4UO ~20mmol/L UTP，0.15 ~0.3mmol/L GTP。
8.根據權利要求7所述的應用，其特徵在於，二甲苯的使用重量為菌體細胞重量的I~3%。
【文檔編號】C12N15/70GK103540570SQ201310528691
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年10月30日 優先權日:2013年10月30日
【發明者】應漢傑, 朱夢珠, 謝婧婧, 孫梧進, 王豔, 郭亭, 朱晨傑, 陳勇, 陳曉春, 吳菁嵐 申請人:南京工業大學