Hno在治療心力衰竭中的應用的製作方法

2023-06-05 01:30:16

專利名稱：Hno在治療心力衰竭中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及HNO在治療心臟病中的應用。
技術背景心力衰竭最主要的一個症狀就是心肌收縮性的下降，目前臨床上治療心肌 收縮性嚴重下降的方法主要依賴機械支持、常規應用正性肌力藥物或通過增加 細胞內鈣離子來增強收縮性。但是臨床常用的正性肌力藥物如P受體激動劑、 磷酸二酯酶抑制劑等藥物通過環腺嘌呤核苷酸(cAMP)途徑來增強心肌的收 縮性，造成細胞內鈣離子超載，導致能量和氧消耗的增加；而現有的鈣增敏劑 匹莫苯達和左西孟旦直接作用於心肌細胞內的收縮蛋白，通過增強肌絲對鈣的敏感性來增強心肌收縮力，不增加細胞內鈣離子的超載，但是該類藥物在增 加心肌收縮期的收縮力的同時也增加了心肌舒張期的收縮力，因此對衰竭心臟 造成舒張期功能障礙的惡化。 發明內容本發明為了解決現有正性肌力藥物用於增強心肌收縮性存在增加鈣離子 的負載及能量和氧的消耗的缺陷，而現有的鈣增敏劑用於增強在心肌收縮期存 在增加了心肌舒張期的收縮力的問題，而提供HNO在治療心力衰竭中的應用。 本發明中HNO在治療心力衰竭中用於增強心肌的收縮性。 HNO為NO去單電子產物，HNO調節收縮力的作用不能被NO供體所模 擬，同時調節收縮力的作用可以被HNO清除劑N-乙醯基-L-半胱氨酸(NAC) 所抑制，表明調節收縮力的作用是HNO的直接效果。另外，HNO是通過激活 心肌細胞RYR2通道而不是依賴於環腺嘌呤核苷酸(cAMP)的方式來增加韓 離子的循環，進而增加收縮性的。目前的正性肌力藥物均導致細胞內cAMP 水平增加，而HNO獨立於cAMP信號系統之外來加強收縮性，獨立於cAMP 信號系統之外可以減少細胞內鈣離子的超載，降低死亡率。相對於現有轉增敏 劑直接作用於心肌收縮蛋白，HNO主要通過作用於心肌調節蛋白如肌f丐蛋白， 因此對於心肌舒張期的收縮力沒有影響，不會加重心臟舒張期的功能障礙。


圖1為AS處理後心肌收縮力隨時間變化曲線；圖2為AS處理後細胞內 瞬時鈣離子濃度隨時間變化曲線；圖3為心肌收縮力隨AS濃度的變化曲線， 其中"o"代表收縮期，'、"代表舒張期；圖4為細胞內鈣離子濃度隨AS濃度的 變化曲線，其中"口，，代表收縮期，、"代表舒張期；圖5為對照組和AS處理組 心肌張力隨細胞外鈣離子濃度變化曲線，其中"o"代表對照組收縮期，'、"代表 AS處理組收縮期，"口"代表對照組舒張期，'、"代表AS處理組舒張期；圖6 為對照組和AS處理組瞬時細胞內鈣離子濃度隨細胞外鈣離子濃度變化曲線， 其中"o"代表對照組收縮期，、"代表AS處理組收縮期，"D"代表對照組舒張 期，、"代表AS處理組舒張期；圖7為對照組和AS處理組的Mg-ATP酶活性 曲線，其中"o"代表對照組，'、"代表AS組。
具體實施方式
具體實施方式
一本實施方式的HNO在治療心力衰竭中用於增強心肌的 收縮性。將HNO進行如下動物實驗1、 實驗過程取體重為250 300g的Sprague-Dawley大鼠，用腹腔注射 戊巴比妥(劑量為100mg/kg)麻醉後，沿正中切口切開胸骨，暴露心臟，將 心臟迅速離斷，主動脈插管後置於標本皿中。經95%02和5。/。C02的飽和解 剖K-H液(解剖液溫度為21~22°C，每1L的解剖液含有NaCl 120 mmol， NaHC03 20 mmol， KC1 5 mmol， MgCl2 1.2 mmol，葡萄糖10 mmol， CaCl2 0.5 mmol和BDM 20 mmol，解剖液pH值為7.35-7.45)沿主動脈插管逆向灌流心 髒。取自心臟右心室的束狀肌被安裝固定在張力轉換器與可調節動力器之間， 並將這些心肌分為兩個大組——對照組和AS組，對照組用普通K-H液(KC1 的濃度為5mmol/L)以lOmL/min的速度進行灌流，AS組按照每個小組測定 所需濃度的AS (Angeli，ssalt，化學式為Na2N203 ， HNO供體，可促進HNO 在細胞內產生)溶液以10mL/min的速度進行灌流，兩組同時給予0.5Hz的低 頻脈衝刺激。2、 參數的測量及結果2-1、細胞內鈣離子濃度([Ca2+]i)及心肌收縮力的測量應用以往研究中Fura-2游離酸的形式對[Ca21進行測定。Fum-2鉀鹽採用離子透入法被顯微注 射入一個細胞，經縫隙連接擴散至整個肌組織。微電極頂端(直徑=0.2^011)充 滿Fura-2鹽溶液(1 mmol/L)，其餘部分用150 mmol/L的KC1溶液充滿。在 靜息肌組織中成功用微電極刺入細胞表面後，傳送5 10nA超極化電流20min。 在一些肌組織不同部位可以重複注射(最多3 4次)，每個部位注射持續時間 <10min以達到好的信噪比。如前所述此負載不影響心肌張力發展。Fum-2 回波螢光在380nm和340nm激發並測定，在510nm用光電倍增管(R1527， Hamamatsu)收集螢光。收集輸出的資料並進行數位化分析。通過下列方程得 出[Ca、(減去自發螢光)[Ca21 =《Rmin)/(Rmax-R)R是實測的螢光率(340/380)， /0是表觀解離常數，Rmax是[C^+]飽和時340 nm/380nm比率，Rmin是『32+]為0時340 nm/380 nm比率。《& Rm趙及Rmin 的值由體內校準法(Gao WD， Backx PH, Azan-Backx M ， Marban E ， 1994 ， 1995 )來確定。分別給予不同劑量(250pmol/L, 1000|imol/L)的Angeli，s salt (Na2N203， AS,HNO供體，可促進HNO在細胞內產生)，觀察心肌收縮力(如圖l所示)和 [C^+]i在不同時間的變化(如圖2所示)。圖l和圖2說明AS以劑量依賴的方式 增加心肌收縮期收縮力以及收縮期細胞內瞬時鈣離子濃度。當AS濃度增加時， 心肌在收縮期收縮力增加而舒張期收縮力無明顯變化。同時，收縮期瞬時細胞 內鈣離子濃度增加而舒張期鈣離子濃度無變化。說明HNO主要對心肌收縮期 的收縮力和細胞內鈣離子濃度產生影響而對舒張期無顯著影響。另外，通過收 縮力和細胞內鈣離子二者對比，可以看到收縮力的增加比鈣離子增加更為明 顯，說明HNO增強心肌收縮力不是通過增加鈣超載發揮作用的。分別給予50|xmol/L， 100pmol/L， 250Mmol/L， 500pmol/L， 1000pmol/L的 AS後，並分別測得不同AS濃度下的心肌收縮力(如圖3所示)和細胞外轉 離子的濃度(如圖4所示)，圖3和圖4說明隨著AS濃度的增加，細胞外轉 離子濃度和心肌收縮期收縮力和鈣離子濃度保持明顯升高而舒張期收縮力和 鈣離子濃度無明顯變化。在細胞外鈣離子濃度不同時(分別為0.5mmol/L， 1.0mmol/L, 1.5mmol/L，2.0mmol/L)，我們看到，隨著細胞外的C,濃度增加時，對照組和AS處理組 (AS-250,ol/L)的心肌收縮期張力都增加(如圖5所示)。但是，在任意細胞外 鈣濃度時，AS處理組心肌張力都高於對照組(PO.OOl)。另外，細胞內瞬時鈣 的振幅增加50% (如圖6所示)，並且在對照組和AS處理組之間沒有差異 (P>0.05)。圖5和圖6中舒張期對照組和AS處理組的曲線幾乎重合，圖5和圖6可 以看出，AS處理組在任意細胞外鈣離子濃度下，無論是心肌收縮力還是細胞 內鈣離子濃度均未見明顯變化。由此可見AS對於舒張期心肌張力和細胞內鈣 離子濃度無顯著影響。2-2、肌纖維Mg-ATP酶活性的測定使用蛋白酶抑制劑處理標本(處理方 法參見Murphy & Solaro, 1990)。按照Fabiato在《Myoplasmic Free CalciumConcentrationReached during the Twitch of an Intact Isolated Cardiac Cell and during Calcium-induced Release of Calcium from the Sarcoplasmic Reticulum of a Skinned Cardiac Cell from the Adult Rat or Rabbit Ventricle》(Fabiato, 1981)中 描述的孵育條件下、在含有50 mmol/L咪唑，50 mmol/L KC1和2 mmol/L Mg-ATP 的緩衝液中進行分析，並維持緩衝液的pH值為7.0。使用Rarick等人描述的標 準測量的微量滴定板法(Rarickwa/., 1997)來測量游離磷酸鹽的含量。通過 改善的Lowry法測量蛋白濃度(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)。在最終的 測定條件下，用緩衝液將肌纖維蛋白濃度稀釋至0.2mg/mL，每5分鐘測定一次 蛋白濃度。用每毫克肌纖維蛋白每分鐘時放出的無機磷酸鹽的毫微摩計算 Mg-ATP酶活性，檢測結果如圖7所示，從圖7看出AS處理組的心肌Ca&激活的 最大Mg-ATP酶活性是110.1士10.8 nmolPi/mhvmg protein (與對照組 108.2士10.5nmolPi/min'mgprotein相比，P>0.1)， AS在增加心肌收縮力的同時 不增加ATP的消耗。
權利要求
1、HNO在治療心力衰竭中的應用，其特徵在於HNO在治療心力衰竭中用於增強心肌的收縮性。
全文摘要
HNO在治療心力衰竭中的應用，本發明涉及HNO在治療心臟病中的應用。本發明解決了現有正性肌力藥物用於增強心肌收縮性存在增加鈣離子的負載及能量和氧的消耗的缺陷和現有的鈣增敏劑用於增強在心肌收縮期存在增加了心肌舒張期的張力的問題。本發明的HNO在治療心力衰竭中用於增強心肌的收縮性。本發明將HNO用於增強心肌收縮性，在心肌舒張期間無收縮力作用，不增加能量的消耗，因而不會加重心臟舒張期的功能障礙。
文檔編號A61K33/00GK101239071SQ20081006407
公開日2008年8月13日 申請日期2008年3月7日 優先權日2008年3月7日
發明者李志韜, 野 田, 鑫 鍾, 高衛東 申請人:野 田