肺結核疫苗的製作方法

2023-06-04 23:14:21 2

專利名稱：肺結核疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種屬於分枝桿菌(Tl^coZ^"er/wm )屬的分離樣i生 物，其特徵在於，其包括賦予PhoP-表型的Rv0757基因的失活和防 止DIM產生(DIM-表型)的第二基因的失活。另外，本發明包括背景技術現在已經證實，4吏用疫苗來預防人類肺結核成為將近一個世紀 以來的巨大才兆戰。來源於牛分枝桿菌(M6ov&)的卡介苗(BCG) 是目前唯一在使用的肺結核疫苗並且是世界範圍內^f吏用最廣泛的 疫苗。自20世糹己20年代開始，BCG疫苗的發展和普遍使用呈現顯 著的進步，具有能夠將肺結核從世界根除的前景。但是，這些最初 的希望並沒有實現，而且由大量的效力試馬全的結果可以清楚，在這 種疾病已成為地方性疾病的第三世界地區中，現有形式的BCG疫 苗在控制疾病、特別是成年人呼吸形式的疾病中的使用是有限的 [4]。隨著對結核分枝桿菌(M /w&rcw/a^)的毒性和導致保護性免 疫產生的免疫反應模式的越來越多的了解，使得開發優於BCG的 疫苗成為可能。當對宿主4妄種BCG時可獲得4交高的保護水平，這 一發現表明存活力和持久力是肺結核疫苗成功所必需的基本特性。 在本發明中，我們4吏用具有失活的Rv0757 (p/zoP )基因和p/zo屍 的第二獨立突變(其防止DIM的合成)的結核分枝桿菌菌抹作為 原型單劑量活疫苗，而且我們已指出，它在免疫低下的SCID小鼠中比BCG更能被減毒，且在小鼠中產生的保護水平與BCG所產生 的相當，並且在豚鼠中產生比BCG更高的保護。p/zoP基因和p/^W —起形成的雙組分系統的部分，表現出與控 制胞內病原體的關4建毒力基因轉錄的其它雙組分系統的高度相似 性。它還控制許多其它並非直接參與毒力的基因表達[19]。去除毒 力基因本質上似乎並不是結核分枝桿菌減毒的唯一方法。已經表 明，不能重新合成泛酸的結核分枝桿菌的泛酸營養缺陷型突變體， 在SCID小鼠中持續存在，但不會導致疾病發生[17]。單獨的亮氨 酸營養缺陷型，其毒力也被大大減弱且不能在SCID小鼠中進行體 內複製[28]。因此，現在普遍4妄受這樣的原則基於結核分枝桿菌 的疫苗林可成功地被減毒，同時保留在牛分枝桿菌BCG中被抑制 的基因。過去，對於比BCG更有效的疫苗的研究基於這樣的觀念BCG 毒力的喪失本質上是促進其完全保護效力缺失的一個因素[32]。因 此推i侖為結核分枝桿菌的新型減毒突變體，具有4交少的毒力，可 能成為更加有效的疫苗。然而，近期的研究顯示，自然感染結核分 枝桿菌和接種BCG在其產生抗肺結核的保護性免疫的能力上沒有 差異[34]。這提出了關於是否可能通過結核分枝桿菌的合理減毒來 改良BCG的問題。在這種情況下，發現在SCID小鼠模型中，具有 兩個獨立突變(1, PhoP蛋白質合成和2,DIM合成)的組合的本發 明的突變結核分枝桿菌菌4朱，即4吏當以高於BCG 10倍的劑量4吏用 時，相比BCG也更能被減毒，並且在豚鼠模型中具有比BCG更高 的保護程度，這些發現特別出乎預料並且具有重要的意義。發明內容本發明的第 一 個方面涉及 一 種屬於分枝桿菌屬的分離微生物， 其特4i在於包4舌Rv 0757(/ /zo屍)基因的失活和防止DIM( phthioceroldimycocerosates )產生的第二基因的失活。在下文中，該分離樣i生 物將被稱為本發明的微生物。本發明的第二個方面涉及一種屬於分枝桿菌屬的分離微生物， 其特;f正在於包^舌，^f吏Rv 0757 (p/zoP )基因和防止DIM產生的； /zo屍 的第二獨立突變失活。在本發明的優選方面中，所述的第二突變是 在Rv2930 基因中，包括DIM合成所必需的/adZ)26基因 的缺失。本發明的第三個方面涉及使用本發明的分離微生物來製備用 於預防動物肺結核、並且更加優選地用於預防人類肺結核的疫苗的 應用，以及肺結核疫苗目前在治療人類疾病如膀胱癌中所具有的其 它用途。以下在本發明的情況中，"結核分枝桿菌S02菌抹"用來表示 已通過Rv0757基因而失活並另外包4舌防止DIM (結核菌醇二蔗蠟 酸酯，phthiocerol dimycocerosates)產生的第二基因的失活的結核 分枝桿菌菌林的分離微生物，其中Rv0757基因是由結核分枝桿菌 MT103臨床菌才朱，才艮才居Pelicic等(1997 ) ( Efficient allelic exchange and transposon mutagenesis in Afyco^c/er/ww fw6ercw/os7'51.屍rac iVa// /4cat/Sc/ tASM 94: 10955-10960 )所4皮露的方法，利用同源重糹且在結 核分枝桿菌的Rv0757基因的^^//位點插入卡那黴素抗性標記構建 而成。因此，本發明的所述菌4朱在來源於結核分鬥支桿菌的存活減毒 疫苗中表現為兩個獨立的突變，獨立的p/zoP突變不會影響源自所 述基因的失活的疫苗的特性。實施例9糹皮露了如何構建具有獨立雙 突變的分枝桿菌屬分離微生物，其產生與披露的結核分枝桿菌S02 菌才朱相同的表型。以下在本發明的情況中，疫苗將用來表示的藥物，其給藥對所 要預防的疾病可產生防雄卩。以下在本發明的情況中，BCG將用來表示自1921年以來被用 於4氐抗肺結核的現有疫苗。它是來源於牛分枝桿菌菌一朱的存活減毒 疫苗，其中該牛分枝桿菌菌抹在實驗室傳代培養後喪失了毒力，並 且現在我們知道其具有一百多個缺失基因(5)。以下在本發明的情況中，H37Rv 一尋用來表示已經;故測序的致 病結核分枝桿菌菌抹，Cole等將這些基因表示為Rv (Ref Cole W a/ 1998 Deciphering the biology of Afyco6a"e"'ww ZwZwcw/as7、 from the complete genome sequence. iV^we 393: 537-544)。以下在本發明的情況中，MT103將用來表示結核分枝桿菌臨 床分離菌(參考文獻15 Camacho等)。以下在本發明的情況中，DIM-菌林將用來表示不能夠合成與 結核分枝桿菌的致病性相關的重要脂質，結核菌醇二蔗蠟酸酯的結 核分枝桿菌複合菌群(complex)的菌4朱。在圖11中使用1A29菌 才朱，其由MT103菌才朱組成，其中Rv2930 (fadD26)基因通過在參考 文獻15 (Camacho a/. 1999 Identification of a virulence gene cluster of A^coZ a"er/wm fw6ercw/osfs by signature-tagged transposon mutagenesis. Afo/ M/cra6/o/ 34: 257-267)中披露的轉座子1096而失 活。以下在本發明的情況中，S02+ pS05將用來表示結核分枝杆 菌S02菌4朱，其中尺v0757突變通過具有分枝桿菌p/2o屍基因的復 制型質粒的轉化而被尺W 757基因補償，但是它不能補償DIM合成， 它的表型為phoP+ DIM-。以下在本發明的情況中，結核分枝桿菌phoP-將用來表示由於 WW75 7基因在7 "W B^五/位點之間的缺失而失活的結核分枝4幹 菌菌4朱，它的表型為phoP-DIM+。以下在本發明的情況中，Rv2930 (/^/Z)26)將用來表示位於負責 合成結核菌醇二蔗蠟酸酯的操縱子的起點的基因(參考文獻15 Camacho等1999),並且在結核分枝桿菌中去除該基因可產生穩定 的DIM-表型。


圖1蛋白質印跡分衝斤(Western BlotAnalysis)。 MT103、本發明的S02菌株和BCG Pasteur的胞外蛋白4是取物的蛋白質印跡圖，其 中使用獲得的抗PhoP和ESAT-6的多克隆抗體。MT103菌林具有 ESAT6+和phoP+表型，S02菌才朱具有PhoP畫和ESAT6 +表型， BCG疫苗菌4朱是PhoP+和ESAT6-。圖2本發明的S02菌#^ SCID小鼠中的減務ft用。",噴霧感 染有20CFU的S2、由pS05 (S02 + pS05)氺卜j嘗的S02和MT103 的SCID小鼠(n=10)的存活率曲線。存活天數的平均值為多於245 (S02)、 62.1±5.88 (S02十pS05)詳口 36.7±0.67 (MT103)天。通過噴 霧感染S02菌林的小鼠存活了 245個實驗日，而那些感染MT103 和由p/zo屍補償的S02菌4朱的小鼠在62天以前死亡。A,通過l爭月永注 射感染5.4 x 106 CFU的S02和2 x 105 CFU的BCG Pasteur的SCID 小鼠(n=7)的存活率曲線。這表明S02菌林的減毒水平高於目前 用於人類的肺結核疫苗BCG。圖3接種本發明的S02菌林和BCG的小鼠中的細J包免j^應。Balb/c小鼠通過皮下注射4妄種8 x 103 CFU的BCG (Phipps)或 2.5 x 103CFU的本發明的S02菌林。結果表示為在接種之後每隔 一段時間脾中的總CD4+ZCD8+群體的百分比，以及在由完全結核 分枝桿菌抗原刺激之後總CD4+/ CD8+群體中表達IFN- Y的糹田月包的 百分比。*表示在特定的時間點上組間統計學上的顯著性差異(p< 0.005)。細胞免疫結果顯示，與接種BCG的小鼠相比，接種S02菌才朱的動物中的CD4+淋巴細胞的數量在14、 30、 45和60天較高， 並且在45天和60天抗結核分枝桿菌抗原的特異性IFN Y的產量顯 著。與接種BCG的小鼠相比，接種S02菌林的動物中的CD8+淋 巴細力包的悽t量在45天和60天一交高，並且在14天抗結核分枝4幹菌 抗原的特異性IFN Y的產量顯著。圖4與BCG相比，本發明的S02在接種Balb/c的小鼠中的 保護效力。在接種本發明的S02菌林和BCG、靜脈感染結核分枝 桿菌H37Rv的Balb/c小鼠的肺(a )和脾(b )中回收的CFU的數 量。在接種S2的小鼠的肺和脾中，CFU的減少與在接種BCG的 小鼠中得到的相似，而與未接種的小鼠相比表現為顯著的保護。圖5在接種本發明的S02菌林和BCG的豚鼠中，抗低劑量結 核分4支桿菌H37Rv的4呆護效力。在感染低劑量結核分枝桿菌H37Rv 的已接種的豚鼠和注射有生理鹽水的對照豚鼠的肺(a)和脾(b) 中log1QCFU/ml的平均值。數據代表4周後處死的所有動物(n-6) 中的平均CFU。誤差棒表示標準偏差。在以低劑量感染結核分枝杆 菌並衝妻種S02的;3承鼠的肺和脾中，CFU的減少與在接種BCG中的 豚鼠中得到的相似，而與未接種的d、鼠相比則是顯著的。圖6在接種^^發明的S02菌林和BCG的豚鼠中，抗高劑量結 核分4支桿菌H37Rv的4呆護效力。"，已知在以低劑量進行感染的小 鼠和豚鼠中的保護實驗表明，在接種S02和BCG的小鼠中具有明 顯的4呆護作用而BCG和S02之間並沒有差異，因而4吏用以高劑量 進行感染的豚鼠模型。豚鼠在噴霧感染結核分枝桿菌H37Rv之後的 存活率曲線。6，肺部疾病的程度和感染的範圍，通過總的肺實變來 測量。每個在人道終點死亡的動物個體的值以"x"標記。虛線表示組 的平均百分^f直(#在S02中對應兩個動物)。c，耳又自每個處理組的豚 鼠的肺葉的代表性截面的低解析度(x 30)圖像。條線代表lmm。 26基因的質粒構建。圖10用於失活/7/lO屍基因的質津立構建。圖11小鼠中減毒作用的研究氣管接種的Balb/C小鼠的存活 率曲線，用以研究結核分枝桿菌的不同菌林的減毒作用。H37Rv和 MT103對應於沒有突變的結核分枝桿菌菌林，所有的小鼠均在第 IO周之前死亡。50%的種結分枝桿菌DIM- (1A29)菌林的小鼠存活到20周之後。所有接種S02 (phoP-和DIM-突變體)的動物 存活了 20個實驗周。圖12.豚鼠的存活率和重量曲線，以研究50倍疫苗劑量的SO2 的毒性。為了表明S02是無毒的，對6隻豚鼠接種50倍的疫苗劑 量。經過持續6個月的實驗之後，存活率為100%。經過這6個月， 發現所有動物重量都得到增加，這表明了 S02菌林的無毒性(Y= 對應各個感染周的重量(以克計)，乂=時間(以周計))。圖13.已接種的豚鼠在感染結核分枝桿菌後的存活率。豚鼠中的保護研究，300天之後的存活率未接種的豚鼠(鹽)、接種現有 BCG疫苗的豚鼠、接種結核分枝桿菌p/zo屍-菌林的豚鼠或接種S02 (p/zoP-和DIM-突變體)的豚鼠的存活率曲線。在皮下接種後，使 動物感染高劑量的結核分枝桿菌(H37Rv)的有毒菌林以研究存活 率。60天後，6隻未4妄種的月豕鼠死亡，而4妾種S02、/ /zo屍- 和BCG 的組存活。在感染300天後，3隻4妻種BCG和p/zoP-的月豕鼠死亡， 與之相比，4妻種S2的組中只有一隻死亡，這表明p/7oP突變體的 保護作用類似於現有疫苗BCG,而phoP-和DIM-雙突變體，S02 的接種，在豚鼠中保護作用更好。圖14.豚鼠中的保護研究，400天之後的存活率對圖13中所 示實驗的繼續。6隻未接種的豚鼠在60天後死亡。在感染400天之 後，3隻來自4妻種S02的組的月豕鼠(圖14a)存活，而只有一隻接 種BCG(圖14a和圖14b)和phoP- (圖14b)的豚鼠存活，再次表 明/ /7o屍突變體的^f呆護作用類卩以於BCG，而phoP-和DIM-雙突變 體，SQ2的接種，在400個實驗日之後保護作用更好。
具體實施方式
本發明的一個方面涉及一種屬於分枝桿菌屬的分離微生物，其特徵在於包括賦予PhoP-表型的Rv0757基因的失活和防止DIM產 生(DIM-表型)的第二基因的失活。另外，本發明包括使用所述凝: 生物用於製備預防肺結核的疫苗的應用，以及疫苗本身。貫穿本發明指出了分離的結核分枝桿菌屬的phoP- DIM-菌林， 如何由於它們獲得的減毒水平和它們產生的保護水平，而表現出使 它們特別適合用作疫苗的特點。為了證明減毒作用，對免疫低下的SCID小鼠噴霧接種S02 (phoP-DIM-)菌株。所述小鼠(圖2a)的存活顯著長於感染野生型 菌才朱的小鼠。另外，在S02+pS05 (phoP+DIM-)菌4朱中這種減毒作 用由/7/w屍得到補償(圖8a)。此夕卜，當在免疫活性Balb/C小鼠中通過靜脈注射進行減毒研究 時(圖7),與野生型MT103菌林相比，S02存在明顯的減毒，但 是出乎預料的是這種減毒不被p/70屍補償，因為對於免疫活性小鼠， S02+ PS05 (phoP+ DIM-)菌4朱的毒性與野生型菌4朱相同。4又對S02 (DIM-, /7/zo屍-)菌4朱與DIM-菌4朱的Balb/C小鼠進4亍比4交的存活研究 表明，接種S02具有出乎預料更高的存活率(圖11)。在靜脈感染的SCID小鼠中S02和BCG的存活比較研究顯示， S02菌抹的減毒水平高於目前用於人類抗肺結核的疫苗BCG (圖 2b)。在4妻種50倍疫苗劑量(在對批量BCG的質量控制中^f吏用) 的豚鼠中的毒性研究表明，經過6個月的研究，豚鼠體重增加並且 沒有表現宏 見上或者孩O見上可見的與肺結核相適合的組織損傷，從而證實了 S02的減毒和無毒性(圖12)。這種出乎預料的減毒和無毒性是由於PhoP-DIM-表型，而且這些突變體保持對抗肺結核藥物 的敏感性，使得可以進行常規治療。由此表明，在Balb/c小鼠中開展的疫苗實驗，直到感染後4周， 在肺和脾中由本發明的結核分枝桿菌S02菌抹和BCG產生的保護 水平是相似的。如果我們比較接種小鼠的脾中的CD4+和CD8+的 相對比例，可以發現與4妻種BCG的小鼠相比，在4妄種本發明的S02 菌林的小鼠中CD4+和CD8+都具有較高的百分比。另夕卜，當這些 細月包由來源於培養濾液的抗原進4於刺激，則在"t妻種後45天和60天， 在接種本發明的S2菌林的小鼠中可測量到CD4+/IFN-Y+顯著較 高的百分比。儘管在每個時間點上均不顯著，在接種本發明的S02 菌^K的小鼠中卻測量到CD4+/IFN- Y十的相似的趨勢。該數據表明， 與接種BCG相比，接種本發明的S02菌林產生更好的T細胞活化 這是通過對CD4+/ifn- y十的合成進^f亍測量而得到的。已知對結核 分枝桿菌的保護性免疫通常依賴於TH,-型細胞免疫反應的產生(特 徵為，從抗原的特異性T細胞中分泌IFN-y )，可以推斷通過本發 明的S02菌株引起的相對較高水平的T細胞活化有助於其產生強保 護反應的能力。另夕卜，通過使用不同的系統和測試才莫型和各種條件，我們已經 設法表明小鼠模型對於研究BCG與S02相比之下的保護差異的相 對能力。表明這兩種疫苗，S02 (phoP畫DIM畫)和BCG,在小鼠才莫 型中提供保護。採取一種方案，用豚鼠以更加顯著和逐漸更加嚴格的實驗來比 較疫苗。這種比較疫苗的系統方法可以為鑑別最佳候選疫苗(為此， 應進行進一步的試馬全)3是供一個有益的出發點。通常認為豚鼠更易 被肺結核感染，因此可以成為這種疾病較為顯著的模型[30]。與小 鼠相比，力豕鼠的優勢是，該疾病的病理與在人類肺結核中7見察到的 相似，因此它是用於測試疫苗效力的合適的才莫型。在近期關於結合分枝桿菌的泛酸和亮氨酸雙營養缺陷型突變體的噴霧疫苗研究中， 在噴霧施用結核分枝桿菌5周後，在接種豚鼠的肺和脾中獲得與牛分枝桿菌BCG相當的保護水平，其中兩種疫苗導致感染對脾的有 限擴散[34]。在另一項使用表達ESAT-6的重組BCG的研究中，只 在脾中觀察到高於牛分枝桿菌BCG的保護水平[6]，這表明提高的 保護局限於防止感染從肺部擴散的能力。為了進行本感染，對豚鼠接種低劑量的結核分枝桿菌H37Rv, 直到感染後4周，在月申和月年中由4妾種本發明的S02菌抹和BCG產 生的保護水平都是相似的。兩種疫苗都l是供了非常有效的保護，與 接受生理鹽水的對照組相比，使肺和脾中的CFU減少了大約2 log。 ^旦是在兩個疫苗組之間沒有統計學上的顯著性差異。我們可以斷 定，在感染後如此短的時期內要證明新疫苗相對於BCG的更強的 效力是困難的。這是由於，事實上當前4妄種BCG的動物器官中的 CFU(菌落形成單位)非常低以至於實驗不具備區分能力來顯示CFU 顯著的額外減少。在力參鼠的其他存活研究中發現，雖然接種BCG 相比於未接種的對照(或者接種無效疫苗)產生了統計學上的顯著 性保護，然而即使對於低劑量結核分枝桿菌的感染，這種保護也只 是部分的。在感染後60到80周以低劑量進行施用的研究中，有些 接種BCG的對照沒有保護任何豚鼠[35]，而有些則保護了低百分比 的(20%至30%)的動物[36][37]。另一方面，以高劑量施用，可能 導致比通常用於評<介TB疫苗的^f呆護效力更嚴重的疾病。對於本發明，我們4吏用相對高劑量的結核分枝桿菌H37Rv進 行噴霧感染，研究周期延長到180天。我們這樣啦支是為了產生更嚴 格水平的感染，能夠顯示出本發明的S02菌株潛在的保護效力，同 時促進相對於BCG的辨別水平。在存活方面，與未4妄種的對照相 比，接種BCG的動物組顯著地被保護，並且儘管在我們的研究中 使用相對高劑量的感染，它們表現出的整體保護水平與在其它研究 中觀察到的相似。另外，通過幾種指標的測量，包括延長的存活和肺部損傷的實變程度，我們還發現本發明的S02 (phoP- DIM-)菌才朱 與BCG相比其保護效力在統計學上顯著性4是高。這種疾病的減糹復 形式可能是直接造成接種本發明的S02菌抹的動物具有較高存活 率的原因。本發明所披露的結果顯示，根據多種標準，S02菌林和由此屬 於分枝桿菌屬(特別是來源於結核分枝桿菌複合菌群)的具有phoP-DIM-表型的微生物是比BCG更有效的疫苗。在SCID小鼠中，其 比BCG更加減毒，其為小鼠糹是供至少與BCG同樣良好的保護性免 疫，並且產生更強的細胞免疫反應。此夕卜，在感染高劑量H37Rv 的豚鼠中進行的保護實驗中，具有DIM- phoP-表型的菌林產生 100%的豚鼠存活率，而在相同情況下BCG只達到33%的存活率。 這種《呆護與疾病的嚴重程度和細菌負荷的減少相關。為了檢查S2 (phoP- DIM-)的保護水平是否由於p/2o屍突變或 者是否可能由於DIM的額外突變，在豚鼠中通過高劑量感染進行 了另 一項4妄種實'瞼。6隻動物的組4妻種BCG、 S02 CP/zoP- DIM-)和 結核分枝桿菌/ /2o屍-DIM+, 6隻用作對照的動物未進行接種。實 驗持續400天。在這項另外的實-驗中，未接種的豚鼠在70天前死亡。在感染 300天之後，衝妻種BCG和p/7oP- DIM+的3隻月豕鼠死亡，相比之下 才妄種S02的組中只有一隻死亡，這表明由DIM+突變體產生 的4呆護與現有疫苗BCG相似，而在月承鼠才莫型中接種S02, p/zoP-和 DIM-雙突變體的保護作用更好(圖13)。在400天之後，在4妄種 S02(圖14a)的組中有3隻月豕鼠存活，而只有1隻接種BCG (圖14a 和圖14 b )和phoP- DIM+(圖14 b )的豚鼠存活，這表明phoP畫DIM+ 突變體的保護類似於BCG，而在400個實馬全日之後接種S02， / /zoP-和DIM-雙突變體的保護作用更好，出乎預料比BCG更強的保護效 力不〗又歸結於； /zo屍-突變，還歸結於S02雙突變/ /zo屍-DIM-。因此，本發明的第 一 個方面涉及 一 種屬於分枝桿菌屬的分離微生物，其特徵在於包含以下基因的失活或缺失a p/w屍基因或者一個或多個調控p/2o屍基因或由/7/70屍調控的基因，以及b.防止DIM產生的第二基因。在本發明的 一種優選的實施方式中，本發明的分離樣i生物的特 4i在於，通過Rv0757基因的失活或在夬失來失活； /7o屍基因。在本發明的另 一種優選的實施方式中，本發明的分離樣史生物的 iHM正在於，通過Rv2930 (7^^D20基因的缺失或失活來失活DIM的 產生。在本發明的又 一 種優選的實施方式中，本發明的分離樣t生物的 特徵在於，其包含Rv2930和Rv0757基因的缺失或失活。在本發明的另一種實施方式中，本發明的分離微生物的特徵在 於，分枝桿菌屬的物種屬於結核分枝桿菌複合菌群。本發明的第二個方面涉及用於製備本發明的分離孩麼生物的方 法，其包含a. 失活或缺失/ /w屍基因或一個或多個調控/ /zoP基因的基因， ^尤選失活或擊夬失Rv0757基因，以及b. 失活或缺失防止DIM產生的第二基因，優選缺失或失活 Rv2930 (7a必2"基因。本發明的第三個方面涉及使個體免疫由肺結核引起的症狀的 疫苗(下文中，稱為本發明的疫苗)，其中所述疫苗包含至少一種 本發明的分離微生物。在本發明的一種優選實施方式中，疫苗還包含藥物可^妾受的賦 形劑。本發明的第四個方面涉及用於製備藥物、優選疫苗的方法，其 包含將本發明的分離微生物以治療有效的劑量結合至用於給藥於 人或動物的合適的介質中，並且選擇性地添加藥理學上適合疫苗生 產的賦形劑。所述藥物適合用於治療膀胱癌、治療或預防肺結核，或作為載 體或佐劑。可優選地用來使個體免疫肺結核引起的症狀。本發明的第五個方面涉及使用本發明的分離微生物從而製備 用於予貞防和/或治療人類或動物力市結核的疫苗的應用。貫穿本說明書和權利要求，詞語"包含"及其變化形式(variant) 並不表示排除其它的4支術特徵、添加劑、成〗分或步驟。對於本領域 中的衝支術人員，本發明的其它目的、優勢和特點將部分源自本i兌明 書，部分源自實施本發明之時。提供以下實施例和附圖，作為本發 明的非限制性的示例性實施例。實施例實施例1. #才3十和方法/蛋白l提取^^龍瘦伊遊。分別在O、 4、 8、 12和16周獲4尋 抗PhoP蛋白的多克隆抗體，其接受了 4劑量的PhoP(0.5mg)。使用 ELISA實'瞼(ZEU-Immunotec Zaragoza，西班牙)才全測到抗-PhoP抗體。抗ESAT-6的單克隆抗體由S.Cole友好4是供[24]。分枝桿菌 的無細胞蛋白質^是耳又物是由在Middlebrook 7H9-ADC肉湯中生長的 對數生長期的早期培養物遵循常規方法製備而成[25]。結核分枝杆 菌蛋白質才是耳又物通過0.22 |um孑L徑的Millex-GP過濾器(Millipore， Bedford, MA)進行過濾。收集培養了 5-6周的結核分枝桿菌H37Rv 培養濾液，用45% (w/v)的闢b酸銨沉澱培養濾液蛋白質。根據常規 方法進行免疫蛋白印跡分析。使用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗 體(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)作為第二抗體。厶2 SC/D V、葳4染/,^"為N^Vf,。關於SCID小鼠的這項工作 是依照關於實驗室動物保護的歐洲法律，在"Germans Trias i Pujol" 大學醫院的動物管理委員會的監it下開展的。SCID CB-17/Icr Ico 無特定病原(spf)的小鼠從查理斯河(Bagneux Cedex，法國)獲得。 為了進4亍噴霧感染，將小鼠置於空氣感染裝置(Glas-col Inc., Terre Haute, IN, USA)的接觸室中。在噴霧器隔間中充滿7ml結核分枝杆 菌懸浮液從而在肺中提供大約20活細菌的吸取量。每個實驗組使 用10隻小鼠。對於靜脈感染，7隻小鼠的組通過鼠尾側脈感染200 pl含有相當於2xl05、 2xl04和2xl3的活BCG和5.4 x 106、 5.4 x 105和5.4x04的活結核分枝桿菌/ /zo屍菌林的劑量的PBS。被處 理小鼠之間存活時間的差異的顯著性通過使用Mantel-Haenszel檢 驗來確定。活菌計數這樣進行連續稀釋組織勻漿，塗抹於 Middlebrook 7H11 + OADC瓊脂上，並在生長3周後進4亍分析。對 於組織學分析，將組織固定在曱醛-鹽緩衝液中並包埋於石蠟中。切 下5卞m厚的切片並用Ziehl-Neelsen染泮牛染色。/.3 ^發T"凝神本發鄉的和SCG後，Ba/6/c V、葳哞細^^名 瘦激活的測定。4隻Balb/c小鼠的組在皮下接種8xl03 CFU的BCG (Phipps)或2.5 x 103CFU的4^發明的S02菌林之後，在7、 14、 21、 28、 45和60天淨皮處死。耳又出脾，》欠置至ij 2ml的RPMI i咅養基 和含有0.5mg/ml II型月交原酶(Worthington, NJ, USA)的10%胎牛血清和2U/ml脫氧核並唐核酸酶(GIBCO)中，在37。C下，以5%的C02， 培育1小時。然後^吏它們通過70 jim細胞篩(Falcon, Becton Dickinson 70 |am Nylon 35-2350 ),用注射器柱塞壓石卒，並用培養基 洗滌。對細胞進行離心，去除上清夜，用裂解緩衝液去除紅細胞[26]。 在離心和用RPMI培養基洗滌之後，將細胞重新懸浮在FACS緩沖 液(PBS 1 x , pH 7.2, 1% BSA)中，並計悽t。通過用抗-CD4-FITC或 抗畫CD8-FITC的單克隆抗體i咅育106細胞來標記細月包表面，在4。C 下以1:20的比例在含有1%BSA和0.1%疊氮化鈉的PBS中進4亍-希 釋並保持20分鐘，使用FACScan血細胞計數器進行分析。結核分枝桿菌H37Rv菌4朱在補充有OADC(Difco實驗室， Difco Laboratories)的Middlebrook 7h9 i咅養基(Difco實馬全室)中i咅 養。在培養l個月以後，分離細菌團(bacterial mass),收集培養濾 液。所述濾液的抗原用45% (w/v)的石克酸銨沉澱，對其進4於洗滌並 再次溶解在PBS中。為了刺激細胞，將lxl(^脾細胞重新懸浮在每 孔中100|ul RPMI培養基中，並用10 |Lig結核分一支桿菌培養濾液抗原 進4亍培育，在37。C下以5% c02懸浮在lOO]ul PBS中4呆持72小時。 對細胞和培養基進4亍離心，去除上清夜，在計悽t和4企測存活力之後， 如上所述，每管中2.5x105糹田月包在cd4+或cd8+細月包的表面上進行 標記。在洗滌之後，在溶解在PBS中的0.1%皂香中重新懸浮細胞 並於4。C下培育20分鐘。通過用100 )ul標記有藻紅蛋白(PE)的 單克隆抗-IFN-y的1/20稀釋液，在4。C下對細月包進4亍黑暗下培養 20分鐘來才全測細月包內ifn- y 。用100 4希釋在PBS中的4%多聚 曱醛固定細胞。20分鐘後使用FACScan血細胞計數器分析樣品。 同型對照是Ab-FITC ( 1:20稀釋液)十Ab匿PE ( 1:20稀釋液)。a4-本犮鄉的S(92在^a/6/c V、葳^的沐護效力。遵循關於實-驗 動物保護的歐洲指令，在巴黎的巴斯德研究所(Pasteur Institute) 的動物研究室(Animal Facility)的P3高安全實-驗室(P3 High Security Laboratory )中，以受4空制的條4牛飼養所有的動物。Balb/c小鼠組(每組7隻)在尾基部進行107CFU的本發明的S02菌抹或 BCG (Pasteur)的皮下4妄種。在4妄種後8周，對所有小鼠均靜3永注 射2.5 x 105 CFU的結核分枝桿菌H37Rv。在注射後4周，小鼠祐二 處死。活菌計數這才羊進4亍連續稀釋組織勻漿，在Middlebrook7H11 +瓊脂OADC肉湯中培養，三周後基於S02菌4木的卡那黴素抗性表 型對本發明的S2菌4朱的結核分4支桿菌H3 7Rv的生長進4於4企測。/.5-本^伊/的S(92 ^萬豕武哞的/^護效力。使用豚鼠的實驗工作 是根據關於實驗動物的英國法律而開展的，並且經過了英國Porton Down的衛生^呆護木L構(Health Protection Agency )的當；也4侖J裡委員 會(ethics committee)的i人可。站偉寸生Dunkin-Hartley月豕鼠是乂人糹至鬥亥 準的供應商處(UK Home Office) (David Hall, Burton-on畫Trent， UK 或Harlan Ltd UK, Bicester, UK)獲4尋，對4也們進4亍完全隔離飼養。圖 6中給出的結果顯示S02菌4朱產生了優於BCG的保護。圖13和14 中給出的結果顯示S02突變體出乎預料的保護是由於其雙表型 DIM-/屍/zoP-。入6-/庶^/,滋/帀。6支豚鼠的組在頸後部皮下接種250|iil: 5xl04 CFU的BCG Pasteur; 5xl04 CFU的本發明的S02;或生理鹽水。在 如上所述使用包括Henderson儀器(contained Henderson apparatus ) 進行噴霧感染之前，使動物^木止12周[27]。使用Collison噴霧器， 由結核分衝支4幹菌H37Rv的細樣i顆並立產生平均直徑2|um(直徑範圍 0.5-7 pm)的噴霧，並且直4妄施用到動物的口鼻部。該噴霧由含有 2xl06 CFU/ml的水中的懸浮'液產生乂人而產生經計算大約為10-50 CFU/肺的保留吸入劑量。在施用後4周，評i"介^呆護。通過腹力莫應用過量的戊巴比妥鈉來 處死動物。從脾和肺(左前葉和中前葉，右中葉和右後葉)中無菌 地耳又出組織，放置於無菌容器中。材料在-20。C下保藏，然後準備 進4亍糹田菌i十悽t。
4吏用^走壽爭口十片；曼；責系糹充(rotating blade maceratorsystem) ( Ystral) 4吏組織在10ml (肺)或5ml (脾)的無菌去離子 水中均質化。活細胞計^t這樣進行連續稀釋組織勻漿，在 Middlebrook 7H11 +瓊脂OADC中培養，並在3周後4企測結核分 枝桿菌的生長。將數據轉換為logw從而對其進行分析，並通過學生 氏t測驗將每個疫苗組的活結核分枝桿菌的數量與接種生理鹽水的^於照ia進4亍比4交。7. 7"豕i〖^/惑染,寄刺量的錄類—為V乂Vf,y^的/^^^試。在噴霧 施用結核分枝桿菌的前10周，對6隻豚鼠的組皮下4妻種5 x 104 CFU 的本發明的S2或BCG (Danish 1331)。才艮據前面段落中所才皮露的 進行噴霧施用設作，使用5 x 107CFU/ml的懸浮液從而為肺部提供 大約500CFU。施用之後，在第3等級的防護下(ACDP)飼養動物， 定期控制其重量改變，並在施用後180天或者在人道終點(失去最 大體重的20%)人道地處死它們。如上所述地進行死後樣品的收集 和處理，除了使用在福馬林中固定，用蘇木精和伊紅(H-E)染 色的肺部組織切片的圖像分析來測量肺部實變。使用Kaplan Meier 存活評^介來比4交動物的存活，4吏用Log Rank分布分析來確定統計 顯著性差異。通過ANOVA分析CFU和損傷實變數據，使用Fisher 氏成對比4交來比 一交組的平均值。實滋辦2潛核為V餅,—屍的特性通過觀察細菌大小和具有失活的p/2o屍基因的生長細胞的索狀 淨爭4生(cording property),為p/20屍基因參與分沖支4幹菌的遺^(專回^各 (genetic circuit)的全局調控提供了證據。已知分泌抗原作為抵抗 月市結核的^f呆護作用的決定性因素的關4建特性，我們希望確定； /20屍 基因突變的多向性效果是否延伸為影響主要的免疫顯性抗原 ESAT-6的合成。對S02菌4朱、BCG和MT103使用誘導的抗PhoP 蛋白和ESAT-6的抗體進4亍免疫蛋白印跡分析。結果清楚地顯示 PhoP蛋白在結核分枝桿菌MT103和BCG菌才朱中進4亍組成性表達，而在本發明的S02菌抹中則才艮本不存在。相反，在S02菌抹 的培養物的上清4支中ESAT-6的表達水平與/人MT103的親本菌4朱中 才全測到的相似，並且正如所泮牛，在BCG中沒有4企測到ESAT-6蛋白。/惑染f本發效的,禱和5CG的小葳的存活在噴霧感染(大約20CFU ) MT103菌4朱、S02和補償/ /zoP基 因的S02(S02 + pS05)之後評價免疫低下SCID小鼠的存活[23]。所 有感染S02的小鼠存活超過245天。相反，所有感染MT103或補 償的結核分枝桿菌S02-pS05的SCID小鼠在感染後62天已經死 亡，這表明補償菌林的毒力的回覆(圖2a)。在靜脈給藥之後，還對SCID小鼠中S02菌抹的減毒與BCG 進4亍比專交。SCID小鼠組通過尾部側月永4妄種多種劑量(2 x io5、 2x 104 ,口 2 x io3 CFU )的BCG Pasteur或S02菌才朱(5.4 x io6、 5.4x 105和5.4 x 104 CFU )。在感染後3周而^皮處死的小鼠亞組的感染 肺泡巨噬細胞的組織學染色顯示，與BCG相比，感染結核分4支杆 菌S02菌4朱的小鼠的肺中的耐醇-酸細菌的悽t量4交少。所有4妄種專交 高劑量BCG ( 2 x 105 CFU )的BCG的小鼠在感染後92天已經死亡(平均存活時間89 ±3.5天)(圖2b)。相反，所有感染最高劑量 的SO (5.4x 106CFU)的小鼠在120天後存活(圖2b )。在死亡時， 感染2x 105CFU的BCG的小鼠的肺中的細菌負^f，如果與感染5.4 xl06CFU的S02的小鼠相比，至少高10(H咅。^滋斧i/ 4 Sa/6/c V、葳的定量和CDS+及^"。為了比較通過接種本發明的S02和BCG所引起的細胞免疫激 活作用，在^妻種後7、 14、 30、 45和60天，乂人皮下4妻種有本發明 的S02菌4朱和BCG Phipps的至少4隻5a/6/c小鼠組的脾中收集細 月包懸浮液，並通過細月包螢光測定術來確定CD4+和CD8+細月包的相對比例(圖3 )。在接種後14天，S02^妄種與BCG接種相比，產生 顯著較多數量的CD4+細胞，並在45天後產生顯著較多數量的 CD8+細胞。這些脾細胞用來源於結核分枝桿菌培養濾液的總抗原 刺激。3天之後，通過流式細胞儀分析淋巴細胞的數量，結合特異 性抗體來4企測01)4+/008+細胞和IFN- Y的胞內合成。在4妾種45天 之後，與BCG相比，S02接種引起顯著較高比例的CD4+/IFN- y + 產生細月包(圖3 )。在特定的時間點之後，在S02組中的產生CD8+/ IFN-y+的細胞的比例始終較高(在14天顯著不同)。,滋辦5 /h/6/c V、成^適過本發效的5(92 ,J^的沐護^^瘦。已經證明本發明的S02菌抹在SCID小鼠中被減毒，我們想要 確定觀察到的毒力的減弱是否在突變菌抹上會產生某種保護特性。 我們對Balb/c小鼠皮下4妻種本發明的S02菌才朱或BCG (Pasteur)。 在接種後8周，對所有小鼠靜脈注射2.5 x 105 CFU的結核分枝杆 菌H37Rv。在注射後4周小鼠一皮處死。通過測量/人兩組小鼠的肺和 脾回收的活結核分枝桿菌H37Rv的lt量來確定〗呆護水平(圖4)。 如果與以生理鹽水處理的對照相比，兩種疫苗都產生了相似卻又顯 著的保護水平(p<0.05)。在肺中和脾中都記錄到了結核分枝桿菌 H37Rv生長的抑制，分別減少了大約1.5 1ogK)和1.3 1ogl。CFU。《施斧j/ 6本發鄉的5(92在萬豕歲^的沐護#名瘦在小鼠接種實驗中獲得的結果顯示本發明的S02菌抹的減毒 4吏它具有與BCG Pasteur相似的疫苗特性。j旦是，普遍認為豚鼠是 人類肺結核更合適的模型，由於在疾病的發展和病理學方面具有許 多相似性。因此這種動物才莫型是用於評1介疫苗的效力的更合適的系 統。為了研究本發明的S02菌抹的保護效力，我們開展了這樣的實 驗，其包括以低劑量(10-50 CFU)和高劑量(500 CFU)對接種的動物 進行噴霧施用。對6隻豚鼠的組進行皮下接種本發明的S02或者BCG。接種後10周，對所有的豚鼠給藥結核分枝桿菌H37Rv的吸 入劑。接受低劑量的動物在4周後處死，計數肺和脾中的細菌負荷。 通過比4交乂人每個處理組的"豕鼠的器官中回收的活結核分枝桿菌 H37Rv的數量來確定保護效力。在這個實驗中，在未接種的對照動 物和那些^妻種BCG或結核分枝桿菌S02的動物之間，肺和脾中 CFU的減少是顯著不同的(口=0.005)。 ^f旦是4妻種的組之間沒有發現顯 著性差異(圖5 )。接受高劑量的豚鼠在施用180後天或者當發現失去了 20%的體種/未感染的動物中觀察到的進行比較。在吸入後的實驗階段中，所 有的未4妻種J豕鼠和4隻4妾種BCG的月豕鼠由於嚴重和不斷積累的疾 病，在時間終點(time end point) ( 180天)之前、在人道終點淨皮處 死(圖6a)。相比之下，所有接種本發明的S02菌抹的豚鼠在本研 究持續期間一直存活下來。接種本發明的S02菌抹的豚鼠的存活顯 著長於那些接種BCG的豚鼠(p = 0.018),而接種BCG的豚鼠的 存活又顯著長於用生理鹽水處理的對照豚鼠(p = 0.0049)。另夕卜， 接種S02菌林的豚鼠體重增加並且沒有表現出任何疾病的可見或 臨床體徵。通過總的肺實變測量的肺部疾病的程度在不同的處理組之間 也有所不同。正如所預碎+的，在未4妄種的豚鼠中，乂見察到疾病的最 高發展7jc平，在該組動物中，測量到76%的實變的平均百分比(圖 6b、 6c)。在接種BCG的豚鼠中肉芽肺的聚結也4艮明顯，其中在肺 中測量到70%的平均實變。相反，在接種本發明的S02菌4朱的力參鼠 中觀察到4交少的實變(大約50%)，這種實變顯著地少於(pO.05)未 4妄種的動物和那些4妻種BCG的動物(圖6c)。通過在月申和脾的組織勻漿中的細菌計數還反映了病情嚴重程度的降低。在接種的組中，在兩種器官中都 見察到了對於結核分一支桿菌H37Rv生長的抑制水 平的差異。與接種BCG的豚鼠相比，從接種S02的豚鼠中回收的 CFU的悽t量減少了 lxlogK)以上，並且在脾中這種減少在統計學上 是顯著的(p<0.05)(圖6d)。這些數據表明，本發明的S02菌株在 賦予感染的豚鼠較高的存活率，降低肺中疾病的嚴重程度以及防止 感染擴散到力卑的方面，是優於BCG的。實滋斧^7本發鄉的S02的減#^€由亍屍/zo屍-Z)/M-雙^f 。在Balb/C小鼠中通過靜脈注射S02 (phoP-DIM-)菌林和野生型 MT103菌林以及補償phoP (S02 + pS05)的菌林進行比較的感染研 究表明，通過靜脈注射在Balb/C小鼠中感染S02的減毒不會通過 才卜^f嘗phoP而回復。3和6周後測量到的脾(7a脾)和肺(7b肺) 中的菌落(CFU)的減少不會在補償菌林中被回復，因為它在免疫 活性小鼠中是無毒的，這些實驗表明出乎預料的減毒可能是由於第 二附加突變(圖7)。通過薄層色i普法對結核分枝桿菌不同菌林的脂質研究表明， S02菌4朱不產生DIM,並且這與phoP突變無關(圖8 )。為了表明S2是無毒的，對6隻豚鼠接種50倍的疫苗劑量。 經過持續6個月的實-驗之後，存活率是100%。經過6個月，在所 有的動物中觀察到了體重增加，表明S02菌抹的無毒性(￥=重量 (以克計)和感染周。X二時間(以周計))(圖12)。還研究了對於抗肺結核藥物的敏感性。確定抗肺結核藥物乙胺 丁醇、異煙肼、利福平和糹連黴素抗結核分一支桿菌菌一朱H37Rv、作為 對照的MT103 (野生型)和S02菌一木的最小抑制濃度(MIC )。數值(微克/ml)顯示/ /7o屍基因失活後，S02候選疫苗菌林保留了其 對臨床使用最普遍的抗肺結核藥物的敏感性。乙胺丁醇 異煙肼 利福平 鏈黴素H37Rv2 0.5 < 0.004 <0.5MT1032 0.5 < 0.004 <0.5S02 2 0.25 < 0.004 人4/^//)26突變中去除抗生素抗性標記。3.1為了去除res-Q/^g-res基因並產生不具有抗生素抗性標i己的 突變，插入含有^解離酶的質粒pWM19並通過慶大黴素抗性進行 篩選。然後通過在39。C下在2%蔗糖中培育/人而去除質粒(Malaga 等2003 )。實施例2.2-用於構建缺失Ap/zaP A/^/D26的雙突變體的結核 分4支桿菌菌才朱是MT103 A/^/D26。4.質4:i的構建4.1 / /zoP基因的克隆。使用結核分枝桿菌H37Rv的基因組 DNA並^f吏用引物phoPF ( SEQ ID NO:3 )和phoPR( SEQ ID NO:4 )， 通過PCR擴增p/zo屍基因。將PCR產物插入pGEM-T Easy載體 (Promega)中從而構建質粒pAZll。4.2戶/w屍基因的缺失和卡那黴素抗性基因的插入。在pAZll中 p/zoP的5c/I-H'oRV位點之間插入含有res-QAw-res基因的pCG122 的5awHI-五c'oRV片斷(Malaga等2003)/人而構建pAZ13。4.3用於通過同源重組失活基因的自殺質並立的構建。用1/wl質 粒消化pAZ13，釋方文p/zo屍::QAm插入片斷，將其整合到pJQ200X 載體中，用相同的酶使其線性化。最終的質粒命名為pAZ15。5. 結核分枝桿菌Ap/70屍A/a^D26雙突變體菌林的構建。5.1將質粒pAZ15插入結核分衝支桿菌MT103 A/^/Z)26菌4朱中。5.2單一重組子的篩選。在卡那黴素(20 lag/ml)中培養包含質粒 的細菌並一全測其對慶大黴素(10 |ug/ml)的抗性。5.3雙重組子的篩選。在2%蔗衝唐(Pelicic等1997)和卡那黴素 中培養單 一 重組子並一企測其對慶大黴素的每丈感性。6. 乂人Ap/zo屍突變中去除4元生素^U生才示i己。6.1為了去除res-Q々m-res基因並產生沒有抗生素抗性標記的突 變，插入含有Y5解離酶的質粒pWM19,並通過潮黴素抗性(20iug/ml) 進4亍篩選。然後通過在39。C下在2%蔗淨唐中培育乂人而去除質粒 (Malaga等2003)。參考文獻1. 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權利要求
1.一種屬於分枝桿菌屬的分離微生物，其特徵在於，所述分離微生物包括以下基因的失活或缺失a)phoP基因或者一個或多個調控所述phoP基因或由phoP調控的基因，以及b)防止DIM產生的第二基因。
2. 根據權利要求1所述的分離微生物，其中所述/ /20屍基因通過Rv0757基因的失活或在夾失而#:失活。
3. 根據權利要求1或2中任一項所述的分離微生物，其中DIM 的產生通過Rv2930 (/a^D2。基因的擊夾失或失活而淨皮失活。
4. 根據權利要求3所述的分離微生物，其中所述微生物的特徵在 於，其包含所述Rv2930和Rv0757基因的擊夾失或失活。
5. 根據前一項權利要求中任一項所述的分離微生物，其中所述分 枝桿菌屬的物種屬於結核分枝桿菌複合菌群。
6. 用於構建才艮據權利要求1-5中任一項所述的分離樣i生物的方 法，其包括a) 失活或缺失所述；7/zo屍基因或者一個或多個調控所述 p/2o屍基因或由/7/w屍調控的基因，以及b) 失活或在夾失防止DIM產生的第二基因。
7. 根據前一項權利要求所述的方法，其中所述phoP基因通過所 述Rv0757基因的失活而^皮失活。
8. 才艮據權利要求6或7中任一項所述的方法，其中DIM的產生 通過Rv2930 (/a^D20基因的缺失或失活而被失活。
9.權利要求1-5中任一項所述的分離^f鼓生物。
10. 4艮據前一項權利要求所述的疫苗，其還包括藥理學可4妾受的贈〔形劑。
11. 用於製備根據權利要求9-10中任一項所述的用於免疫接種或 預防由肺結核引起的症狀的疫苗的方法，其至少包括a) 將才艮據權利要求1-5中任一項所述的分離樣t生物以治 療有效劑量併入適於^於人類或動物糹會藥的介質中，以及b) 可選地添加藥理學上適合於生產疫苗的賦形劑。
12. 根據權利要求1-5中任一項所述的用作藥物的分離微生物。
13. 根據權利要求1-5中任一項所述的用作疫苗的分離微生物。
14. 根據權利要求12或13中任一項所述的用於治療膀胱癌的藥物。
15. 才艮據—又利要求12或13中任一項所述的用於治療或預防肺結核 的藥4勿。
16. 根據權利要求12或13中任一項所述的作為載體或者佐劑的藥物。
17. 根據權利要求1-5中任一項所述的分離微生物在製備根據權 利要求9或10中任一項所述的用於預防或免疫4妄種人類或動 物的月市結核的疫苗中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種屬於分枝桿菌屬的分離微生物，其特徵在於其包括使賦予PhoP-表型的基因Rv0757失活，以及使防止DIM(DIM-表型)產生的第二基因失活。另外，本發明包括使用所述微生物來生產用於免疫接種或預防肺結核的疫苗。
文檔編號C12N1/20GK101405386SQ200780010366
公開日2009年4月8日 申請日期2007年3月14日 優先權日2006年3月24日
發明者卡洛斯·馬丁蒙塔涅斯, 埃斯特·佩雷斯埃朗, 布裡吉特·吉凱爾, 熱蘇斯·貢薩洛阿森西奧, 艾因霍阿·阿韋斯阿里瓦斯 申請人:薩拉戈薩大學