一種多噬伯克霍爾德氏菌及其在促進松樹生長中的應用的製作方法

2023-06-08 15:37:26 7

專利名稱：一種多噬伯克霍爾德氏菌及其在促進松樹生長中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於微生物技術領域，具體涉及一種松樹根際高效解磷細菌多噬伯克霍爾德氏菌及其在促進松樹生長中的應用。
背景技術：
磷素是植物營養三大要素之一，是植物體內核酸及多種酶、輔酶等的重要組成成分，同時又以多種方式參與植物體內的各種生理生化過程，對促進植物的生長發育和新陳代謝起著重要作用，缺磷會導致植物生長發育停滯，根系發育不良，植物矮小，生物量嚴重下降。因此，磷元素是植物必不可缺的營養元素。土壤中含有大量儲備磷，可分為無機態磷和有機態磷，但主要以非溶態存在。土壤中的磷主要通過吸附、沉澱、生物固持三種方式固定，土壤中95%以上的磷素與土壤中 Ca2+、Fe2+、Fe3+、Al3+等金屬離子結合而喪失其有效性。施入土壤中的磷肥大部分會發生專性吸附和化學沉澱被固定，以植物難以吸收利用的難溶性的磷酸鹽形式在土壤中積累起來， 利用率很低；而且大量施用磷肥既耗竭有限的磷礦資源又加劇環境的富營養化。因此，通過生物技術途徑來解決這一問題越來越受到人們的重視。解磷細菌(Phosphobacteria)是土壤磷循環中的主要微生物類群,其對改善植物磷素吸收和生長具有重要作用。解磷細菌能夠促進植物對各種營養元素的吸收，促進植株根系的生長，提高植物對磷的利用率，改善植物的營養條件，提高植株的產量，增加植株抗病能力，另外還可以改善土壤結構，提高有機質含量，改良鹽鹼地對培育和充分發揮土壤生態肥力、保持農林業生態環境的平衡等均具有極其重要的作用。松樹分布很廣，是我國山地、荒漠造林、溝壑治理，庭園綠化的主要造林樹種之一， 具有巨大的生態和經濟價值。但松樹一般種植在貧瘠的土壤中，人工育苗成活率不高，生長緩慢，生物量低。其中，磷素供應不足是突出而具普遍性的問題，造成了我國大部分地區的松樹生長不良，抗逆性下降。松樹根際高效解磷細菌能夠提高土壤中難溶性磷的植物有效性和磷肥利用率，改善松樹人工林生產中的磷素供應不足的矛盾、促進松樹的生長發育。目前，有關松樹根際高效解磷細菌的篩選及應用研究鮮見報導。

發明內容
發明目的針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種用於松樹根際高效溶解難溶性無機磷及有機磷的多噬伯克霍爾德氏菌。本發明的另一目的是提供上述多噬伯克霍爾德氏菌在促進松樹生長中用途。技術方案為了實現上述發明目的，本發明採用的技術方案為一種多噬伯克霍爾德氏菌，其分類命名為多噬伯克霍爾德氏菌(Burkholderia multivorans) WS-FJ9，已保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號是CCTCCN0 M2011435，保藏日期2011年12月I日。上述多噬伯克霍爾德氏菌WS-FJ9的基因型為基因型II。
多噬伯克霍爾德氏菌WS-FJ9，從福建省沙縣官莊林場28年生溼地松純林根際土壤中篩選獲得，主要生物學特徵包括在牛肉膏蛋白腖培養基平板上，菌落較小，顏色黃白， 圓形、邊緣整齊；菌體短杆狀，革蘭氏染色陰性，無芽孢，好氧，氧化酶反應陰性，接觸酶試驗陽性，澱粉水解試驗陰性，M.R.試驗陰性，V. P.試驗陽性，明膠水解試驗陰性，硝酸還原試驗陽性，產氨試驗陽性，硫化氫試驗陰性，檸檬酸鹽生長試驗陽性。採用接種洋蔥、菸草(用於判斷菌株對植物的致病性)以及接種苜蓿(用於判斷菌株對動物的致病性)等方法對屬於Bcc基因型II的多噬伯克霍爾德氏菌(Burkholderia multivorans) WS-FJ9菌株進行安全性測定，結果表明該菌株對洋蔥和苜蓿沒有致病性，對菸草有微弱毒性，但無致病性。WS-FJ9菌株的16SrDNA基因序列，見胺基酸或核苷酸序列表I。將所測16SrDNA 序列與GenBank資料庫中的序列進行BLAST比對。結果表明，WS-FJ9菌株與伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)同源性都很高,其中與Burkholderia multivorans的相似度為98%。 通過利用Biolog系統自動分析鑑定，與Burkholderia multivorans的Biolog相似性PROB 99%，相似值SMO. 551，結合形態、生理生化特徵及16SrDNA序列分析，鑑定為多噬伯克霍爾德氏菌(Burkholderia multivorans)。上述多噬伯克霍爾德氏菌WS-FJ9在促進松樹生長中的應用。上述的多噬伯克霍爾德氏菌WS-FJ9在解磷中的應用。一種解磷菌劑，含有多噬伯克霍爾德氏菌WS-FJ9菌株，菌體濃度為7 8X108cfu/mL。上述的多卩遼伯克霍爾德氏菌在抑制松枯梢病原菌(Sphaeropsis sapinea)中的應用。有益效果本發明的多噬伯克霍爾德氏菌WS-FJ9菌株在液體搖培的情況下，對磷酸三鈣，磷酸鋁和卵磷脂具有較強的溶解效果，與對照相比，差異顯著；將WS-FJ9製成菌劑接種溼地松苗，結果表明，該菌劑能明顯促進溼地松苗木的生長發育，因此，本發明為開發松樹專用解磷細菌肥料提供了優良的菌株資源。





圖I是WS-FJ9菌株的解磷能力結果圖，其中，磷素為Ca3(PO4)i 圖2是WS-FJ9菌株的解磷能力結果圖，其中，磷素為AlPO4 ；
圖3是接種WS-FJ9菌劑溼地松實生苗生長情況結果圖4是WS-FJ9與松枯稍病原菌平板對峙結果圖5是W-S-FJ9接種洋蔥鱗莖結果圖；圖6是WS-FJ9菌株接種菸草結果圖
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進一步的解釋。實施例1WS-FJ9菌株的解磷能力試驗解磷培養基A :葡萄糖 10g, Ca3 (PO4)2 5g，MgCl2 5g，KCl O. 2g，MgSO4. 7Η200· 25g， (NH4)2SO4 O. lg，蒸餾水 IOOOmL, pH 7. O0
解磷培養基B :用AlPO4代替解磷培養基A中的Ca3 (PO4) 2，其它成分和含量相同。蒙金娜有機磷培養基，用於解有機磷細菌的液體培養解磷能力測定葡萄糖10g， (NH4)2SO4 O. 5g, NaCl O. 3g, KCl O. 3g, CaCO3 5g, MgSO4 · 7H20 0. 3g, FeSO4 · 7H20 0. 03g, MnSO4 · 4H20 0. 03g,卵磷脂 0. 2g,蒸餾水 IOOOmL, pH7. 0 7. 5。將活化的WS-FJ9菌株接種NB培養基(牛肉膏3g，蛋白腖10g，氯化鈉5g，蒸餾水 IOOOmL, pH 7. 2 7. 4)中，30°C振蕩培養18 24h製成種子液，取0. 5mL種子液分別接種於含50mL解磷培養基A和50mL解磷培養基B的IOOmL三角瓶中，以接相同體積空白種子液的解磷培養基為對照(CK)，每個處理3個重複，300C，180r/min振蕩培養72h後，發酵液 4°C, 10000r/min離心IOmin,鑰鋪抗比色法測定發酵液有效磷含量。將配製好的蒙金娜有機磷液體培養基按50mL每瓶的裝量加入IOOmL的三角瓶中， 滅菌，冷卻後每瓶加入0. 5mL的卵磷脂和0. 5mL細菌懸液，對照接等量的滅活菌懸液，所有處理都做3次重複。接種後30°C，180r/min振蕩培養3d。結果如圖I所示，從圖I可以看出，以Ca3(PO4)2為唯一磷源時，發酵液有效磷含量達711. 29mg · ΙΛ是對照(CK)的18. 61倍；如圖2所示，以AlPO4為唯一磷源時，發酵液有效磷含量達274. 4mg · L—1，是對照(CK)的3. 5倍。以卵磷脂為唯一碳源，發酵液有效磷含量達到3. 22mg噸―1，綜上表明，WS-FJ9菌株對磷酸三鈣，磷酸鋁和卵磷脂具有較強的溶解能力。實施例2WS-FJ9菌株最適解磷條件試驗將WS-FJ9活化後，接種NB培養基(牛肉膏3g，蛋白腖10g，氯化鈉5g，蒸餾水 IOOOmL, pH 7. 2 7. 4)中，30°C振蕩培養18 24h製成種子液，取0. 5mL種子液分別接種於裝有50mL以NBRIP (國際植物研究所磷酸鹽生長培養基，配方同解磷培養基A)為基本培養基的IOOmL三角瓶中，將NBRIP培養基碳源分別設為蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖和甘露醇； 氮源分別設為蛋白腖、牛肉膏、硝酸鉀、硝酸銨、硝酸鈣，以接相同體積空白種子液的解磷培養基為對照(CK)，每個處理3個重複，300C，180r/min振蕩培養72h後，發酵液4°C，IOOOOr/ min離心IOmin,鑰鋪抗比色法測定發酵液有效磷含量。結果表明，最適解磷條件為，IOOmL 三角瓶中，以葡萄糖為碳源、硫酸銨為氮源，裝液量30 50mL、初始pH值7. O 7. 2、接種量4% 5%、溫度28°C 30°C。實施例3WS-FJ9菌株溫室盆栽試驗將WS-FJ9活化後，用接種環挑取少量菌體接種於裝有50mLNB培養基(配方同實施例I)的IOOmL三角瓶中，29°C，180r/min振蕩培養72h。發酵液(4°C, 6000r/min)離心 5min，用無菌生理鹽水潤洗菌體2 3次後，用無菌生理鹽水調節菌懸液(7 8X IO8Cfu/ mL)製成WS-FJ9菌劑。接種溼地松實生苗(苗齡120d)，以等量無菌生理鹽水為對照(CK)， 接種量為15mL/株。每處理20個重複，置於溫室統一管理，光照為12h/d，適時澆水。溼地松實生苗接種180d生長情況，結果如表I和圖3所示，接種WS-FJ9菌劑對溼地松實生苗具有明顯的促生作用。接種處理使溼地松實生苗的苗高、莖粗比對照有不同程度的增加。其中，苗高和莖粗比對照分別增加了 20. 52%和8. 4%。表1WS-FJ9對溼地松實生苗的生長及生物量處理苗高(cm) 增長率(％) 莖粗(mm) 增長率(％)WS-FJ9 16.15±1.33b 20.522.7±0.240b8.4
CK 13.4±1.76a—2.49±0.33a—注P < 0. 05，同列不同行小寫字母不相同代表差異顯著。實施例4WS-FJ9菌株對松枯梢病原真菌具有較強的拈抗活性將已培養好的松枯梢病原菌在超淨工作檯用滅菌的打孔器(直徑5_)均勻地打成圓形的小孔。採用平板對峙的法，將病原菌菌餅移接到每個培養皿的中心，將WS-FJ9菌株活化後劃線接在平板邊緣。距中心30mm處，以只接病原菌為空白對照，每個處理3個重複，28°C培養3 7d後觀察，結果如圖4所示，WS-FJ9菌株對松枯稍病原菌具有明顯抑菌效果。實施例5WS-FJ9菌株的安全性試驗本發明採用接種洋蔥和菸草來判斷菌株對植物的致病性，採用接種苜蓿來判斷菌株對動物的致病性。供試材料包括洋蔥(Allium cepa)、未開花的菸草(Nicotiana benthniciana)和紫花苜猜(Medicago sativa)種子。洋蔥致病性測定用注射器取洋蔥伯克霍爾德氏菌WS-FJ9菌懸液 (lX 107-108cfu/mL)在洋蔥鱗莖上兩點對襯注射(深度l-2cm)，每點注射量為lmL。以含毒力基因(BCESM和cblA)的LMG1222菌株(CKl)和滅菌水(CK2)為雙重對照。所有處理均重複3次，置於26°C培養，4-5d後檢查結果。其中，LMG1222菌株來源於BCCM(比利時微生物保藏中心)/Ghent University。洋蔥接種試驗結果如圖5所示，接種WS-FJ9菌株的洋蔥僅在接種點產生較小的過敏斑點，繼續培養，斑點並不繼續擴展，將洋蔥切開後，內部顏色沒有發生變化，也沒有臭味，與滅菌水對照相比沒有明顯的差異。據此推斷該菌株不是洋蔥的致病菌，產生的小斑點僅是洋蔥的過敏反應。而接種含毒力基因的LMG1222菌株的洋蔥不僅在接種點產生過敏斑點，而且隨著培養時間的延長，斑點不斷擴大，切開洋蔥後，內部發黃，組織呈軟腐狀且有濃重的臭味，據此推斷，LMG1222菌株為洋蔥致病菌。以上說明隸屬於Bcc基因型II的多噬伯克霍爾德氏菌(Burkholderia multivorans)WS-FJ9菌株對洋蔥沒有致病性，不是洋蔥病原菌，對洋蔥具有安全性。菸草致病性測定用滅菌注射器取O. 5 μ L的含菌量為107-108Cfu/mL的菌懸液，對菸葉進行穿刺，將菌液注入傷口處。以含毒力基因的LMG1222菌株(CKl)和滅菌水(CK2) 為雙重對照。所有處理均重複3次，置於25°C、相對溼度85%、日照16h的人工氣候箱中培養。在24-48h表現枯斑或水潰斑為陽性反應，3d左右出現黃斑為陰性反應。菸草接種試驗結果如圖6所示，接種WS-FJ9菌株的菸葉產生了較輕微的過敏反應，產生了較小的水潰斑，但不引起枯斑，與滅菌水對照差異不明顯，這說明WS-FJ9對菸草雖有較輕微的弱毒性，但並無致病性。含毒力基因的LMG1222菌株使菸草較大的水潰斑， 24h後即產生枯斑，說明該菌為菸草的致病菌。苜蓿致病性測定將測試細菌接種到NA液體培養基中，30°C震蕩(180r/min)培養24h，用滅菌水調節菌懸液到107-108cfu/mL用於接種。將苜蓿種子用98%濃硫酸浸泡20min (約IOmL浸300粒種子)，用500mL滅菌水清洗4次，然後泡在60mL滅菌水中，32 °C 震蕩(150r/min)浸種6_8h，再清洗2次，換水後同樣條件培養過夜。次日再用滅菌水清洗 2次後(每次60mL水)，用無菌鑷子擺放到I %的水瓊脂平板上，每皿擺放30粒種子，發芽後去掉不發芽和發芽不正常的種子，對發芽正常的種子進行計數，等待接種。將水瓊脂平板上的苜蓿種子用接種針在子葉上刺一個小孔，取20 μ L準備好的菌懸液點在傷口處，每菌株接種重複3次，設2種CK處理，其中I個接種含毒力基因的LMG1222菌株(CKl)，另I個接種無菌水(CK2)。接種後的種子在37°C、70%相對溼度、定時光照(12h光照、12h黑暗) 條件下的人工氣候箱中培養，7d後檢查發病率。苜蓿接種試驗，接種LMG1222菌株發病率(50. 6% )極顯著地高於接種WS_FJ9菌株(8. 7%)和接種滅菌水(7.8%)的苜蓿(見表2)。苜蓿是代替老鼠作為測定Bcc菌株對哺乳動物毒性的模式植物，用苜蓿模型可簡單快捷地檢測出Bcc菌株對哺乳動物是否具有致病性。上述試驗結果說明屬于洋蔥伯克霍爾德氏菌基因型II的(Burkholderia multivorans)WS-FJ9菌株對哺乳動物沒有毒害性。本發明採用接種洋蔥、菸草(用於判斷菌株對植物的致病性)以及接種苜蓿(用於判斷菌株對動物的致病性)等方法對從松樹根際土壤中分離出來的屬於Bcc基因型II 的多卩遼伯克霍爾德氏菌(Burkholderia multivorans) WS-FJ9菌株進行安全性測定,結果表明該菌株對洋蔥和苜蓿沒有致病性，對菸草有微弱毒性，但並無致病性。可見，屬於Bcc基因型II的多噬伯克霍爾德氏菌(Burkholderia multivorans)WS-FJ9菌株對松樹是一株很有潛力的安全生防和促生的菌株。表2接種WS-FJ9和LMG1222後苜蓿幼苗發病率的差異顯著性分析
權利要求
1.一種多噬伯克霍爾德氏菌，其分類命名為多噬伯克霍爾德氏菌iBurkholderia multivorans ) WS-FJ9,已保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號是CCTCC NO M2011435，保藏日期2011年12月I日。
2.權利要求I所述的多噬伯克霍爾德氏菌在解磷中的應用。
3.權利要求I所述的多噬伯克霍爾德氏菌在促進松樹生長中的應用。
4.權利要求I所述的多噬伯克霍爾德氏菌在抑制松枯梢病原菌中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種分離自松樹根際土壤、高效溶解難溶性無機磷和有機磷的多噬伯克霍爾德氏菌及其應用。其分類命名為多噬伯克霍爾德氏菌(Burkholderiamultivorans)WS-FJ9，已保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號是CCTCC NOM2011435，保藏日期2011年12月1日。本發明的多噬伯克霍爾德氏菌WS-FJ9菌株在液體搖培的情況下，對磷酸三鈣、磷酸鋁和卵磷脂具有較強的溶解效果，與對照相比差異顯著；WS-FJ9菌株對松枯梢病原菌(Sphaeropsissapinea)具有較強的拮抗活性；將WS-FJ9製成菌劑接種溼地松能明顯促進苗木的生長。本發明為開發松樹生物菌肥提供了優良的菌株資源。
文檔編號C05F11/08GK102604860SQ20121002671
公開日2012年7月25日 申請日期2012年2月7日 優先權日2012年2月7日
發明者侯亮, 葉建仁, 吳小芹, 李冠喜 申請人:南京林業大學