仿生重組高密度脂蛋白在製備預防和治療阿爾茨海默病藥物中的應用的製作方法

2023-06-05 18:22:21

仿生重組高密度脂蛋白在製備預防和治療阿爾茨海默病藥物中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了仿生重組高密度脂蛋白在製備預防和治療阿爾茨海默病藥物中的應用。仿生重組高密度脂蛋白由脂質和載脂蛋白構成，所述載脂蛋白是ApoE及其模擬肽、ApoA-I及其模擬肽、ApoA-II及其模擬肽、ApoC及其模擬肽中的一種或多種。所述載脂蛋白優選ApoE3及其模擬肽中的一種或多種。本發明首次提出將仿生重組高密度脂蛋白應用於製備預防和治療阿爾茨海默病藥物，解決了天然高密度脂蛋白來源稀缺、製備繁瑣、質量可控性不強等缺點，其應用為阿爾茨海默病防治藥物研發提供新的思路，具有重要的研究價值和臨床應用前景。
【專利說明】仿生重組高密度脂蛋白在製備預防和治療阿爾茨海默病藥 物中的應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及神經藥理學和化學製藥領域，尤其涉及仿生重組高密度脂蛋白在製備 預防和治療阿爾茨海默病藥物中的應用。

【背景技術】
[0002] 阿爾茨海默病（Alzheimei^ s Disease, AD)是發生在老年人群中最常見的以進 行性痴呆為特徵的中樞神經系統退行性病變。臨床表現為認知和記憶功能不斷惡化，日常 生活能力進行性減退，伴有各種神經精神症狀和行為障礙。目前AD在老年人群中的發病率 僅次於心血管病、癌症和腦卒中，已成為排名第四位的致死病因。隨著人口老齡化進程的加 劇，該類疾病的發病率日益上升。《世界阿爾茨海默病報告》指出，痴呆患者人數預計每20 年增長近一倍，將由2010年的3600萬增至2050年的1. 15億，且58%的患者居住於中低收 入國家，到2050年，這一數字將增至71% ;報告稱，每年痴呆相關費用總計6040億美元，約 為全球國內生產總值（⑶P)的1%。AD已成為人類健康和生存質量的嚴重威脅，是日益嚴重 的公共衛生問題。
[0003] 目前臨床上使用的AD治療藥物本質上為對症治療，包括乙醯膽鹼酯酶（AchE)抑 製劑他克林、多奈哌齊、利斯的明、加蘭他敏和穀氨酸NMDA受體拮抗劑美金剛，僅能短期內 改善膽鹼能缺失導致的學習、記憶功能下降，但不能改變AD的病理進程。因此，亟需尋找和 建立具有AD疾病修飾作用的新型防治方法。
[0004] 老年斑和神經元纖維纏結是AD的重要病理特徵。老年斑的主要組成物質是β -澱 粉樣蛋白（amyloidP-protein, Αβ )，而神經元纖維纏結主要由過度磷酸化的Tau蛋白組 成。Α β是由39?43個胺基酸組成的多肽，Α β 40和Α β 42是其兩種基本類型，來源於澱粉 樣前體蛋白（ΑΡΡΚΑβ具有高度聚集能力，經神經元產生分泌後，會迅速聚集，形成可溶狀 態的寡聚體，而後進一步聚集形成Αβ纖維而沉積在腦內。當前的研究明確Αβ是AD的核 心致病物質，其中Αβ寡聚體的神經毒性最強。Αβ在腦內過度產生和沉積，引起其周邊神 經元突觸功能障礙、Tau蛋白過度磷酸化、氧化應激和繼發炎性反應，導致神經元變性死亡， 最終產生痴呆。這就是目前廣泛接受的AD病因假說-Α β級聯假說（amyloid β cascade hypothesis)。由此，Α β及其聚集體特別是寡聚體成為AD最重要的疾病生物標記物，而如 何降低腦內Αβ水平也成為防治AD的重要策略。
[0005] 減少產生和促進清除是降低腦內Αβ水平的關鍵手段。自20世紀90年代開始，首 先探討的是通過抑制Αβ產生的關鍵酶（β分泌酶和γ分泌酶)活性來減少Αβ的產生。但 是，由於β分泌酶和Υ分泌酶同時參與眾多底物的代謝過程，簡單地抑制其活性會因幹擾 神經元的正常生理功能而產生嚴重不良反應。Υ分泌酶抑制劑(包括禮來的semagacestat 和施貴寶的avagacestat)在臨床試驗中相繼失敗，使得APP代謝調節劑的研發熱情跌至冰 點。
[0006] 在AD患者中，90%以上是遲髮型病人。這些病人腦內Αβ產生速度與正常人相同， 而Αβ清除速率明顯低於正常對照。由此，加快腦內Αβ清除成為AD防治最重要的方向。 免疫治療是目前用於降低腦內Αβ水平最常用的策略，能夠有效預防和清除Αβ沉積、抑制 Αβ寡聚體的毒性作用、降低神經膠質增生、逆轉神經突觸損傷及改善認知功能。然而，免 疫治療本身存在一些重要的問題亟需解決：（1)Αβ-抗體免疫複合物誘發的不良反應:Αβ 作為自身抗原，與進入腦內的抗體形成免疫複合物後，將可能誘發繼發免疫反應而導致中 樞神經系統炎症和血管壁的損傷，引起腦內炎症、腦微血管出血和血管源性腦水腫等不良 反應；（2)目前有效的抗體都是針對Αβ氨基端的特異性抗體，由於Αβ氨基端的序列位於 Α β前體蛋白（ΑΡΡ)的胞外段，因此這些抗Α β氨基端的抗體也會與神經元的ΑΡΡ結合而導 致正常神經元遭到免疫攻擊。鑑於免疫療法的上述局限性，亟需探索新的降低腦內Αβ水 平的策略。
[0007] 高密度脂蛋白是一種天然的納米載體，屬脂蛋白中粒徑最小的成員，由脂質和載 脂蛋白（ΑροΑ-Ι, ΑροΑ-ΙΙ, ApoE或ApoC)構成，介導體內膽固醇的逆向轉運，具有抗動脈硬 化、抗氧化、抗炎等功能。神經生物學研究表明，以ApoE為載脂蛋白成分的ApoE-高密度 脂蛋白是腦內最主要的高密度脂蛋白類型，除了參與膽固醇轉運外，同時參與Αβ代謝，介 導其腦內降解和清除。該作用依賴於ApoE的亞型（Αρ 〇Ε2?Αρ〇Ε3?Αρ〇Ε4)及其脂化程度 (ApoE-高密度脂蛋白〉ApoE)。腦內ApoE的脂化主要由ABCA1蛋白介導。研究顯示，ABCA1 表達升高，腦內ApoE-高密度脂蛋白含量升高，Αβ沉積減少；反之，abcal基因敲除，腦內 ApoE-高密度脂蛋白含量降低，Αβ沉積增加。由此可見，ApoE-高密度脂蛋白在介導腦內 Αβ清除中起關鍵作用；此外，ApoA-I高密度脂蛋白也也被認為在AD中起著重要作用，同樣 可結合Αβ，減小其神經毒性。ApoA-I基因敲除可加速APP/PSlDeltaE9 AD模型鼠 Αβ斑 塊沉積，加重記憶障礙；而其高表達可有效減少APP/PS1 AD模型鼠 Αβ在血管壁的沉積，減 少炎症，減輕記憶障礙。基於上述證據，我們認為，高密度脂蛋白具有天然的促進腦內Α β 清除的能力，提高體內高密度脂蛋白水平有望延緩AD疾病進程。
[0008] 天然高密度脂蛋白來源稀缺、製備繁瑣、質量可控性不強。基於仿生學原理構建的 重組高密度脂蛋白為解決該問題提供了一條途徑。然而現有重組高密度脂蛋白直接藥用僅 見於動脈粥樣硬化和糖尿病防治的零星報導，未見其在AD防治方面的應用研究。由此，本 發明首次提出模擬機體天然的Αβ清除機制，構建仿生重組高密度脂蛋白，其體內應用將 促進腦內Αβ清除，對AD疾病進程具有重要的調節作用。


【發明內容】

[0009] 本發明所要解決的技術問題是，提供仿生重組高密度脂蛋白在製備預防和治療阿 爾茨海默病藥物中的應用。
[0010] 為了解決上述問題，本發明提供了仿生重組高密度脂蛋白在製備預防和治療阿爾 茨海默病藥物中的應用。
[0011] 作為一個優選方案，所述仿生重組高密度脂蛋白由脂質和載脂蛋白構成。
[0012] 作為一個優選方案，所述脂質通過常規方法製備脂質體，而後與載脂蛋白共同孵 育，通過自組裝形成重組高密度脂蛋白，脂質質量佔處方含量的20-95%，載脂蛋白質量佔處 方含量的5-80%。
[0013] 作為一個優選方案，所述載脂蛋白是ApoE及其模擬肽、ΑροΑ-Ι及其模擬肽、 ApoA-II及其模擬肽、ApoC及其模擬肽中的一種或多種。所述載脂蛋白優選ApoE及其模擬 肽中的一種或多種。
[0014] 作為一個優選方案，所述仿生重組高密度脂蛋白採用注射途徑給藥或者鼻腔途徑 給藥。
[0015] 作為一個優選方案，所述仿生重組高密度脂蛋白的粒徑範圍為l-500nm，優選 5_50nm〇
[0016] 作為一個優選方案，所述仿生重組高密度脂蛋白分散在藥劑學上可以接受的緩衝 溶液環境中，所述緩衝溶液包括HEPES緩衝液、生理鹽水、Tris緩衝液和磷酸鹽緩衝液。
[0017] 作為一個優選方案，所述仿生重組高密度脂蛋白可以包載藥物，所述仿生重組高 密度脂蛋白包載藥物起協同防治阿爾茨海默病的作用，所述藥物是指治療或診斷阿爾茨海 默病的藥物，包括小分子化學藥物，大分子多肽、蛋白、基因藥物中的一種或者多種。
[0018] 本發明所述的脂質可以是天然磷脂(蛋磷脂、豆磷脂)、合成磷脂(磷脂醯膽鹼、磷 脂醯乙醇胺、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯甘油、磷脂醯肌醇、磷脂酸、心磷脂、溶血磷脂)、鞘脂(鞘 氨醇、神經醯胺、鞘磷脂、腦苷脂、神經節苷脂)、膽固醇、膽固醇酯、甘油酯及其衍生物中的 一種或多種。
[0019] 所述的脂質體的製備方法採用薄膜水化法、注入法、復乳法、熔融法、冷凍乾燥法、 逆向蒸發法、高壓乳勻法或超聲法及Ca 2+融合法。
[0020] 本發明的優點在於，本發明首次提出將仿生重組高密度脂蛋白應用於製備預防和 治療阿爾茨海默病藥物，解決了天然高密度脂蛋白來源稀缺、製備繁瑣、質量可控性不強等 缺點，其應用為AD防治藥物研發提供新的思路，具有重要的研究價值和臨床應用前景。仿 生重組高密度脂蛋白的體內應用將對AD疾病進程具有重要的調節作用：①進入腦內的重 組1?密度脂蛋白通過1?未和力結合Αβ，增加腦內膜島素降解酶、金屬基質蛋白酶等對Αβ 的胞外降解和小膠質細胞對Αβ的內吞和胞內降解；②降低腦內炎症反應；③血循環中的 重組高密度脂蛋白，高親和力結合Α β，降低外週遊離Α β濃度，發揮外周漏漕效應，促進腦 內Αβ的腦外轉運。④此外，重組高密度脂蛋白是一種常用的藥物載體，可載帶其它藥物以 協同防治AD。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1為透射電鏡觀察㈧不載膽固醇酯的重組高密度脂蛋白（圓盤狀)和⑶載膽 固醇酯的重組高密度脂蛋白（球形）形態，標尺：20nm。
[0022] 圖2為重組高密度脂蛋白和對照脂質體與（A) Α β _單體、（Β) Α β _寡聚體結合 情況的比較，*Ρ〈〇. 05, **ρ〈0. 01，_ρ〈0. 001與重組高密度脂蛋白存在顯著性差異。
[0023] 圖3為重組高密度脂蛋白與（Α)Αβ ρ42單體、（Β)Αβ ρ42寡聚體的表面等離子共振 結合曲線。
[0024] 圖4為與Α β 22 °C共孵育48h後，點印記法考察Αρ〇Ε3溶液和重組高密度脂蛋白對 Αβρ#寡聚體形成的影響，（Α)陰性對照：磷酸鹽緩衝液；(Β)Αρ〇Ε3溶液；(C)重組高密度脂 蛋白溶液。
[0025] 圖5為與Αβ 37°C共孵育120h後，硫磺素 Τ螢光法考察Αρ〇Ε3溶液和重組高密度 脂蛋白對Αβ 纖絲形成的影響，以各組Oh螢光值為100%，@ρ〈0. 001，表明與陰性對照單 獨Α β 孵育組存在顯著性差異。
[0026] 圖6為重組高密度脂蛋白㈧促進AD模型動物SAMP8小鼠的腦內Α β清除，（B) 減少小膠質細胞激活，#Ρ〈〇. 01，*"ρ〈〇. 001與生理鹽水組存在顯著性差異；###Ρ〈〇. 001與正 常對照組存在顯著性差異。
[0027] 圖7為注射給藥四周，Morris水迷宮實驗考察重組高密度脂蛋白和載α -倒捻子 素重組高密度脂蛋白對8月齡AD模型動物SAMP8小鼠潛伏期的影響，#ρ〈0. 05, #ρ〈0. 01表 明與生理鹽水組存在顯著性差異。

【具體實施方式】
[0028] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。下述實施例中所使用的實驗方法如無 特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途 徑得到。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例 中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆：實驗室 手冊（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制 造廠商所建議的條件。
[0029] 實施例1重組高密度脂蛋白表徵
[0030] ⑴製備
[0031] 脂質(磷脂醯膽鹼+/_神經節苷脂+/_膽固醇+/_膽固醇油酸酯）（2-10mg)溶於 氯仿中，減壓旋轉蒸發除去有機溶劑，脂膜加 PH7. 4磷酸鹽緩衝液水化，50°C超聲均質。加 入0. 5-5mg的ApoE3,繼續超聲50min。產品冷卻至室溫，孵育過夜，4°C保存備用。
[0032] (2)表徵
[0033] 重組高密度脂蛋白磷鎢酸負染，透射電鏡觀察形態。雷射粒度儀測定其粒徑和表 面電位。重組高密度脂蛋白成分分析：螢光分光光度計測定包載螢光探針量；HPLC測定包 載藥量；磷脂試劑盒（Phospholipids C assay kit)測定磷脂含量；Bradford法測定蛋白 含量，計算Ap〇E3組裝效率。
[0034] 透射電鏡結果如圖1所示，不含膽固醇油酸酯的重組高密度脂蛋白呈規則扁平的 圓盤狀，多個疊加呈蠶繭狀，膜結構清晰可見，粒徑均一，小於20nM，與天然初生HDL形態相 似（圖1A);而含膽固醇油酸酯的重組高密度脂蛋白呈粒徑均一的圓球形，粒徑15-20nm，與 天然成熟HDL形態相似（圖1B)。
[0035] 實施例2重組高密度脂蛋白結合Α β _單體、寡聚體
[0036] ⑴製備
[0037] 稱取豆磷脂、蛋磷脂（2-10mg)和0. 02mg螢光探針Dil放入圓底燒瓶中，加入氯 仿溶解，置於旋轉蒸發儀20°C，避光真空lh除去有機溶劑。在圓底燒瓶中加入PBS溶液， 37°C振搖至瓶內壁脂質膜全部水化脫落，40°C超聲減小粒徑，加入ApoE或ApoE模擬肽 (0· l-10mg)，37°C孵育 36h，4°C保存。
[0038] (2)重組高密度脂蛋白與Αβ _單體、寡聚體的體外吸附結合實驗
[0039] 將Α β _單體(濃度為500 μ g/ml)或寡聚體(濃度為500 μ g/ml)的0· 05ΜρΗ9· 6 的碳酸鈉-碳酸氫鈉溶液加入到板孔中，每孔50μ 1，4°C孵育過夜。棄去孔內孵育液，將孵 育過夜的板用封閉液（〇. 01M PBS，pH 7. 4中含1%BSA，0. 05%Tween-20)封閉lh，然後將螢光 標記的重組高密度脂蛋白1〇μ g/ml，50y g/ml，250y g/ml (按照磷脂量計算)分別加入到板 孔中，37°C孵育過夜，PBS洗三遍，多功能酶標儀螢光檢測，Aem/ex為522nm/568nm。結果如 圖2所示，重組高密度脂蛋白與Α β η。單體的結合螢光值在10 μ g/ml，50 μ g/ml，250 μ g/ ml時分別為對照脂質體的1. 94倍，1. 26倍和1. 48倍；與Aβ 寡聚體的結合螢光值在 10 μ g/ml，50 μ g/ml，250 μ g/ml時分別為對照脂質體的1. 88倍，1. 71倍和1. 59倍，存在顯 著性差異。表明重組高密度脂蛋白具有較強的Αβ結合能力。
[0040] 實施例3重組高密度脂蛋白的Α β親合特性
[0041] (1)製備
[0042] 稱取磷脂醯膽鹼、磷脂酸（2-10mg)放入圓底燒瓶中，加入氯仿溶解，置於旋轉蒸 發儀減壓除去有機溶劑。在圓底燒瓶中加入PBS溶液，37°C振搖至瓶內壁脂質膜全部水化 脫落，40°C均質減小粒徑，加入ApoE或ApoA-I (0· l-10mg)，37°C孵育36h，4°C保存。
[0043] (2)表面等離子共振（Surface Plasmon Resonance, SPR)實驗驗證重組高密度脂 蛋白的Αβ親合特性。
[0044] CM5晶片採用氨基偶聯的方式將Αβ單體或者寡聚體固定：在用0. 2MEDC和0. 05Μ NHS對晶片表面進行活化後，將Α β單體或者寡聚體稀釋於ρΗ4. 0醋酸鈉緩衝溶液中，使 Α β濃度為23 μ Μ，以30 μ Ι/min的速度注入420s，再用ρΗ8. 5的乙醇胺進行封閉。參比通 道活化後直接用乙醇胺封閉。親和力測試採用雙信道模式檢測：重組高密度脂蛋白稀釋於 pH 7. 410mM PBS中，以30μ1/π?η的速度注入到參比通道以及固定了 Αβ的通道。接觸時 間為 100s 或 300s，解離時間為 400s。結果用 Biacore Τ200 Evaluation Softeware 程序 進行分析，運用1:1結合模型計算親和力值。結果顯示，重組高密度脂蛋白與Α β i_42單體 (monomer)、寡聚體（oligomer)均呈高親和力結合（圖3)，動態法計算其與Αβ卜 42單體、寡 聚體的親和力常數KD值，分別為5· 79ηΜ和6· 32ηΜ (與抗原、抗體親和力同一數量級)，與天 然HDL與Αβ的親和力（5. 7ηΜ)相似，表明重組高密度脂蛋白具有良好的Αβ親和特性。
[0045] 實施例4重組高密度脂蛋白抑制Αβ寡聚體、纖絲形成
[0046] (1)製備
[0047] 稱取2-10mg磷脂醯膽鹼+/_鞘磷脂放入圓底燒瓶中，加入氯仿溶解，旋轉蒸發除 去有機溶劑。加入Tris緩衝液，37°C振搖至瓶內壁脂質膜全部水化脫落，超聲減小粒徑。加 入適量0. 2mg/ml ApoE3蛋白溶液，37°C 50rpm孵育36h，4°C保存。
[0048] (2)點印記考察重組高密度脂蛋白對Α β η。寡聚體形成的影響
[0049] 取5 μ 1 10mg/ml Αβ ^DMSO儲備液3份分別加入以下溶液45 μ 1 :0· 01MPBS、 5〇1^/11114?成3溶液、重組高密度脂蛋白溶液(含4?成3 5〇1^/1111，脂質25〇1^/1111)。置於 恆溫空氣搖床400rpm，22°C，孵育48h，立即上樣。Αβ寡聚體的特異性抗體All和Αβ特異 性抗體6Ε10分別對Α β _寡聚體和總Α β _免疫組化染色。結果如圖4所示，ΑροΕ3溶液 和重組高密度脂蛋白均能抑制Α β 寡聚體形成。
[0050] (3)硫磺素 T(ThT)螢光法考察重組高密度脂蛋白對Αβ _纖絲形成的影響
[0051] 取15 μ 1 lmg/ml Αβ _六氟異丙醇儲備液，氮吹儀上氮氣輕柔吹15min，揮幹六 氟異丙醇，加入34 μ 1三蒸水，混勻，再分別加入16 μ 1以下溶液：ApoE3溶液（50 μ g/ml)、 重組高密度脂蛋白溶液(含Ap〇E3 50 μ g/ml，脂質250 μ g/ml )，37°C孵育，並於0h，120h，取 出樣品進行ThT檢測。結果如圖5所示，重組高密度脂蛋白顯著抑制A β 纖絲形成。
[0052] 實施例5重組高密度脂蛋白注射給藥促進AD模型動物腦內Α β清除，減少小膠質 細胞激活
[0053] ⑴製備
[0054] 稱取2-10mg磷脂醯膽鹼+/_鞘磷脂放入圓底燒瓶中，加入氯仿溶解，旋轉蒸發除 去有機溶劑。加入Tris緩衝液，37°C振搖至瓶內壁脂質膜全部水化脫落，超聲減小粒徑。加 入適量0. 2mg/ml ApoE3蛋白溶液，37°C 50rpm孵育36h，4°C保存。
[0055] (2)重組高密度脂蛋白促進AD模型動物SAMP8小鼠的腦內Α β清除，減少小膠質 細胞激活。
[0056] 將10月齡AD模型小鼠 SAMP8小鼠分為生理鹽水組、重組高密度脂蛋白組。SAMR 小鼠作為正常對照，給予生理鹽水。靜脈注射給藥，連續給藥2周。給藥結束後，小鼠水合 氯醛麻醉，生理鹽水、4%多聚甲醛依次心臟灌流。斷頭，取出完整大腦，4%多聚甲醛溶液繼 續固定，浸蠟，包埋，切片，厚度4 μ m，避光保存。石蠟切片免疫組化染色，腦內Α β聚集體免 疫組化(一抗6Ε10)，小膠質細胞激活(一抗anti-⑶45)。DAB染色，蘇木素復染，中性樹膠封 片觀察並計數不同處理組動物大腦皮層、海馬的Αβ沉積和小膠質細胞激活情況。
[0057] 結果如圖6所示，10月齡SAMP8小鼠連續15天尾靜脈給予重組高密度脂蛋白 (20mg/kg)，腦內Αβ沉積和小膠質細胞激活情況明顯少於生理鹽水組。表明重組高密度脂 蛋白能有效促進腦內Αβ清除，並降低腦內炎症，具有一定的AD疾病修飾作用。
[0058] 實施例6重組高密度脂蛋白鼻腔給藥對AD模型動物的疾病修飾作用
[0059] ⑴製備
[0060] 脂質（D0TAP/D0PE+/-DMPC+/-PEG-DMPC) (2-10mg)溶於一定比例氯仿溶液中，減 壓旋轉蒸發除去有機溶劑，脂膜加含siRNA/MicroRNA (1-500 μ g)的Tris緩衝液水化，均質 減小粒徑。取lml ApoE3/ApoA I模擬肽（0.5-5mg/ml)10min內加入，超聲50min，繼續孵 育24h，4°C保存。
[0061] (2)重組高密度脂蛋白鼻腔給藥對AD模型動物的疾病修飾作用
[0062] 將7月齡AD模型小鼠 APP/PS1轉基因小鼠分為生理鹽水組、重組高密度脂蛋白 組。野生型B6小鼠作為正常對照，給予生理鹽水。鼻腔給藥4周。給藥結束後，小鼠水合氯 醛麻醉，生理鹽水、4%多聚甲醛依次心臟灌流。斷頭，取出完整大腦，4%多聚甲醛溶液繼續 固定，浸蠟，包埋，切片，厚度4 μ m，避光保存。石蠟切片免疫組化染色，腦內Α β聚集體免疫 組化(一抗6Ε10)，小膠質細胞激活(一抗anti-CD45)。DAB染色，蘇木素復染，中性樹膠封片 觀察並計數不同處理組動物大腦皮層、海馬的Α β沉積和小膠質細胞激活情況。結果顯示， 7月齡APP/PS1轉基因小鼠連續4周鼻腔給予重組高密度脂蛋白，腦內Α β沉積和小膠質細 胞激活情況明顯少於生理鹽水組，表明重組高密度脂蛋白具有良好的AD疾病修飾作用。
[0063] 實施例7重組高密度脂蛋白與載帶藥物協同改善AD模型動物的空間學習記憶能 力
[0064] ⑴製備
[0065] 脂質（DMPC/DMPE+/-GM1+/-膽固醇+/_膽固醇油酸酯）（2-10mg)、藥物α -倒捻 子素（0. l-2mg)溶於一定比例氯仿-甲醇混合溶劑中，減壓旋轉蒸發除去有機溶劑，脂膜加 lml Tris緩衝液水化，50°C超聲減小粒徑。取lml ApoE3 (0.5-5mg/ml)10min內加入，繼 續超聲50min。產品冷卻至室溫，4°C過夜。
[0066] (2)重組高密度脂蛋白與載帶藥物協同改善AD模型動物的空間學習記憶能力
[0067] 採用Morris水迷宮實驗考察重組高密度脂蛋白和載多酚類藥物α -倒捻子素的 重組高密度脂蛋白對AD模型動物的空間學習記憶能力的改善作用。給藥方法：將7月齡 AD模型動物SAMP8小鼠分為生理鹽水組，重組高密度脂蛋白（5mg/kg)，載α -倒捻子素的 重組高密度脂蛋白（相當於給予α-倒捻子素 lmg/kg)。SAMR小鼠作為正常對照，給予生 理鹽水。小鼠按照0. lml/10g尾靜脈注射給藥，連續給藥4周。
[0068] Morris水迷宮，水池直徑120cm，高50cm，水深25cm，水溫22± 1°C。沿水池圓周等 分為四個入水點，它們的連接線將圓形水池等分為I、II、III、IV共4個象限區域，在I象限 中心放置一個9cm黑色平臺。平臺低於水面約lcm。水池底、平臺及四壁均以食用染料塗 成黑色使平臺不可見。採用Morris水迷宮視頻分析系統2. 0監測並記錄小鼠的遊泳軌跡。 定位航行試驗（Hidden platform test):用於訓練和測量小鼠的空間學習能力，與小鼠連 續給藥4周後休息2天開始，歷時5天。將平臺固定於I象限中央，按照隨機的原則分別從 I、II、III、IV象限的入水點將小鼠面向池壁放入水中，計算機監測並記錄小鼠從入水開始 尋找至找到並爬上黑色平臺的路線、所需時間(潛伏期）及遊泳速度等。如果小鼠60s內未 找到平臺，需將其引領到平臺，並停留30s，這時潛伏期記為60s。每天訓練4次/只，每次 訓練間隔30s。
[0069] 結果如圖7所示，正常對照小鼠 SAMR組自第一天訓練的後面兩次就能比其它實 驗組動物更快地找到平臺，整個實驗過程中的潛伏期都比較短，且隨著訓練天數增加呈逐 漸縮短的趨勢，顯示良好的空間學習記憶能力；相反，給予生理鹽水的SAMP8小鼠直至第五 天潛伏期依然很長（55. 7±6. 3s)，表現為明顯的學習記憶障礙。給予重組高密度脂蛋白 的SAMP8小鼠在訓練前三天潛伏期明顯縮短趨勢，第三天潛伏期已與生理鹽水組存在顯著 性差異，表明給予重組高密度脂蛋白能夠有效提高SAMP8小鼠的空間學習記憶能力。給予 倒捻子素的重組高密度脂蛋白更有效地縮短小鼠上臺前潛伏期，訓練第四天、第五天的 潛伏期分別為37. 5±6.0s，35. 9± 18. ls，與生理鹽水組存在顯著性差異，表明載藥重組高 密度脂蛋白可能通過重組高密度脂蛋白和多酚類藥物的協同作用進一步增強對AD的疾病 修飾作用。
[0070] 以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本【技術領域】的普通技術人 員，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為 本發明的保護範圍。
【權利要求】
1. 仿生重組高密度脂蛋白在製備預防和治療阿爾茨海默病藥物中的應用。
2. 根據權利要求1所述的仿生重組高密度脂蛋白在製備預防和治療阿爾茨海默病藥 物中的應用，其特徵在於，所述仿生重組高密度脂蛋白由脂質和載脂蛋白構成。
3. 據權利要求2所述的仿生重組高密度脂蛋白在製備預防和治療阿爾茨海默病藥物 中的應用，其特徵在於，所述脂質通過常規方法製備脂質體，而後與載脂蛋白共同孵育，通 過自組裝形成重組高密度脂蛋白，脂質質量佔處方含量的20-95%，載脂蛋白質量佔處方含 量的5-80%。
4. 根據權利要求2或3所述的仿生重組高密度脂蛋白在製備預防和治療阿爾茨海 默病藥物中的應用，其特徵在於，所述載脂蛋白是ApoE及其模擬肽、ApoA-I及其模擬肽、 ApoA-II及其模擬肽、ApoC及其模擬肽中的一種或多種。
5. 根據權利要求4所述的仿生重組高密度脂蛋白在製備預防和治療阿爾茨海默病藥 物中的應用，其特徵在於，所述載脂蛋白是ApoE及其模擬肽中的一種或多種。
6. 根據權利要求1所述的仿生重組高密度脂蛋白在製備預防和治療阿爾茨海默病藥 物中的應用，其特徵在於，所述仿生重組高密度脂蛋白採用注射途徑給藥或者鼻腔途徑給 藥。
7. 根據權利要求1所述的仿生重組高密度脂蛋白在製備預防和治療阿爾茨海默病藥 物中的應用，其特徵在於，所述仿生重組高密度脂蛋白的粒徑範圍為l_500nm。
8. 根據權利要求7所述的仿生重組高密度脂蛋白在製備預防和治療阿爾茨海默病藥 物中的應用，其特徵在於，所述仿生重組高密度脂蛋白的粒徑範圍為5-50nm。
9. 根據權利要求1所述的仿生重組高密度脂蛋白在製備預防和治療阿爾茨海默病藥 物中的應用，其特徵在於，所述仿生重組高密度脂蛋白分散在藥劑學上可以接受的緩衝溶 液環境中，所述緩衝溶液包括HEPES緩衝液、生理鹽水、Tris緩衝液和磷酸鹽緩衝液。
10. 根據權利要求1所述的仿生重組高密度脂蛋白在製備預防和治療阿爾茨海默病 藥物中的應用，其特徵在於，所述仿生重組高密度脂蛋白包載藥物起協同防治阿爾茨海默 病的作用，所述藥物是指治療或診斷阿爾茨海默病的藥物，包括小分子化學藥物，大分子多 肽、蛋白、基因藥物中的一種或者多種。
【文檔編號】A61P25/28GK104138595SQ201310164937
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2013年5月7日 優先權日:2013年5月7日
【發明者】高小玲, 陳紅專, 宋清香, 黃萌, 王小林 申請人:上海交通大學醫學院