一株異常威克漢姆酵母菌及其應用的製作方法
2023-06-05 05:45:36
本發明涉及一株異常威克漢姆酵母菌及其在滇橄欖果酒發酵中的應用，屬於微生物技術領域。
背景技術：
我國是世界上最大的水果生產國，但水果深加工業卻一直很薄弱。果酒是以水果為原料經過發酵而成的低度飲料酒，富含糖、有機酸、酯類及多種維生素。果汁中的主要成分是糖類，酵母菌則是以糖類物質作為基質進行發酵，生成酒精和一定量的香味物質。所以酵母品種是釀造果酒的關鍵因素之一，酵母性狀的好壞直接影響到所釀果酒的口感和風味，決定果酒品質的優劣。
滇橄欖 (Phyllanthus emblical L)是大戟科葉下珠屬(Phyllanthus)落葉喬木的果實，又名餘甘子、庵摩樂果、油甘子、圓橄欖，是一種獨特的生長於中國亞熱帶、熱帶的部分地區，特別是乾熱河谷地區落葉喬木或灌木的資源植物，在國內其分布及數量在雲南、福建、四川等地為多，在雲南廣布於海拔900～l400m的元江、怒江、瀾滄江、南盤江、金沙江等流域，屬少見的喬木類型，系全屬750種植物中唯一具有核果、染色體為四培體的植物。中醫學認為滇橄欖味甘、酸、澀，性涼，具有清熱生津、清咽利嗓、止咳化痰、保肝解毒、健胃消食等功效。現代醫學證實其具有抗氧化、抗衰老、抗癌、抗菌、消炎等作用。
滇橄欖先後已經開發出治療性藥品及系列飲料和果脯。但滇橄欖果酒作為一種保健酒的開發尚屬起步階段，因滇橄欖含有大量的單寧、鞣酸，苦澀味很重，現有的產品消費者很難接受。徐國雄等人研究的滇橄欖酒生產工藝中，通過加入0.4%的NaOH和0.1～0.2克每升的亞硫酸鈉進行脫澀處理，發酵後除澀效果不是很明顯。
張煜行等人研究出了一種異常威克漢姆酵母HJY-006在白酒生產中的應用，該菌株既能有一定的酒精產量，又能很好地滿足白酒對酯香的要求。王松等人研究出了一種能分解果膠的異常威克漢姆酵母，可使釀造的果酒更清澈有光澤，感官品質得到提升。但關於異常威克漢姆酵母在增香除澀方面鮮有報導。本發明以滇橄欖為原料，以發酵後果酒中單寧含量和口感品質作為指標，篩選出了一株異常威克漢姆酵母菌。
技術實現要素：
本發明從採集至雲南保山的一種滇橄欖果實表面上，採用微生物分離純化的方法，獲得了一株異常威克漢姆酵母菌（Wickerhamomyces anomalus）G1，其保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2016年9月20日，保藏編號為CGMCC No.13050，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。
本菌株分離所用的培養基為YPD培養基，培養基成分為：酵母粉10.0g、蛋白腖 20.0g、葡糖糖20.0g、瓊脂20.0g、蒸餾水1000mL。
本發明中所述的異常威克漢姆酵母菌Wickerhamomyces anomalus G1具有以下微生物學特徵：
1、形態學特徵：細胞個體呈圓形，生長方式為出芽生殖；菌落呈乳白色，球形凸起，表面溼潤、有光澤，不透明，奶油狀；
2、生理生化特徵：本發明中Wickerhamomyces anomalus G1與相似度最高菌株異常威克漢姆酵母 SX1的生理生化特徵比較結果見表1，使用杭州微生物試劑有限公司的酵母樣真菌生化鑑定管所得出；通過挑取單菌落穿刺至培養基中部，在28℃培養24h左右，通過培養基顏色的變化判斷是陰性還是陽性，註：「+」表示陽性；「-」表示陰性。結果表明Wickerhamomyces anomalus G1在碳源上能利用甘油、澱粉和檸檬酸，而異常威克漢姆酵母 SX1不能利用。
表1 Wickerhamomyces anomalus G1與異常威克漢姆酵母 SX1的生理生化特徵比較
；
3、菌株的18SrDNA的鑑定：
提取菌株的總DNA，用酵母菌18SrDNA通用引物擴增目的片段，對片段進行回收、克隆、測序。對酵母菌18SrDNA基因片段序列使用NCBI的BLAST進行18SrDNA的相似性比對，結果顯示與Wickerhamomyces anomalus SX1的相似度最高，達到99%，鑑定它是異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus） ，命名為Wickerhamomyces anomalus .G1。
本發明應用異常威克漢姆酵母G1和市售葡萄酒高活性乾酵母RV171用於滇橄欖果酒釀造，分別對釀造後果酒的品質指標及單寧殘留含量測定，綜合分析得出異常威克漢姆酵母G1對滇橄欖果酒具有增香除澀等功效。
本發明的優點及應用前景：
將本發明異常威克漢姆酵母G1與市售葡萄酒高活性乾酵母RV171在酵母產酒精能力、降解單寧能力及感官評定進行比較，發現本發明酵母菌的發酵能力強、發酵所得滇橄欖果酒品質優，回甘明顯，能增香除澀，具有典型的滇橄欖果香和風味；利用異常威克漢姆酵母G1釀造的滇橄欖果酒，品質良好，具有良好的市場應用前景。
附圖說明
圖1 異常威克漢姆酵母G1發酵滇橄欖酒的氣質圖譜；
圖2市售葡萄酒高活性乾酵母RV171發酵滇橄欖酒的氣質圖譜。
具體實施方式
下面通過附圖和實施例對本發明作進一步詳細說明，但本發明保護範圍不局限於所述內容，實施例中方法如無特殊說明的均為常規方法，使用的試劑如無特殊說明為常規市售試劑或按常規方法製得的試劑。
實施例1：異常威克漢姆酵母菌株G1的分離篩選
1、樣品為從雲南保山採集得到的成熟滇橄欖果實，取10顆帶有果香味的滇橄欖裝入錐型瓶中，用200mL無菌水震蕩清洗果實表面，從中取10mL濁水在2000r/min下離心5min，吸取0.1mL上清液塗布均勻於裝有固體YPD培養基的培養皿上，28℃下恆溫培養2d；
2、從中挑取直徑約為2mm的乳白色凸起單菌落，在無菌操作臺上，挑取選定的20個單菌落劃線接種於YPD固體培養基上，28℃下培養2d。待長出後從中挑取6個乳白色，球形凸起，表面溼潤、有光澤，不透明，奶油狀菌落接種到YPD液體培養基中，28℃下搖床培養24h。
3、分別吸取10ml菌液加入到250ml滇橄欖汁中，並加入50g紅糖，在22℃室溫下厭氧發酵8d。通過測量這6株菌發酵滇橄欖酒的品質指標及感官分析，篩選出增香除澀最明顯的那株菌。
4、提取該菌株的總DNA，用酵母菌18SrDNA通用引物擴增目的片段，對片段進行回收、克隆、測序，序列如SEQ ID NO：1所示，對酵母菌18SrDNA基因片段序列使用NCBI的BLAST進行18SrDNA的相似性比對， 結果顯示與Wickerhamomyces anomalus SX1的相似度最高，達到99%，鑑定它是異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus），命名為Wickerhamomyces anomalus.G1。
本菌株分離所用的培養基為YPD培養基，培養基成分為：酵母粉10.0g、蛋白腖 20.0g、葡糖糖20.0g、瓊脂20.0g、蒸餾水1000mL。
實施例2：異常威克漢姆酵母菌株G1用於滇橄欖果酒釀造，其步驟為：
1、原料處理：選用雲南保山成熟的滇橄欖果實為原料，清洗→晾乾→粉碎打成汁→過濾→得到滇橄欖汁。
2、主發酵：在已滅菌的6瓶500mL容量瓶中各添加滇橄欖汁250mL，分為兩組，即實驗組和對照組，每組3瓶。將異常威克漢姆酵母G1與市售葡萄酒高活性乾酵母RV171擴培後分別按6%（2×108cfu/mL）體積比添加到不同組中，同時加入50g紅糖，將這兩組發酵瓶放置在22～25℃室溫下密封發酵8d（前3d進行有氧發酵，後5d進行無氧發酵），即得滇橄欖果酒發酵原液。
3、澄清保藏：分別按10:1的比例加入1%（g/mL）濃度的明膠溶液，即在250mL的滇橄欖果酒發酵原液中加入25mL的1%明膠溶液，攪拌30min後靜置2h，過濾取上清液；將澄清的上清液放置在65℃水浴鍋中消毒15min，待冷卻後裝瓶密封保存在乾燥陰涼處。
實施例3：異常威克漢姆酵母菌株G1發酵滇橄欖果酒品質的指標測定
指標測定方法：糖度測定：糖度計；pH的測定：pH酸度計；酒精體積分數的測定：蒸餾法和酒精計。
指標測定結果：用異常威克漢姆酵母G1所釀造的果酒，其pH為3.19，糖度為10.0%，酒精體積分數為14.5%，三項指標顯示該發酵液已達到GB 15038-2006果酒國標要求。與乾酵母RV171相比，菌株G1產酒精能力更強，降酸更明顯。
表2 滇橄欖果酒品質的指標測定結果
。
實施例4：異常威克漢姆酵母菌株G1發酵滇橄欖果酒的感官評定
將兩組滇橄欖果酒發酵原液請10位評委品嘗，參照GB 15038-2006葡萄酒、果酒通用分析方法中的感官評分標準打分（表3），得出異常威克漢姆酵母菌株G1發酵的滇橄欖果酒口感要優於市售葡萄酒高活性乾酵母RV171。用異常威克漢姆酵母G1所釀造的果酒顏色為棕黃色，酒體具有純正和諧的滇橄欖果香，口味清爽細膩，酒體豐滿，回甘明顯，具有滇橄欖獨特的典型性，結果見表4。
表3 滇橄欖果酒感官評分標準
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表4 ：兩組菌株發酵滇橄欖果酒後的感官評分
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實施例5：異常威克漢姆酵母菌株G1單寧降解能力的測定：
取這兩組發酵原液各10mL在2000r/min下離心10min，取上清液保存備用；同理取等體積的新鮮滇橄欖汁作為空白組；參照單寧含量試劑盒說明書用分光光度計分別測量這三組的單寧含量；分光光度計預熱30min，調節波長至760nm，蒸餾水調零；
結果表5得出本發明異常威克漢姆酵母菌G1發酵的滇橄欖酒中單寧含量為37.89μg/mL，比市售葡萄酒高活性乾酵母RV171發酵的滇橄欖酒和新鮮滇橄欖汁中的單寧含量都要低，說明酵母菌G1降解單寧的效果好。
表5 兩組菌株發酵滇橄欖果酒後的單寧含量
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實施例6：滇橄欖果酒中香味成分的GC-MS分析
取這兩組滇橄欖酒發酵原液各10mL，在2000r/min下離心10min，取上清液分別裝入到兩個50mL容量的分液漏鬥中，再分別加入10mL石油醚，上下搖勻後靜置萃取，將萃取出的上清液裝入到50mL規格的旋蒸瓶中，在35℃下抽真空慢慢旋蒸，直至旋蒸瓶中剩餘1mL溶液，取出並用0.45μm濾膜過濾保存備用；將濾液在GC-MS (Agilent GC7890B/MS5977A)氣-質聯用儀上分析。
GC條件：色譜柱為HP-5（30m*0.32mm*0.25um），進樣口溫度250℃，分流比40:1，進樣量1μl，起始柱溫40℃，保持1min，以5℃/min升溫至130℃，保持5min，再以5℃/min升溫至220℃，保持5min，再以10℃/min升溫至280℃，保持1min。
MS條件：傳送線溫度：250℃，四級杆溫度：150℃，離子源電影70ev，全掃描模式，掃描範圍：50-550。
結果如表6、7，可知Wickerhamomyces anomalus G1發酵後的果酒中香味物質成分更多，主要香味物質苯乙醇、環辛四烯、鄰苯二甲酸二丁酯等成分含量更高；結果表明了異常威克漢姆酵母G1發酵的滇橄欖果酒擁有更豐富的果香和酒香圖（1、2）。
表6：異常威克漢姆酵母G1發酵滇橄欖酒的主要香氣成分分析結果
表7：市售葡萄酒高活性乾酵母RV171發酵滇橄欖酒的主要香氣成分分析結果
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序列表
昆明理工大學
一株異常威克漢姆酵母菌及其應用
1
PatentIn version 3.3
1
1040
DNA
Wickerhamomyces anomalus G1
1
tttcgaacca aagactttga tttctcgtaa ggtgccgagt gggtatataa aaaacaccac 60
ccgatcccta gtcggcatag tttatggtta agactacgac ggtatctgat catcttcgat 120
cccctaactt tcgttcttga ttaatgaaaa cgtccttggc aaatgctttc gcagtagtta 180
gtcttcaata aatccaagaa tttcacctct gacaattgaa tactgatgcc cccgaccgtc 240
cctattaatc attacgatgg tcctagaaac caacaaaata gaaccaaacg tcctattcta 300
ttattccatg ctaatatatt cgagcaaagg cctgctttga acactctaat tttttcaaag 360
taaaagtcct ggttcgcctg ccccgagaga caggttagcc agaaggaaag gctcggtcag 420
gaccagtaca cgcaaaaaag cggaccggct gaccaagccc aaagttcaac tacgagcttt 480
ttaactgcaa caactttaat atacgctatt ggagctggaa ttaccgcggc tgctggcacc 540
agacttgccc tccaattgtt cctcgttaag gtatttacat tgtactcatt ccaattacaa 600
gacccaaatg ggccctgtat cgttatttat tgtcactacc tccctgaatt aggattgggt 660
aatttgcgcg cctgctgcct tccttggatg tggtagccgt ttctcaggct ccctctccgg 720
aatcgaaccc ttattccccg ttacccgttg aaaccatggt aggccactat cctaccatcg 780
aaagttgata gggcagaaat ttgaatgaac catcgccgac acgaagtcat gcgattcgaa 840
aagttattat gaatcatcaa agagctcaga agagcattga ttttttatct aataaataca 900
ccccttccaa acagtcgggg tttttagcat gtattagctc tagaattacc acggttatac 960
caagtagtaa aggtactatc aaataaacga taactgattt aatgagccat tcgcagtttc 1020
actgtataaa ttgctatact 1040