一種土壤線蟲dna提取方法

2023-06-05 05:58:06

專利名稱：一種土壤線蟲dna提取方法
技術領域：
本發明涉及動物DNA提取，具體為一種土壤線蟲DNA提取方法。
背景技術：
在眾多的土壤動物中，線蟲是數量和功能類群最豐富的一類。因其形態特殊 性、食物專一性、分離鑑定相對簡單，以及對環境變化能做出較迅速的響應等特 點，可將其作為土壤汙染效應研究的指示生物。線蟲作為指示生物的優越性之一 是易於進行形態鑑定，但是鑑定到種的水平還存在著許多困難。另一個影響線蟲 作為指示生物的障礙是樣品的數量問題，增加樣品的分析量會提供更詳盡的空間
信息；但是增加樣品在時間和空間上的重複也就意味著增加樣品分析的工作量。 由於形態學方法鑑定線蟲數目有限，且對線蟲形態分類專業知識要求較高，限制 了更多的土壤生態學者從事線蟲生態研究。因此， 一些學者嘗試利用分子生物學
手段開發出一種簡單、快速的線蟲鑑定方法。Foucher和Wilson (2002)運用變 性梯度凝膠電泳(DGGE)技術來鑑別混合樣品中的線蟲種屬，並提出該方法相對 於形態學方法更為便捷,且不需要專業的分類學知識。Waite等(2003)利用DGGE 方法測定了歐洲6種草地土壤線蟲多樣性，但沒有將變性梯度凝膠電泳的結果與 形態分析進行比較，這種方法本身的精確性還有待於進一步驗證。Foucher等 (2004 )則對Waite等的方法進行了改進，在提取DNA之前，先把線蟲從土壤中 提取出來；此方法不但可以分析更多的土壤樣品，而且還可以減小擴增非目標生 物的風險。應用分子生物學技術需要注意以下方面l)有效地提取DNA使之可以 代表整個群落；2)提供定量或半定量分組數據使之可以進行群落功能分析；3) 具有處理大量樣品的能力。因此，藉助分子生物學技術，建立一種土壤線蟲DNA 提取方法，對於提高土壤線蟲鑑定效率和準確性都具有十分重要的現實意義，有 著廣闊的應用前景。

發明內容
本發明目的在於提供一種土壤線蟲DNA提取方法。 為了實現上述目的，本發明採用的技術方案如下
土壤線蟲DNA提取方法將提取的土壤線蟲懸液在60-65°C, 2-3分鐘下溫和 熱殺死，將溫和熱殺死的土壤線蟲懸液濃縮後加入其0. 4倍體積的細胞裂解緩衝 液進行凍融處理，再在每微升濃縮后土壤線蟲懸液中加入20 pg的蛋白酶K於 36-38'C下140-160轉/分鐘震蕩1-2小時進行保溫消化；而後將保溫消化的線蟲 溶液與等體積的氯仿和異戊醇混合液混合於室溫下，以12000轉/分鐘離心10-12 分鐘，提J^K相再加A7K相0.1 <沐積的NaAc和0. 6 ^沐積異丙醇混合，於(TC
3靜置2-3小時，再以於4。C下14000-15000轉/分鐘離心20分鐘，沉澱即為土壤 線蟲DNA。
所述土壤線蟲的提取為將樣品淘洗，分別經過60目和400目網篩，而後在樣 品中加入過量的硫酸鎂以2000轉/分鐘離心4-5分鐘，將懸浮於硫酸鎂溶液中的 樣品提取出來。所述溫和熱殺死的土壤線蟲懸液按照1: 4的比例濃縮而後加入細 胞裂解緩衝液；所述凍融處理先將懸液在-65'C下放置10分鐘，再於65'C下放 置10分鐘為一次凍融處理;所述細胞裂解緩衝液於室溫下保存，其組成為100 mM Tris、100mMEDTA和1. 5 MNaCl, pH 8. 0;所述加入蛋白酶K後的終濃度為80-100 網/ml。所述氯仿和異戊醇混合液中氯仿與異戊醇體積比為24:1;所述NaAc濃度 為3M，異丙醇為預冷-2(TC。所得土壤線蟲DNA自然乾燥後將其溶於TE溶液於-20 'C下保存備用。
本發明具有以下優點
1. 較低廉，發明沒有釆用DNA提取試劑盒，故成本較低廉，適於線蟲群落 DNA的提取。
2. 發明釆用物理、化學、酶法相結合方法對線蟲細胞進行裂解，提高了土壤 線蟲DNA提取率。
3. 發明釆用先從土壤樣品中提取線蟲，然後再從線蟲懸液中提取DNA的方 法，避免了後續進行PCR時非靶生物DNA的擴增。


圖l不同施肥下線蟲DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測圖(其中Mark:標準；CK:不 施肥；NP:單施化肥N+P; M:單施有機肥；顧P:化肥與有機肥配施)。
具體實施例方式
本發明採用淘洗-過篩-硫酸鎂梯度離心方法將線蟲從土壤樣品中提取出來，
用加熱方法將其殺死，得到線蟲懸液；然後，在線蟲懸液中先加入細胞裂解緩衝 液進行凍融處理，再加入蛋白酶進行保溫消化；分別採用氯仿、異戊醇抽提DNA 和NaAc、異丙醇沉澱DNA,室溫下自然千燥，即可得到土壤線蟲DNA。
實施例1
土壤線蟲獲取將樣品鮮土淘洗，取200 g淘洗鮮土倒入水盆中，加水攪勻， 靜置l分鐘，倒入一組網篩，上層為60目，下層為400目，邊倒邊振蕩分樣篩， 防止水分充滿下層400目篩而從篩中溢出，然後再在盆中加入水後混勻，靜置l 分鐘，倒入網篩中，如此重複3次，將400目分樣篩取下，用噴頭把400目網 篩中的線蟲懸液中的泥漿衝洗乾淨，倒入另一燒杯中，靜置24小時。將靜置燒 杯中的上層水輕輕倒掉，只保留大約30ml下層水、線蟲和泥漿的混合物。將混 合物輕輕搖勻，倒入離心管中，準備第一次離心，轉速2000轉/分鐘，時間定為 4-5分鐘，離心完畢後取出離心管，小心倒掉上層液，保留土層，由於線蟲的比 重約為l. 08 g/cm3，比水的比重略大，故線蟲與泥土層混在一起。在離心管中注入比重為1. 15 g/cm3的硫酸鎂溶液約10ml，進行第二次離心，由於線蟲比重比 硫酸鎂溶液的比重小，故與泥土分離，懸浮於硫酸鎂溶液中，而泥土由於比重較 大而沉入離心管底層，離心完畢後，把離心管內的上層液倒入500目篩中，用水 把硫酸鎂液衝掉，然後把線蟲液衝入燒杯中，隨後轉入試管中，靜置24小時以 上，以便線蟲沉澱。
將提取的土壤線蟲懸液在6(TC, 2-3分鐘下溫和熱殺死，其中先將水洛鍋溫 度設定為6(TC,把靜置l小時以上的試管中的上層水小心抽出，只保留大約2-3 ml)，將溫和熱殺死的土壤線蟲懸液1000 pi,在室溫下8000轉/分鐘離心5分鐘， 進行濃縮，棄去上面的750 保留下面的250 pl液體，而後加入100 pl細胞裂 解緩衝液進行凍融處理，其中先在-65。C下放置10分鐘，再於65X:下放置10分鐘 為一次凍融處理，再加入1.75 pl蛋白酶K (20 pg/Vl)於36i:下140轉/分鐘 震蕩1小時進行保溫消化；而後將保溫消化的線蟲溶液與等體積的氯仿和異戊醇 混合液輕輕混合於室溫下，以12000轉/分鐘離心10分鐘，提^/Jc相再加入水相 0.1^fr積的NaAc和0. 6倍體積異丙醇輕輕混合，於0。C靜置2小時，再以於4 。C下14000轉/分鐘離心20分鐘，沉澱即為壤線蟲DNA。所述沉澱將離心管於室 溫倒置，使沉澱自然乾燥，將沉澱溶於50 ^tl TE溶液。-2(TC下保存備用。所述 TE溶液的成分和濃度為:10 mM Tris + 1 mM EDTA， pH 8. 0。
實施例2
與實施例l不同之處在於
土壤線蟲的提取為將樣品淘洗，分別經過60目和400目網篩，而後在樣品中 加入過量的硫酸鎂以2000轉/分鐘離心5分鐘，將懸浮於硫酸鎂溶液中的樣品提 取出來。
將提取的土壤線蟲懸液在65'C, 2-3分鐘下溫和熱殺死，將溫和熱殺死的土 壤線蟲懸液按照1: 4的比例濃縮而後加入其0. 4倡體積的細胞裂解緩衝液進行凍 融處理，再在每微升濃縮后土壤線蟲懸液中加入20 pg的蛋白酶K於38X:下160 轉/分鐘震蕩2小時進行保溫消化;而後將保溫消化的線蟲溶液與等體積的氯仿和 異戊醇混合液混合於室溫下，以12000轉/分鐘離心12分鐘，提取水相再加入水 相0.H沐積的NaAc和0.6^沐積異丙醇混合，於(TC靜置2. 5小時，再以於4 。C下15000轉/分鐘離心20分鐘，沉澱即為土壤線蟲DNA。所述加入蛋白酶K後 的終濃度為100 pg/ml。
實施例3
與實施例l不同之處在於
土壤線蟲的提取為將樣品淘洗，分別經過60目和40Q目網篩，而後在樣品中 加入過量的硫酸鎂以2000轉/分鐘離心5分鐘，將懸浮於硫酸鎂溶液中的樣品提 取出來。將提取的土壤線蟲懸液在63。C, 2-3分鐘下溫和熱殺死，將溫和熱殺死的土 壤線蟲懸液按照1: 4的比例濃縮而後加入其0. 4倍休積的細胞裂解緩衝液進行凍 融處理，再在每微升濃縮后土壤線蟲懸液中加入20 pg的蛋白酶K於37'C下150 轉/分鐘震蕩1.5小時進行保溫消化;而後將保溫消化的線蟲溶液與等體積的氯仿
和異戊醇混合液混合於室溫下，以12000轉/分鐘離心ii分鐘，提m^相再加入
水相O. l倍體積的NaAc和0.6倍體積異丙醇混合，於(TC靜置3小時，再以於4 'C下14500轉/分鐘離心20分鐘，沉澱即為土壤線蟲DNA。所述加入蛋白酶K後
的終濃度為100 Mg/ml。 應用例
取不同施肥處理(CK:不施肥；NP:單施化肥N+P; M:單施有機肥；MNP: 化肥與有機肥配施)土壤樣品各200 g採用本發明的方法進行土壤線蟲DNA提取, 即可得到不同施肥處理下的土壤線蟲DNA。
利用Biophotometer (E卯endorf,德國)測定樣品DNA含量(見表1 )，利 用瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA質量(參見圖1 )。由表1和圖1可知，DNA濃 度在CK處理下為15 jig/ml, NP處理下為20 pg/ml, M處理下為45 (ig/ml，應P 處理下為30(ig/ml。各處理下提取的DNA條帶均較清晰，無雜帶，表明其質量較 好；片段大小在18kb左右。
表1不同施肥處理下土壤線蟲DNA濃度(單位lag/ml)
不同施肥處理不施肥單施化肥單施有機肥化肥與有機肥配施
(CK)(NP)(M)(MNP)
DNA濃度15204530
權利要求
1.一種土壤線蟲DNA提取方法，其特徵在於將提取的土壤線蟲懸液在60-65℃，2-3分鐘下溫和熱殺死，將溫和熱殺死的土壤線蟲懸液濃縮後加入其0.4倍體積的細胞裂解緩衝液進行凍融處理，再在每微升濃縮后土壤線蟲懸液中加入20μg的蛋白酶K於36-38℃下140-160轉/分鐘震蕩1-2小時進行保溫消化；而後將保溫消化的線蟲溶液與等體積的氯仿和異戊醇混合液混合於室溫下，以12000轉/分鐘離心10-12分鐘，提取水相再加入水相0.1倍體積的NaAc和0.6倍體積異丙醇混合，於0℃靜置2-3小時，再以於4℃下14000-15000轉/分鐘離心20分鐘，沉澱即為土壤線蟲DNA。
2. 按權利要求1所述的土壤線蟲DNA提取方法，其特徵在於所述土壤線蟲 的提取為將樣品淘洗，分別經過60目和400目網篩，而後在樣品中加入過量的硫 酸鎂以2000轉/分鐘離心4-5分鐘，將懸浮於硫酸鎂溶液中的樣品提取出來。
3. 按權利要求1所述的土壤線蟲DNA提取方法，其特徵在於所述溫和熱殺 死的土壤線蟲懸液按照1: 4的比例濃縮而後加入細胞裂解緩衝液;所述凍融處理 先將懸液在-65'C下放置10分鐘，再於65'C下放置10分鐘為一次凍融處理；所 述細胞裂解緩衝液於室溫下保存，其組成為lOOmMTris、 100 mM EDTA和1. 5 M NaCl, pH 8.0;所述加入蛋白酶K後的終濃度為80-100 pg/ml。
4. 按權利要求1所述的土壤線蟲DNA提取方法，其特徵在於所述氯仿和異 戊醇混合液中氯仿與異戊醇體積比為24:1;所述NaAc濃度為3M,異丙醇為預冷 -20°C。
5. 按權利要求1所述的土壤線蟲DNA提取方法，其特徵在於所得土壤線蟲 DNA自然乾燥後將其溶於TE溶液於-2(TC下保存備用。
全文摘要
本發明涉及動物DNA提取，具體為一種土壤線蟲DNA提取方法。採用淘洗-過篩-硫酸鎂梯度離心方法將線蟲從土壤樣品中提取出來，用加熱方法將其殺死，得到線蟲懸液；然後，在線蟲懸液中先加入細胞裂解緩衝液進行凍融處理，再加入蛋白酶進行保溫消化；分別採用氯仿、異戊醇抽提DNA和NaAc、異丙醇沉澱DNA，室溫下自然乾燥，即可得到土壤線蟲DNA。本發明採用物理、化學、酶法相結合方法對線蟲細胞進行裂解，提高了線蟲DNA提取率。成本較低廉，適於土壤線蟲群落DNA的提取。
文檔編號C12N15/10GK101580830SQ20081001141
公開日2009年11月18日 申請日期2008年5月15日 優先權日2008年5月15日
發明者張曉珂, 琪 李, 李風平, 梁文舉 申請人:中國科學院瀋陽應用生態研究所