藥品中主要病原微生物的檢測的製作方法

2023-07-12 20:17:31 2

專利名稱：藥品中主要病原微生物的檢測的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種利用聚合酶鏈式反應(PCR)技術檢測藥品中主要病原微生物的方法，特別地涉及一種利用聚合酶鏈式反應擴增特異性擴增主要病原微生物的特定的基因片段來檢測藥品中主要病原微生物的方法和用於PCR的引物，以及涉及用於檢測PCR產物的探針和DNA晶片以及包含該DNA晶片的試劑盒。
背景技術：
藥品的微生物學必須符合中國藥典規定的標準，這對於製藥公司和各藥檢研究所來講是非常重要的。目前，藥品中主要病原菌的檢測均是採用傳統的微生物檢測方法，申請人尚未發現採用基因晶片檢測主要病原菌的方法。中國、美國和歐洲藥典均規定，在藥品中不得含有主要病原菌。所以就藥品特別是某些中藥製品的汙染問題而言，能快速檢出破傷風梭菌的方法對於減少藥物廢品的產生以及避免浪費是非常必要的；而相關的藥檢部門則可以利用該類方法的敏感性和特異性來保證國民的用藥安全。目前，藥品中病原菌的檢測大都是採用傳統的微生物檢測方法。
在現有的微生物檢測技術中，病原菌的檢測主要是利用微生物的培養法、生化反應、血清學方法以及螢光法等。例如JP62-115296A中公開了採用蛋黃培養細菌而後測定的方法，SU825627B公開了在厭氧條件下培養來測定營養品中的梭狀芽胞桿菌的方法。RU2084521C公開了一種用澱粉和營養介質來分離和檢測梭狀芽胞桿菌的方法，該方法可用於控制奶品加工。US6228574B公開了一種以孢子萌發為基礎，快速檢測與確定分析物例如梭狀芽胞桿菌的方法。另外，螢光法是指通過將微生物細胞染色或標記來產生螢光進行檢測的方法，例如，在JP11-169194中公開了採用生物發光試劑測定體液樣品中的微生物的方法。
然而，眾所周知，這些傳統的方法費時、耗力，且易出現錯誤的鑑定結果。隨著分子生物學的飛速發展，對病原微生物的鑑定已不再局限於對它的外部形態結構及生理特性等常規檢驗上，而是從分子生物學水平上研究生物大分子，特別是核酸結構及其組成部分。在此基礎上建立的眾多檢測技術中，聚合酶鏈式(Polymerase chainreaction，PCR)以其敏感、特異、簡便、快速的特點已逐步應用於病原菌的檢測。聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)是用於在體外酶促擴增特定DNA片段的快速方法。通過這一方法可將極微量的DNA擴增放大數百萬倍，用於DNA檢測則極大地提高了靈敏度，理論上可測到每個細胞一分子DNA的水平。另外，基於PCR反應的DNA晶片技術以其具有敏感、特異、簡便、快速及可以同時檢測多種病原菌基因的特點受到廣泛的關注。DNA晶片技術是通過核酸分子雜交原理來進行酸序列分析，即通過晶片上已知序列的核酸探針鹼基的配對來檢測分析未知序列，即雜交測序(SBH)。由於光刻技術具有非常高的解析度，可以在支持物上按設計要求合成出高密度的寡核苷酸探針陣列，這個探針陣列由一定長度的寡核苷酸的所有可能序列組成，而且探針陣列中每一位置的寡核苷酸的序列都是已知的，將標記過的待分析序列與晶片上的探針陣列進行雜交，控制反應條件，與靶序列完全互補的探針顯示很強的雜交信號，利用高解析度檢測裝置檢測雜交信號，經過計算機分析處理，即可檢測出是否存在靶序列。
本發明的概述本發明涉及主要病原菌中基因上擴增特異性DNA片段的引物。因此，這些引物可以用來檢測主要病原菌。
在具體實施方案中，本發明設計下列序列片段。
金黃色葡萄球菌1、命名為SAU-1的引物，核苷酸序列為5』CCAGATGAGTTGCACAAATCG3』(SEQ ID NO.1)2、命名為SAU-2的引物，核苷酸序列為5』CACCAAATAGTGACGAGTTA3』(SEQ ID NO.2)沙門菌3、命名為SAl-1的引物，核苷酸序列為5』GGCGAGCAGTTTGTCTGTC3』(SEQ ID NO.3)4、命名為SAl-3的引物，核苷酸序列為5』GTTTCGCCTGGCTGATACG3』(SEQ ID NO.4)志賀菌5、命名為Shi-1的引物，核苷酸序列為5』CAACACTGGATGATCTCAG3』(SEQ ID NO.5)
6、命名為Shi-2的引物，核苷酸序列為5』CCCCCTCAACTGCTAATA3』(SEQ ID NO.6)7、命名為Shi-3的引物，核苷酸序列為5』TGTATCACAGATATGGCATGC3』(SEQ ID NO.7)8、命名為Shi-4的引物，核苷酸序列為5』TCCGGAGATTGTTCCATGTG3』(SEQ ID NO.8)大腸埃希菌9、命名為Eco-1的引物，核苷酸序列為5』ATTAACCCTCACTAAAG3』(SEQ ID NO.9)10、命名為Eco-2的引物，起核苷酸序列為5』CGATGAAGAACGCAGCG3』(SEQ ID NO.10)銅綠假單胞菌11、命名為Pae-1的引物，核苷酸序列為5』GCTTCATTGATTTTAGCGGAAC 3』(SEQ ID NO.11)鑑別活菌與死菌用引物12、命名為Lv-16SrR-1的引物，核苷酸序列為5』GCCGCCAGTGTGCTGGAATT3』(SEQ ID NO.12)13、命名為Lv-16SrR-2的引物，核苷酸序列為5』TAGATGCATGCTCGAGCGGC3』(SEQ ID NO.13)本發明的一個重要方面是用於PCR擴增的樣品的方法。有生長能力的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門菌、志賀菌、銅綠假單胞菌裂解後，從細胞中釋放的DNA可以作為PCR擴增合適的模板。通過是否出現大小在126-539鹼基對範圍內的基因片段來判定其是否存在。這個片段可通過瓊脂塘凝膠電泳並與DNA標準分子量的比較來加以判定，或利用基因晶片來判斷含有靶序列的主要病原菌是否存在。
本發明的詳細描述本發明首先涉及用來快速檢測被汙染藥品中的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門菌、志賀菌和銅綠假單胞菌的方法。通過PCR金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門菌、志賀菌、銅綠假單胞菌的核苷酸引物擴增出與其他種屬無關的基因。由於不需要在實驗基質中培養細菌，所以減少了檢測細菌所需的時間，這些因素使這種方法可用於現場檢測。
該方法以DNA的鹼基互補為基礎。DNA是由核苷酸「鹼基」組成的兩條反向平行鏈構成。這些鹼基，包括腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶，互相形成特有的氫鍵。腺嘌呤與胸腺嘧啶配對及鳥嘌呤和胞嘧啶配對的DNA雙鏈能通過鹼處理或加熱的方法變性或轉變成單鏈。當條件合適時，DNA將重新形成雙鏈。聚合酶鏈式反應即PCR法是將目標DNA區段擴散到可檢測水平所通常使用的方法。近來它被用來檢測許多病原細菌。在這個過程中，與目標區的兩側區域互補的包含特異序列的DNA引物通過一種DNA聚合酶來引導DNA的酶促合成。DNA聚合酶要求引物來啟動互補DNA鏈的合成。引物是核苷酸片段(18鹼基)。在PCR過程中通過溫度在退火步驟中控制引導過程。引物的退火條件根據試驗來確定，以便提高特異性。退火後，當聚合酶合成互補DNA鏈時聚合發生。聚合後，PCR反應物被加熱到使雙鏈DNA變性。通過使用熱穩定性的DNA聚合酶進行退火、聚合、變性的反覆循環能夠保證該酶不失活。PCR擴增是使用自動熱循環設備的常規試驗方法。結果可以使目標DNA片段指數倍的擴增。擴增的目的片段可通過瓊脂凝膠電泳檢測到，或將擴增的目的片段與DNA晶片進行反應然後進行檢測。
另一方面，本發明提供了如下的用於藥品中主要病原菌檢測的引物，其中用於金黃色葡萄球菌的1、命名為SAU-1的引物(A)，核苷酸序列為5』CCAGATGAGTTGCACAAATCG3』(SEQ ID NO.1)2、命名為SAU-2的引物(B)，核苷酸序列為5』CACCAAATAGTGACGAGTTA3』(SEQ ID NO.2)用於檢測沙門菌的3、命名為SAl-1的引物(C)，核苷酸序列為5』GGCGAGCAGTTTGTCTGTC3』(SEQ ID NO.3)4、命名為SAl-3的引物(D)，核苷酸序列為5』GTTTCGCCTGGCTGATACG3』(SEQ ID NO.4)用於檢測志賀菌的5、命名為Shi-1的引物(E)，核苷酸序列為5』CAACACTGGATGATCTCAG3』(SEQ ID NO5)6、命名為Shi-2的引物(F)，核苷酸序列為5』CCCCCTCAACTGCTAATA3』(SEQ ID NO.6)7、命名為Shi-3的引物(G)，核苷酸序列為
5』TGTATCACAGATATGGCATGC3』(SEQ ID NO.7)8、命名為Shi-4的引物(H)，核苷酸序列為5』TCCGGAGATTGTTCCATGTG3』(SEQ ID NO.8)用於檢測大腸埃希菌的9、命名為Eco-1的引物(I)，核苷酸序列為5』ATTAACCCTCACTAAAG3』(SEQ ID NO.9)10、命名為Eco-2的引物(J)，起核苷酸序列為5』CGATGAAGAACGCAGCG3』(SEQ ID NO.10)用於檢測銅綠假單胞菌的11、命名為Pae-1的引物(K)，核苷酸序列為5』GCTTCATTGATTTTAGCGGAAC3』(SEQ ID NO.11)用於鑑別活菌與死菌用的引物12、命名為Lv-16SrR-1的引物，核苷酸序列為5』GCCGCCAGTGTGCTGGAATT3』(SEQ ID NO.12)13、命名為Lv-16SrR-2的引物，核苷酸序列為5』TAGATGCATGCTCGAGCGGC3』(SEQ ID NO.13)14、命名為Lv-16sRNA的引物(M)，核苷酸序列為5』GATTAGAGTTTGATCATGGC3』以及檢測梭菌的15、命名為TTC-1的正向引物(N)，核苷酸序列為5』TTTTTAGACCTAACAACC 3』16、命名為TTC-2的反向引物(O)，核苷酸序列為
5』TTAATCATTTGTCCATCC 3』另外，因為死菌一般並不影響藥品和食品的安全，所以引入16sRNA探針引物來檢測被檢物中存在的細菌是否為活菌。檢測方法的原理是由於細菌的RNA的半衰期很短，細菌死亡後其RNA很快降解，因此不能通過反轉錄過程進行DNA擴增。上面描述的引物是通過大量的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門菌、志賀菌、銅綠假單胞菌DNA序列對比得到的，核酸序列比較軟體闡明了基因的高度保守區。從這些區域選擇特定的引物點併合成合適的引物。通過反覆試驗來決定引物的最佳序列。且引物最後的確定遵循以下標準從鑑定的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門菌、志賀菌、銅綠假單胞菌中擴增出上述DNA產物。
II.從鑑定的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門菌、志賀菌和銅綠假單胞菌以外的其它菌種不能產生目的產物。
III.從藥品樣品分離出的未鑑定的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門菌、志賀菌和銅綠假單胞菌中擴增出目的產物。
金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門菌、志賀菌和銅綠假單胞菌通過標準方法來測定形成目的產物的能力。培養物80℃放置10分鐘，隨後塗在生長培養基上，經過熱處理能存活的細菌具有產生孢子的能力。表1概述了用於在一系列不同菌株培養物進行試驗的引物性質的數據。這個引物可以金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門菌、志賀菌和銅綠假單胞菌上分別擴增出126-539(bp)鹼基對的片段。
表1顯示了引物從金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門菌、志賀菌和銅綠假單胞菌中擴增目的基因的能力。不含目的基因的細菌，其不能產生目的帶。
這些引物可用來篩選從藥品提取的DNA，來檢測金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門菌、志賀菌和銅綠假單胞菌。這一方法與傳統塗板技術相比極大地減少了周轉時間。
下列步驟使藥品中檢測金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門菌、志賀菌和銅綠假單胞菌獲得成功。
樣品中加入等體積胰豆腖培養基37℃放置45分鐘(1毫升樣品即足以對用於分析液體物質)，這使金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門菌、志賀菌和銅綠假單胞菌生長，從這些菌種提取DNA。
II.煮沸樣品10分鐘以裂解細胞並釋放DNA。
III.等份的樣品通常為5微升，與20微升水，PCR珠(如U.S專利5,593,824中所描述，本文引入作參考)，及含有上述引物的2微升引物混合物混合。
IV.PCR熱循環如下96℃變性2min；94℃變性30s，60℃復性30s，72℃延伸30s，循環30次，最後72℃延伸5min。
V.PCR反應物與電泳上樣儲存染料混合，在2％的瓊脂糖凝膠上電泳。
VI.將瓊脂糖凝膠染色觀察目的產物。
有些樣品可能含有幹擾PCR擴增的物質，在這種情況下，可將樣品用胰豆腖培養基進行10倍或100倍的稀釋可克服這種幹擾。在檢測任何樣品時都需要有陽性幾陰性對照，電泳時需有標準分子量對照物。
試驗中所用到的菌株及結果見表1-5。
表1 金黃色葡萄球菌檢測用引物(Sau-1+Sau-2)產生486bp核苷酸細菌菌株 來源PCR測試金黃色葡萄球菌ATCC25923 ATCC +金黃色葡萄球菌CMCC26001 CMCC +金黃色葡萄球菌CMCC26002 CMCC +金黃色葡萄球菌CMCC26012 CMCC +破傷風梭菌CMCC64001 CMCC -肉毒梭菌CMCC64402 CMCC -蠟狀芽孢桿菌ATCC14579 ATCC -枯草芽孢桿菌ATCC6051 ATCC -地衣芽孢桿菌ATCC12759 ATCC -球形芽孢桿菌ATCC4525 ATCC -產氣夾膜梭菌 ATCC -表皮葡萄球菌CMCC26069 CMCC -其它葡萄球菌CMCC26067 CMCC -其它葡萄球菌CMCC26101 CMCC -化膿鏈球菌ATCC19615 ATCC -糞腸球菌ATCC29212 ATCC -糞腸球菌ATCC14506 ATCC -類鼻疽假單胞菌CMCC53051 CMCC -鮑曼不動桿菌 -奇異變形桿菌CMCC49003 CMCC -普羅菲登斯菌CMCC42001 CMCC -枸櫞酸菌CMCC48017 CMCC -枸櫞酸菌CMCC48019 CMCC -肺炎克雷伯菌CMCC46101 CMCC -肺炎克雷伯菌ATCC13883 ATCC -CMCC為中國醫學細菌保藏管理中心；ATCC為美國標準菌種收藏所表2 沙門菌檢測用引物(Sal-1+Sal-2)產生539bp核苷酸細菌菌株 來源PCR測試鼠傷寒沙門菌CMCC47729 CMCC +鼠傷寒沙門菌CMCC50013 CMCC +腸炎沙門菌CMCC50040 CMCC +
腸炎沙門菌CMCC50041CMCC +傷寒沙門菌CMCC50038CMCC +鴨沙門菌CMCC50083 CMCC +豬霍亂沙門菌CMCC47649 CMCC +德比沙門菌CMCC50112CMCC +都柏林沙門菌CMCC50042 CMCC +破傷風梭菌CMCC64001CMCC -肉毒梭菌CMCC64402 CMCC -蠟狀芽孢桿菌ATCC14579 ATCC -枯草芽孢桿菌ATCC6051 ATCC -地衣芽孢桿菌ATCC12759 ATCC -球形芽孢桿菌ATCC4525 ATCC -產氣夾膜梭菌 ATCC -表皮葡萄球菌CMCC26069 CMCC -其它葡萄球菌CMCC26067 CMCC -其它葡萄球菌CMCC26101 CMCC -化膿鏈球菌ATCC19615ATCC -糞腸球菌ATCC29212 ATCC -糞腸球菌ATCC14506 ATCC -類鼻疽假單胞菌CMCC53051CMCC -鮑曼不動桿菌 -奇異變形桿菌CMCC49003 CMCC -普羅菲登斯菌CMCC42001 CMCC -枸櫞酸菌CMCC48017 CMCC -枸櫞酸菌CMCC48019 CMCC -肺炎克雷伯菌CMCC46101 CMCC -肺炎克雷伯菌ATCC13883 ATCC -CMCC為中國醫學細菌保藏管理中心；ATCC為美國標準菌種收藏所表3 銅綠假單胞菌檢測用引物(Pae-1+Pae-2)產生435bp核苷酸細菌菌株 來源PCR測試銅綠假單胞菌ATCC27853 ATCC +銅綠假單胞菌ATCC27313 ATCC +銅綠假單胞菌CMCC10119 ATCC +銅綠假單胞菌CMCC10121 CMCC +銅綠假單胞菌CMCC10101 CMCC +破傷風梭菌CMCC64001CMCC -肉毒梭菌CMCC64402 CMCC -蠟狀芽孢桿菌ATCC14579 ATCC -枯草芽孢桿菌ATCC6051 ATCC -地衣芽孢桿菌ATCC12759 ATCC -球形芽孢桿菌ATCC4525 ATCC -產氣夾膜梭菌 ATCC -表皮葡萄球菌CMCC26069 CMCC -其它葡萄球菌CMCC26067 CMCC -其它葡萄球菌CMCC26101 CMCC -化膿鏈球菌ATCC19615ATCC -糞腸球菌ATCC29212 ATCC -糞腸球菌ATCC14506 ATCC -類鼻疽假單胞菌CMCC53051CMCC -鮑曼不動桿菌 -奇異變形桿菌CMCC49003 CMCC -
普羅菲登斯菌CMCC42001 CMCC -枸櫞酸菌CMCC48019 CMCC -肺炎克雷伯菌CMCC46101 CMCC -肺炎克雷伯菌ATCC13883 ATCC -CMCC為中國醫學細菌保藏管理中心；ATCC為美國標準菌種收藏所表4 大腸埃希菌檢測用引物(Eco-1+Eco-2)產生126bp核苷酸細菌菌株 來源PCR測試大腸埃希菌CMCC44101CMCC +大腸埃希菌CMCC44123CMCC +大腸埃希菌CMCC44126CMCC +大腸埃希菌CMCC44134CMCC +大腸埃希菌CMCC44203CMCC +大腸埃希菌CMCC44210CMCC +破傷風梭菌CMCC64001CMCC -肉毒梭菌CMCC64402 CMCC -蠟狀芽孢桿菌ATCC14579 ATCC -枯草芽孢桿菌ATCC6051 ATCC -地衣芽孢桿菌ATCC12759 ATCC -球形芽孢桿菌ATCC4525 ATCC -產氣夾膜梭菌 ATCC -表皮葡萄球菌CMCC26069 CMCC -其它葡萄球菌CMCC26067 CMCC -其它葡萄球菌CMCC26101 CMCC -化膿鏈球菌ATCC19615ATCC -糞腸球菌ATCC29212 ATCC -糞腸球菌ATCC14506 ATCC -類鼻疽假單胞菌CMCC53051CMCC -鮑曼不動桿菌 -奇異變形桿菌CMCC49003 CMCC -普羅菲登斯菌CMCC42001 CMCC -枸櫞酸菌CMCC48017 CMCC -枸櫞酸菌CMCC48019 CMCC -肺炎克雷伯菌CMCC46101 CMCC -肺炎克雷伯菌ATCC13883 ATCC -CMCC為中國醫學細菌保藏管理中心；ATCC為美國標準菌種收藏所表5 志賀菌檢測用引物(Eco-1+Eco-2)產生349bp核苷酸細菌菌株 來源PCR測試福氏志賀菌CMCC51061CMCC +鮑氏志賀菌CMCC51149CMCC +志賀氏志賀菌CMCC51054 CMCC +宋內氏志賀菌CMCC51081 CMCC +摩根變形桿菌CMCC49086 CMCC +破傷風梭菌CMCC64001CMCC -肉毒梭菌CMCC64402 CMCC -蠟狀芽孢桿菌ATCC14579 ATCC -
枯草芽孢桿菌ATCC6051ATCC -地衣芽孢桿菌ATCC12759 ATCC -球形芽孢桿菌ATCC4525ATCC -產氣夾膜梭菌ATCC -表皮葡萄球菌CMCC26069 CMCC -其它葡萄球菌CMCC26067 CMCC -其它葡萄球菌CMCC26101 CMCC -化膿鏈球菌ATCC19615 ATCC -糞腸球菌ATCC29212 ATCC -糞腸球菌ATCC14506 ATCC -類鼻疽假單胞菌CMCC53051 CMCC -鮑曼不動桿菌 -奇異變形桿菌CMCC49003 CMCC -普羅菲登斯菌CMCC42001 CMCC -枸櫞酸菌CMCC48017 CMCC -枸櫞酸菌CMCC48019 CMCC -肺炎克雷伯菌CMCC46101 CMCC -肺炎克雷伯菌ATCC13883 ATCC -CMCC為中國醫學細菌保藏管理中心；ATCC為美國標準菌種收藏所另外，本發明提供了一種藥品中相關病原菌檢測專用的DNA晶片(PPDC)以及利用該DNA晶片檢測病原菌的方法。本發明的DNA晶片的探針陣列設計如下在一顯微鏡載玻片表面，根據圖1構建14個區域位點(5mm×5mm)，每個位點按圖1所示將金黃色葡萄球菌Sau-1、Sau-2；沙門菌SAl-1、SAl-2；志賀菌Shi-1、Shi-2、Shi-3、Shi-4；大腸埃希菌Eco-1、Eco-1；銅綠假單胞菌Pae-1和破傷風梭菌TTC-1、TTC-2特異性探針順序排列。這樣可同時檢測藥品檢測中規定的病原菌。每一探針的點樣面積約為1.5mm×1.5mm，所述PPDC陳列的製作過程為先在載玻片上設計專用晶片的模式圖。將預先合成好的特異性單股DNA探針，用微量點樣針器通過直接物理接觸固定於特定位點上。
其中金黃色葡萄球菌Sau-1特異性探針為CATGTATCAGCAATAAAC(SEB gene)金黃色葡萄球菌Sau-2特異性探針為ATTAAGGACAGTAAGTTA(SEBgene)沙門菌SAl-1特異性探針為CTCCGCTCATGTATCGA(araC gene)沙門菌SAl-2特異性探針為TCTCATCACATCACTAA(araC gene)志賀菌Shi-1特異性探針為CAACAATTCTTCCCTG(invE gene)志賀菌Shi-2特異性探針為AAATTTGCCCCC(invE gene)志賀菌Shi-3特異性探針為CCTAAGCATATTTCTGC(ipaH gene)志賀菌Shi-4特異性探針為GCCAAAGCTGCCTGCA(i paH gene)大腸埃希菌Eco-1特異性探針為TTCTCACAGATAACTGTG(uidAgene)大腸埃希菌Eco-2特異性探針為ATGCGATCTATATCACGC(uidAgene)銅綠假單胞菌Pae-1特異性探針為TCTCTTCCGGCAGGCCGAT(rpmH gene)活菌檢測用16sRNA特異性探針為CATCACTTGATAGTTTAAAG破傷風梭菌TTC-1特異性探針為CAATAATTAGCTCTAT(Tetanustoxin C gene)破傷風梭菌TTC-2特異性探針為CTTTTAGGGATTTATC(Tetanustoxin C gene)
在本發明的另一方面提供了一種檢測用PPDC試劑盒，該PPDC試劑盒的組成為晶片 5片雜交蓋玻片10片dNTP/PCR引物系列混合液(引物A、B、C、D、E、F、G、各10ulH、I、J、K、M、N、O)2x雜交緩衝液 500ul在PPDC試劑盒中將合成的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門菌、志賀菌、銅綠假單胞菌和破傷風梭菌特異性的單股DNA探針固定於載玻片上，被檢物經特異引物進行聚合酶鏈反應(PolymeraseChain Reaction)擴增其基因序列，擴增後的靶基因序列變性產生單股的DNA，擴增時由Cy5螢光物標記。Cy5螢光物標記的基因序列與固相陣列雜交。結合在探針上的被檢測核酸量與其鹼基構成和靶-探針匹配的量所決定。被檢測核酸可通過雷射共焦顯微鏡檢測雜交信號強弱和分布，並根據陳列中各位點探針分子的雜交信號強度直接鑑定被檢物中是否是否汙染有上述病原菌及鑑定其為何種病原菌。


附圖1為藥品相關病原菌檢測DNA晶片(PPDC)示意圖；附圖2為A-O引物PCR擴增的電泳圖片，其中圖1從左至右依次為引物(Shi-1+Shi-2)檢測福氏志賀菌CMCC51061產生349bp片段的核苷酸；引物(Pae-1)檢測銅綠假單胞菌ATCC27853產生435bp片段的核苷酸；引物(Eco-1+Eco-2)檢測大腸埃希菌CMCC44101產生460bp片段的核苷酸；引物(Sau-1+Sau-2)檢測金黃色葡萄球菌ATCC25923產生486bp片段的核苷酸；引物(Sa1-1+Sa1-2)檢測鼠傷寒沙門菌CMCC47729產生539bp核苷酸；引物(TTC-1+TTC-2)檢測破傷風梭菌CMCC64001產生1536bp核苷酸；產生539bp核苷酸；核酸分子量參照物自上而下為2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp。
下列是進一步描述本發明的實施例。這些實施例不應被認為是對本發明的限制。本領域技術人員應理解在形式上和詳細內容上的各種改變並不違背在所附權利要求中詳細標明的本發明的實質和範圍。
實施例1待檢藥品的處理將待測藥品樣品加到無菌水中得到1％(W/V)溶液。該溶液經混合均勻後形成溶液或懸液。隨後將其與等體積的胰豆腖培養基混合，在37℃孵育45分鐘。
實施例2煮沸裂解及PCR擴增金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門菌、志賀菌和銅綠假單胞菌生長後，煮沸10分鐘。在煮沸過程中注意試管要打開。5微升樣品加入到商品化預製備的PCR緩和物中。混合物提供PCR反應所需的試劑。每個終體積為25微升的PCR反應中含有1.5個單位的Taq DNA聚合酶、10毫摩爾的Tris-HCl(室溫pH＝9.0)、50毫摩爾的KCl、1.5毫摩爾的MgCl2、200毫摩爾的每種核苷酸。無菌水及TTC引物加到PCR反應體系中。引物的濃度為0.5毫摩爾。PCR管放在熱循環儀上使用上面所描述的程序進行擴增。
實施例3PCR產物的檢測可通過產生大約126-539鹼基對分子量範圍內的PCR產物來測定樣品中是否存在金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門菌、志賀菌和銅綠假單胞菌。來自特定樣品的PCR產物的出現說明金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門菌、志賀菌和銅綠假單胞菌檢測陽性。下表6所示為熊膽粉、複方丹參片和板藍根衝劑三種藥品的PCR檢測限度。
表6 三種不同藥品中PCR檢測限度樣品 菌數/克藥品PCR結果金黃色葡萄球菌ATCC25923培養物 1.5±0.7 +金黃色葡萄球菌CMCC26001培養物 1.4±0.5 +熊膽粉 2.1±1.0 +複方丹參片 1.4±0.7 +板藍根衝劑 2.2±1.1 +銅綠假單胞菌ATCC27853培養物1.3±1.0 +銅綠假單胞菌CMCC10121培養物1.4±0.8 +熊膽粉 1.9±1.3 +複方丹參片 2.0±1.1 +板藍根衝劑 1.8±0.8 +鼠傷寒沙門菌CMCC47729培養物1.7±0.8 +腸炎沙門菌CMCC50041培養物 1.9±1.0 +熊膽粉 2.7±1.2 +複方丹參片 2.1±1.4 +板藍根衝劑 1.6±1.1 +大腸埃希菌CMCC44101培養物 1.9±0.7 +大腸埃希菌CMCC44123培養物 1.6±0.8 +熊膽粉 1.9±1.2 +複方丹參片 2.3±1.1 +板藍根衝劑 2.1±1.2 +福氏志賀菌CMCC51061培養物 2.0±1.1 +鮑氏志賀菌CMCC51149培養物 1.4±0.8 +志賀氏志賀菌CMCC51054培養物2.1±0.9 +熊膽粉 2.0±1.0 +複方丹參片 2.2±0.8 +板藍根衝劑 1.8±1.1 +實施例4PPDC試劑盒檢測操作程序沒有包含在實驗中所採用的試劑盒中的試劑和設備BE緩衝液、TRIS、不合Rnase和Dnase的PCR試管、雷射雷射共聚焦顯微鏡等。PPDC試劑盒檢測操作程序如下1.取被檢物1mg或1ml加入10ml增菌肉湯經6小時增菌。
2.離心取沉澱物，取適量加入系列dNTP/PCR引物管中，進行PCR擴增。
3.擴增後的DNA序列變性，與PPDC試劑盒中的DNA晶片的相應位點的單股DNA探針進行雜交。
4.雷射共聚焦顯微鏡檢測陣列中各位點的螢光信號，確定結果。
儘管本發明針對具體實施方案已加以描述，但對於本領域技術人員來講本發明的很多其它形式及改進是顯而易見的。附加的權利要求及本發明通常應該被解釋為可以覆蓋所有上述的包含在本發明的主旨範圍內的明顯的其它形式和改進。
權利要求
1.一種用於系統地檢測藥品中主要病原微生物的方法，該方法包括A)使用選自主要病原微生物的引物從待測藥品的細菌總細胞DNA中通過PCR擴增出所述主要病原微生物DNA的一部分；B)檢測擴增產物的存在。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述的主要病原微生物為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門菌、志賀菌、銅綠假單胞菌。
3.如權利要求2所述的方法，其中金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門菌、志賀菌、銅綠假單胞菌為需氧菌。
4.如權利要求3所述的方法，其中所述用於擴增金黃色葡萄球菌DNA的引物(A)和引物(B)序列為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；用於擴增沙門菌DNA的引物(C)和引物(D)序列為SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；用於擴增志賀菌DNA的引物(E)、引物(F)、引物(G)和引物(H)序列為SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；用於擴增大腸埃希氏菌DNA的引物(I)和引物(J)序列為SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；用於擴增銅綠假單胞菌DNA的引物序列為SEQ ID NO.11(K)。
5.如權利要求3所述的方法，其中還使用鑑別活菌和死菌的引物。
6.如權利要求5所述的方法，其中鑑別活菌和死菌的引物的序列為SEQ IDNO.12和SEQ ID NO.13。
7.如權利要求1-7之一所述的方法，其中所述的擴增反應可以產生長度在126-539核苷酸範圍的多核苷酸。
8.如權利要求1-6之一所述的方法，其中擴增產物的檢測是通過瓊脂糖凝膠電泳並與DNA標準分子量進行比較來完成的。
9.如權利要求1-6之一所述的方法，其中擴增產物的檢測是在DNA晶片上通過擴增的DNA片段與DNA晶片的特異性探針進行雜交，然後用雷射共聚焦顯微鏡檢測每個探針分子的雜交信號強度來進行的。
10.根據權利要求9所述的方法，待檢物在PCR擴增時，以Cy5螢光素進行標記。
11.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於所述的特異性探針分別為金黃色葡萄球菌Sau-1特異性探針CATGTATCAGCAATAAAC(SEB gene)；金黃色葡萄球菌Sau-2特異性探針ATTAAGGACAGTAAGTTA(SEB gene)；沙門菌SAl-1特異性探針CTCCGCTCATGTATCGA(araC gene)；沙門菌SAl-2特異性探針TCTCATCACATCACTAA(araC gene)；志賀菌Shi-1特異性探針CAACAATTCTTCCCTG(invE gene)；志賀菌Shi-2特異性探針AAATTTGCCCCC(invE gene)；志賀菌Shi-3特異性探針CCTAAGCATATTTCTGC(ipaH gene)；志賀菌Shi-4特異性探針GCCAAAGCTGCCTGCA(ipaH gene)；大腸埃希菌Eco-1特異性探針TTCTCACAGATAACTGTG(uidA gene)；大腸埃希菌Eco-2特異性探針ATGCGATCTATATCACGC(uidA gene)；銅綠假單胞菌Pae-1特異性探針TCTCTTCCGGCAGGCCGAT(rpmH gene)；活菌檢測用16sRNA特異性探針為CATCACTTGATAGTTTAAAG；破傷風梭菌TTC-1特異性探針CAATAATTAGCTCTAT(Tetanus toxin C gene)；破傷風梭菌TTC-2特異性探針CTTTTAGGGATTTATC(Tetanus toxin C gene)。
12.用於權利要求9所述檢測方法的DNA晶片，其探針陣列設計如下在一顯微鏡載玻片表面分兩行構建14個區域位點(5mm×5mm)，將每個位點順序排列金黃色葡萄球菌Sau-1、Sau-2特異性探針；沙門菌SAl-1、SAl-2特異性探針；志賀菌Shi-1、Shi-2、Shi-3、Shi-4特異性探針；大腸埃希菌Eco-1、Eco-1；銅綠假單胞菌Pae-1和破傷風梭菌TTC-1、TTC-2特異性探針，每一探針的點樣面積約為1.5mm×1.5mm。
13.根據權利要求12的DNA晶片，其預先合成好的特異性單股DNA探針是通過微量點樣針器直接物理接觸固定於所述的特定區域位點上。
14.一種可用於權利要求9所述檢測方法的PPDC試劑盒，其組成包括晶片 5片雜交蓋玻片10片dNTP/PCR引物系列混各10ul合液(引物A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、M、N、O)2x雜交緩衝液 500ul用於藥品中主要病原微生物DNA的PCR擴增的引物，其中包括用於擴增金黃色葡萄球菌DNA的引物序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；用於擴增沙門菌DNA的引物序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；用於擴增志賀菌DNA的引物序列SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；用於擴增大腸埃希氏菌DNA的引物序列SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；用於擴增銅綠假單胞菌DNA的引物序列SEQ ID NO.11。
全文摘要
本發明描述了一種利用聚合酶鏈式反應(PCR)技術檢測藥品中主要病原微生物的方法，特別涉及一種利用聚合酶鏈式反應特異性擴增主要病原微生物的特定的基因片段來檢測藥品中主要病原微生物的方法，和用於PCR的新的核酸引物，引物所擴增的基因片段可以用於檢測藥品中金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門菌、志賀菌、銅綠假單胞菌，以及涉及用於檢測PCR產物的探針和DNA晶片以及包含該DNA晶片的試劑盒。
文檔編號C12Q1/04GK1514022SQ0313764
公開日2004年7月21日 申請日期2003年6月19日 優先權日2003年6月19日
發明者胡昌勤, 馬越, 李景雲, 張力, 張新妹 申請人:中國藥品生物製品檢定所