一種慢性乙型病毒性肝炎相關基因ifna2的新突變蛋白、編碼基因及其應用的製作方法

2023-06-09 08:54:51 2

專利名稱：一種慢性乙型病毒性肝炎相關基因ifna2的新突變蛋白、編碼基因及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程及醫學技術領域，具體涉及一種慢性乙型病毒性肝炎相關基因IFNA2的新突變蛋白、編碼基因及其應用。
背景技術：
慢性乙型病毒性肝炎(慢性B肝)是由B型肝炎病毒(HBV)感染而引起的以肝臟損害為主要表現的傳染性疾病，是關係到我國乃至全球公共衛生的重大疾病。宿主的遺傳背景在其易感性及免疫應答中起重要作用。而人群對B肝免疫力的高低存在明顯的個體差
巳中國專利200810004159. 5公開了一種與肝細胞癌相關的B型肝炎病毒基因組標誌物以及預測HBV感染個體發展成肝細胞癌(HCC)的遺傳素因的試劑盒。該試劑盒包括一種或更多種探針，當其與HBV基因組接觸時，如果所述基因組為IFNA2基因型、且包括至少一種對應於某段核苷酸序列上的核苷酸(170C;和/或2170G2;和/或2441C;和/或799G) 時會選擇性地與所述基因組雜交。

發明內容
本發明的目的在於提供一種慢性乙型病毒性肝炎相關基因IFNA2的新突變蛋白。本發明的另一目的是提供上述慢性乙型病毒性肝炎相關基因IFNA2的新突變蛋白的編碼基因。本發明的又一目的是提供上述慢性乙型病毒性肝炎相關基因IFNA2的新突變蛋白、該突變蛋白的編碼基因的應用。本發明通過以下技術方案實現上述目的
一種慢性乙型病毒性肝炎相關基因77WA 的新突變蛋白，是在慢性乙型病毒性肝炎相關基因IFNA2蛋白的胺基酸序列第120位丙氨酸Ala突變為蘇氨酸Thr，本發明中用 p. Alal20Thr 表不。上述慢性乙型病毒性肝炎相關基因IFNA2的新突變蛋白，胺基酸序列如SEQ ID NO: I所示。上述慢性乙型病毒性肝炎相關基因的新突變蛋白的編碼基因。該編碼基因的核苷酸序列優選如SEQ ID N0:2所示。慢性乙型病毒性肝炎相關基因IFNA2的新突變蛋白在製備慢性乙型病毒性肝炎的檢測試劑中的應用。慢性乙型病毒性肝炎相關基因IFNA2的新突變蛋白的編碼基因在製備慢性乙型病毒性肝炎的檢測試劑中的應用。一種慢性乙型病毒性肝炎檢測試劑盒，由以下成分組成核苷酸序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4所示的引物，PCR反應液，PCR產物純化盒和測序反應液；所述PCR反應液為溶解了 Tag DNA聚合酶、dNTPs、鎂離子(如MgCl2), PCR反應緩衝液 (如IOXTaq Buffer),以上試劑均可直接購買相應商品，如(10mM)dNTPs購自上海生工生物工程技術服務有限公司；Tag DNA聚合酶及其配套的IOXTaq Buffer、MgCl2購自Fermentas 公司。各試劑的用量及濃度均為本領域常規值，如Iu/μ L Tag DNA聚合酶lyLdmmol/L 的 dNTP (即濃度均為 2mmol/L 的 4 種 dNTP 的混合物)3 μ L、25mmol/L MgCl2 3 μ L、10 X Taq Buffer (內含(NH4)2SO4) 3 μ L、滅菌 ddH20 17yL。所述PCR產物純化盒為純化PCR產物的溶液和DNA吸附柱Labell ;所述純化PCR 產物的溶液為lu/ μ L奸鹼性磷酸酶(SAP,可購於Fermentas公司)O. 6 μ L、20u/ μ L外切酶C&o I,可購於Fermentas公司)O. 15 μ L和滅菌ddH20 I. 25-1. 75 μ L,或按上述比例配製的其他體積的混合液。純化PCR產物的溶液優選2-2. 5 μ L0所述測序反應液為BigDye (購自ABI公司)和5XSequence buffer (購自ABI 公司)的混合液，BigDye和5XSequence buffer的體積比優選為1:2,如I μ LBigDye與 2 μ L5 X Sequence buffer 混合。上述慢性乙型病毒性肝炎檢測試劑盒，優選核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4所示的引物濃度分別為3. 2ymol/L0本發明的慢性乙型病毒性肝炎的相關基因及其新突變p. Alal20Thr，是通過對「相對極端性狀的」50例慢性B肝患者及40例未注射過B肝疫苗正常對照進行全基因組外顯子測序，通過生物信息學分析及進一步的數據篩選找到最有可能的候選基因；然後再對所找到的候選基因進行大樣本量的病例-對照(其中慢性B肝患者1728例，未注射B肝疫苗正常對照1636例)相關關係研究；最後通過相關基因的作用機理及統計學分析結果 (77WA 基因新突變與慢性B肝相關的統計學/^值為2. 76X10_5，優勢比(OR)為4. 08，說明兩者有顯著相關性)最終確定了 77WA 基因新突變與慢性B型肝炎相關。本發明的人基因核苷酸全長序列(包含突變位點)通常是用聚合酶鏈式反應 (PCR)進行。對於PCR擴增法，可根據基因的核苷酸序列，進行引物設計，並以所檢測的患慢性B型肝炎患者抽提的DNA作為模板，擴增目的序列。最後通過測序反應檢測及確定相關基因的突變。由於前期的研究已經證明了慢性B型肝炎與基因新突變的高度相關性，因此檢測這個基因的突變可用於鑑定慢性B型肝炎患者的宿主遺傳背景的易感性及對免疫應答的反應能力，進一步地用於之後靶向個體化治療，如在患有慢性B型肝炎患者中檢測到了基因的突變，我們可以進一步採取用幹擾素來治療本病。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果
我們通過全基因組外顯子測序及大樣本量的相關研究，發現了與慢性乙型病毒性肝炎的相關基因一及其新突變。因此，找尋及檢測慢性B肝相關基因及其突變，不僅是了解及闡明本病的發病機理的必要途徑，同時也為建立鑑定本病的基因診斷和個體化治療提供了新的契機。在已了解與本病相關的基因及其突變之後，我們可以建立起基於基因及其變異的診斷技術，以期對臨床上慢性B肝患者進行基因水平的診斷，還可以對其臨床用藥情況予以指導和個體化治療。由於基因的突變是導致本病遺傳背景發生改變從而致使其易感性及免疫應答發生改變的重要因素，從長遠看，對本病進行基因的突變檢測使我們有可能在今後通過糾正突變的基因療法或其它針對這一突變的生物學效應的方法去治療本病。因此，從長遠看，與本病相關的基因突變的發現在臨床治療方面有深遠的意義和前景。


圖I 基因的部分測序結果，其中上面部分為野生型的測序結果，下面部分為IFNA2 p. Alal20Thr雜合性突變的測序結果(箭頭所示為突變位點)。圖2:IFNA2 p. Alal20Thr突變型蛋白整體的結構模擬圖，第120位蘇氨酸和第116 位天冬醯胺處用虛線圓圈框起。
具體實施例方式以下實施例中如無特殊說明均為本領域常規試劑和試驗方法。實施例I病例收集
來自中山大學附屬第三醫院傳染科的1728例慢性B型肝炎患者和來自同一地區的1636例未注射B肝疫苗或自報疫苗注射史不明的健康自願者，在取得上述患者、自願者及家屬知情同意後，取外周血於EDTA抗凝管中備用。用Qiagen公司生產的QIAamp DNA Blood Mini Kits (試劑盒)從抗凝外周血中提取DNA，TE溶解，_80°C保存，備用。實施例2 IFNA2基因的突變檢測
基因的 mRNA 序列來自 Genbank (NM_000605)。Genomic DNA 序列來自 UCSC 資料庫(http://genome, ucsc. edu/)和 Ensembl 資料庫(http://asia. ensembl. org/index, html)。主要步驟
I. PCR 擴增PCR 反應體積為 30 μ L :10 X Taq Buffer (內含(NH4) 2S04) 3 μ L，25mmol/ L MgCl2 3μ L,2mmol/L dNTP 混合物 3 μ L，3· 2 μ mol/L 上、下遊引物各 I μ L，Iu/μ L Taq DNA聚合酶I μ L，實施例I提取的DNA模板I μ L，滅菌ddH20補足體積至30 μ L。PCR反應條件95°C預變性3min ；95°C 30s,引物特異性退火溫度lmin，72°C 45s，36個循環；最後 72°C 延伸 IOmin0檢測IFNA2基因突變位點的上遊引物Pl (SEQ ID NO 3)的序列為 5』 - CTTTGAAATGGCAGATCATAA -3』，下遊弓丨物 P2 (SEQ ID NO 4)的序列為5』 -AAATGTAAACGAGTATGTTCCC -3』。2.測序反應方案
(I)預反應反應體積共3μ L : Iu/μ L蝦鹼性磷酸酶(SAP) O. 6μ L、20u/y L外切酶 (.Exo 1)0. 15 μ L (Fermentas 公司)、PCR 產物 O. 5_1· O μ L、滅菌 ddH20 補足體積至 3 μ L。 反應混合物在PCR儀上反應，37°C溫浴15min，85°C 15min滅活酶。反應完畢後反應混合物直接作為測序反應的模板用。(2)測序反應用ABI公司的96孔板，在GeneAmp 9700 PCR儀上進行。反應體積共 10 μ L :3 μ L 的預反應產物、2 μ L 的 5 X Sequence buffer (ABI 公司)、1 μ L 的 BigDye (ΑΒΙ 公司)、lyL 的引物(3. 2ymol/L)，3yL 的滅菌 ddH20。反應條件98°C 2min ；96°C 10s， 50°C 5s,60°C 4min，30 個循環；最後 4°C保存。(3)測序純化直接在96孔板上進行。
a)測序反應完畢後，配無水乙醇6mL+3mol/L醋酸鈉(pH5. 2)240 μ L混合溶液(即無水乙醇醋酸鈉體積比=25:1)，每個樣品中加入50 μ L混合溶液。用錫箔紙封閉，並振蕩混勻。b)將測序產物放於_20°C避光靜置20min以上。c) 20°C, 3700 rpm 離心 30min。d)倒去上清液，倒扣在四層吸水紙上，360rpm離心10s。e)配75%乙醇(無水乙醇7. 5mL+ddH20 2. 5mL混合溶液的比例)，每個樣品中加入 90yL混合溶液。用錫箔紙封閉，並振蕩混勻。f)將測序產物放於_20°C避光靜置20min以上。g) 20°C, 3700 rpm 離心 30min。h)倒去上清液，倒扣在四層吸水紙上，360rpm離心10s。i)室溫通風處,避光晾乾，30min以上。j)每個樣品中加ddH20 10 μ L，用錫箔紙封閉，振蕩後離心。k)待測樣品放於4°C避光靜置I. 5h以上，以充分溶解，上ABI3730測序儀進行測序。3.測序結果分析用ABI序列分析軟體進行分析
發明人對來自中山大學附屬第三醫院傳染科的1728例慢性B型肝炎患者和來自同一地區的1636例未注射B肝疫苗或自報疫苗注射史不明的健康自願者進行基因的突變檢測。結果如下
突變位點為發生在基因的胺基酸序列中第120位丙氨酸突變為蘇氨酸 (p. Alal20Thr)，突變後的胺基酸序列如SEQ ID NO :1所示。其中有36例患者和9例正常對照存在雜合性突變。在1728例病例和1636例對照研究中，其風險等位基因的個數分別是36個和9個，優勢比值(0R值)為4. 08，P值為2. 76X 10_5。多基因遺傳病的研究中，通常是通過關聯分析來確定其風險基因的，本實驗結果中，/7值有顯著差異，且OR值為4. 08， 說明該基因的突變是導致該病的危險因素。測序結果見圖I。實施例3 IFNA2 p. Alal20Thr突變型蛋白結構預測
方法用 the program PyMol (http://pymol. org) > Discovery Studio 3. 0 (Accelrys Inc.)> the programs MultAlin (Corpet F. Multiple sequence alignment with hierarchical clustering. Nucleic. Acids. Res. 1988; 16, 10881-10890)及 ESPript 軟體(Gouet P, Robert X, Courcelle E. ESPript/ENDscript: Extracting and rendering sequence and 3D information from atomic structures of proteins. Nucleic. Acids. Res. 2003; 31，3320-3323)預測 IFNA2 p. Alal20Thr 突變型蛋白的結構及功能域。蛋白質結構預測結果見圖2。對IFNA2基因編碼的蛋白質結構域的預測，發現第 120位親水性的丙氨酸突變為了疏水性的蘇氨酸後，新生成的第120位蘇氨酸的OG與其主鏈上與之紙鄰的第116位天冬醯胺的羰基氧(carbonyl oxygen)之間形成了一氫鍵。且由於第120位的胺基酸殘基正好位於C螺旋結構域的C末端，此位置的胺基酸替換可能會影響到C螺旋結構域的構造，最終可觸發與之相連的整個Loop結構域的改變。此外，由於在野生型的IFNA2蛋白中螺旋結構A和C上的相互毗鄰的胺基酸殘基Cys24和Cysl21之間會形成二硫鍵，因此倘若第120位的丙氨酸發生突變可能也會破壞其附近形成的二硫鍵， 最終使得A螺旋結構發生改變。實施例基因突變檢測試劑盒的製備製備一試劑盒，具體成分見表I
表I
權利要求
1.一種慢性乙型病毒性肝炎相關基因IFNA2的新突變蛋白，其特徵在於在慢性乙型病毒性肝炎相關基因IFNA2蛋白的胺基酸序列第120位丙氨酸突變為蘇氨酸。
2.根據權利要求I所述慢性乙型病毒性肝炎相關基因IFNA2的新突變蛋白，其特徵在於胺基酸序列如SEQ ID NO: I所示。
3.權利要求2所述慢性乙型病毒性肝炎相關基因IFNA2的新突變蛋白的編碼基因。
4.根據權利要求3所述慢性乙型病毒性肝炎相關基因IFNA2的新突變蛋白的編碼基因，其特徵在於核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
5.權利要求I所述慢性乙型病毒性肝炎相關基因IFNA2的新突變蛋白在製備慢性乙型病毒性肝炎的檢測試劑中的應用。
6.權利要求4所述慢性乙型病毒性肝炎相關基因的新突變蛋白的編碼基因在製備慢性乙型病毒性肝炎的檢測試劑中的應用。
7.—種慢性乙型病毒性肝炎檢測試劑盒，其特徵在於由以下成分組成核苷酸序列如 SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4所示的引物，PCR反應液，PCR產物純化盒和測序反應液；所述PCR反應液為溶解了 Tag DNA聚合酶、dNTPs、鎂離子的PCR反應緩衝液；所述PCR產物純化盒由純化PCR產物的溶液和DNA吸附柱Labell組成，所述純化PCR 產物的溶液為Iu/ μ L蝦鹼性磷酸酶、20u/ μ L外切酶位0 I和滅菌ddH20的混合液；所述測序反應液為BigDye和5X Sequence buffer的混合液。
8.根據權利要求7所述慢性乙型病毒性肝炎檢測試劑盒，其特徵在於所述核苷酸序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4所示的引物濃度分別為3. 2 μ mol/L。
全文摘要
本發明公開了一種慢性乙型病毒性肝炎相關基因IFNA2的新突變蛋白、編碼基因及其應用。本發明的慢性乙型病毒性肝炎相關基因IFNA2的新突變蛋白是在慢性乙型病毒性肝炎相關基因IFNA2蛋白的胺基酸序列第120位丙氨酸突變為蘇氨酸，同時得到了該突變蛋白的編碼基因，建立了基於IFNA2基因及其突變體的診斷試劑盒，該試劑盒可以對臨床上慢性B肝患者進行基因水平的診斷，還可以對其臨床用藥情況予以指導和個體化治療。從長遠看，對慢性乙型病毒性肝炎進行IFNA2基因的突變檢測使我們有可能在今後通過糾正突變的基因療法或其它針對這一突變的生物學效應的方法去治療本病，在臨床治療方面有深遠意義和應用前景。
文檔編號C12N15/51GK102584956SQ201210031358
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月13日 優先權日2012年2月13日
發明者彭亮, 李奇斌, 王一鳴, 袁萍, 裴元元, 趙強, 高志良, 黃瑋俊 申請人:中山大學