一種瓊脂糖交聯凝膠微球的製備方法
2023-06-05 12:25:56
一種瓊脂糖交聯凝膠微球的製備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於高分子領域，具體為一種瓊脂糖交聯凝膠微球的製備方法。
【背景技術】
[0002]瓊脂糖Agarose，縮寫為AG，是瓊脂中不帶電荷的中性組成成份，也譯為瓊膠素或瓊膠糖。瓊脂作為一種獨特的食品在我國已經有悠久的歷史。它是從大型海洋藻類石花菜、紫菜、江籬等提取分離製成的。瓊脂糖在加熱時可以形成均勻的溶液，為單獨的多糖大分子鏈，當溫度降低時在氫鍵的作用下先形成平行的雙螺旋結構，雙螺旋聚集形成結構有序的膠束，膠束之間形成五角形的孔。瓊脂糖形成凝膠時的空間網狀結構，孔徑分布適中，因此瓊脂糖凝膠微球可以作為凝膠篩分的介質使用，是經典的生物的分子分離材料。該瓊脂糖凝膠微球具有親水性、多孔性、電中性和易衍生性等其它生物材料不可比擬的優點而廣泛應用於各種生物活性大分子的分離和純化。
[0003]因此，瓊脂糖凝膠微球的製備方法非常多，主要有超聲、機械攪拌、均質乳化等乳化冷凝法和噴射冷凝法。但是，製備出的珠體應用時壓力降大，層析柱的反壓較高，不利於柱式操作以至於限制了其應用。隨著交聯技術的進步，通過對瓊脂糖微球的化學改性，一定程度上提高了凝膠的機械穩定性和通透性。有關瓊脂糖微球的交聯方法很多，都是在製備出的凝膠微球上進行交聯。
[0004]本發明採用一步法製備交聯微球，既可以製備出表面光滑、機械強度好的交聯微球又節約成本。
【發明內容】
[0005]鑑於上述問題，本專利的目的是提供一種機械性能好、耐熱、耐壓性強並且粒度均一的微球；以瓊脂糖溶液為水相，甲苯為油相，採用環氧氯丙烷對瓊脂糖微球的形成過程進行交聯，製備機械性能較好的瓊脂糖凝膠微球。另一個目的是提供一種方便簡潔的交聯瓊脂糖凝膠微球的製備方法。
[0006]為了實現上述目的，本申請所採取的技術方案如下:
[0007]—種瓊脂糖交聯凝膠微球的方法，具體步驟如下:
[0008]I)懸浮液製備
[0009]將質量濃度為3-8%的瓊脂糖水溶液作為水相，倒入油相70°C的甲苯中，從而製備出懸浮液;所述的瓊脂糖水溶液中添加有KCl，且KCl的質量是瓊脂糖質量的1.5-3.5 % ;所述的甲苯中含有的聚醋酸乙烯酯和油酸，且其質量分別為甲苯質量的1.5-3%和0.1-1%;所述的油相與水相的體積比為6-8:1;
[00?0] 2)分散乳化
[0011 ]將步驟I)所得的懸浮液，維持在70°C條件下，攪拌0.5-2h ；
[0012]3)交聯反應
[0013]在步驟2)處理後的溶液中加入環氧氯丙烷，並滴加質量濃度為50%的NaOH溶液，且在Ih內滴加完畢;保持溫度在70°C下，反應3h;所述的環氧氯丙烷與瓊脂糖的質量比為3:1;所述的NaOH溶液的體積與環氧氯丙烷的體積相同；
[0014]4)固化
[0015]將步驟3)交聯反應後得到的產品，進行冷凝，控制冷卻速度2°C/min至溫度冷卻至10°C以下;多次清洗後製備出粒徑為100-300目的瓊脂糖凝膠微球。
[0016]優選的，KC1的質量是瓊脂糖質量的1.5-2.5%;
[0017]瓊脂糖乾粉末在水中需要高溫條件下加熱足夠長的時間才能夠充分溶解。同時加熱時間的增加會導致瓊脂糖鏈段逐漸發生水解，分子量逐漸降低，表現出的理化性質是粘度的下降。較低的粘度有利於更好的在有機相中形成顆粒更加均勻的瓊脂微球。但是瓊脂溶液的粘度變低也表明瓊脂糖的高分子鏈條被水解成了低分子鏈，不只會使球形度受到影響，還會影響微球的機械強度和分離性質。
[0018]為了既保證溶液的低粘度來提高微球的均勻性，又不至於使製備的微球機械強度變低，本申請通過在瓊脂糖水溶液中加入KCl來加快其溶解，減少其水解。KCl離子降低瓊脂糖電荷分子的電荷及水化作用，釋放自由水，所以瓊脂糖粘度下降，利於其在有機相中形成顆粒更加均勻的瓊脂微球。製備出的微球在後期水洗過程中，KCl被水洗掉，離子對瓊脂糖電荷分子的電荷及水化作用消失，鏈段沒有被水解，粘度增加，分子間作用力強，機械強度好。KCl量太少(低於1.5 % )，難以保證瓊脂糖溶液迅速溶解;KCl量太多(高於2.5 % )，鹽離子本身水化作用也增強，並增加了網狀結構，故粘度增加。
[0019]優選的，所述的油相與水相的體積比為6-7:1;
[0020]油水比是樹脂行業一個比較重要的概念，油水相的比例小，製備的微球較大或者粘連，不符合製備要求;在本產品中油水比高利於得到粒徑更小的球體，同時也會降低批產量，使生產效率降低;更小的油水比，相同的油相投的料更多，但不利於成球，在生產中微球容易發生粒度分布不均勻，球型差，表面不光滑甚至球體粘連，嚴重影響到微球的機械強度。通過實驗得到最佳的油水比為6-7:1。
[0021 ]優選的，聚醋酸乙烯酯加入量為甲苯質量的1.8-2.5%;
[0022]聚醋酸乙烯酯(PVAc)是一種分散劑，它通過降低表面張力，使瓊脂糖凝膠分散在甲苯之中，並且在瓊脂糖液滴的表面形成膠體，使分散後好的瓊脂糖液滴不會因為碰撞而聚積到一塊。當PVAc濃度為不足時，分散體系穩定會造成微球的粒徑分布很寬，這時球形度也差，形狀不規則，微球粘連比較嚴重，嚴重影響到微球的機械強度。反之當分散劑濃度過大，所得的微球粒徑過小。過多的分散劑會產生再分散現象，並且產生氣泡，嚴重影響微球均勻性和機械強度。綜合考慮所用影響因素，選擇聚醋酸乙烯酯的濃度範圍為1.8-2.5%。
[0023]優選的，油酸加入量與聚醋酸乙烯酯加入量質量比為1:10。
[0024]由於聚醋酸乙烯酯是一種高分子化合物，在甲苯中的溶解度有限，單用它還不足以得到合格的微球，油酸在甲苯中溶解性好，並且由於分子中同時具有親油的烷基和親水的羧基，可以對瓊脂糖液滴起到很好的保護作用。由於油酸更強的乳化作用，隨著加入量的增加，微球的粒徑在不斷地減小，並且乳化作用強使微球表面產生剝離導致表面不光滑，直接影響球的機械性能。油酸的量少，分散效果差，同樣影響微球的機械強度。通過實驗得到二者的最佳比例為1:10。
[0025]—是瓊脂糖水溶液的預處理。由於瓊脂糖為生物大分子，其分子構象受環境的影響。將瓊脂糖在水中室溫溶脹足夠的時間。關鍵技術之二是KCl量的選擇。瓊脂糖水溶液中KCl的質量為瓊脂糖質量的1.5-3.5%。關鍵技術之三是環氧氯丙烷的加入量，是瓊脂糖固體質量三倍，環氧氯丙烷量加入太多，影響有機相環境，不利於瓊脂糖的成球;環氧氯丙烷量加入太少，對瓊脂糖的交聯量太少，影響成球後的機械性能。關鍵技術之四是50 %的NaOH溶液加入量及加入方式，加入量太大會破壞瓊脂糖結構導致球的耐壓性能越差;加入量太少的化不利於環氧氯丙烷的交聯;加入不及時反應效率低，一次性加入過多，環氧開環。
[0026]制球和交聯一步進行，並且通過實驗關鍵影響因素的控制製備粒度均勻機械性能好的微球，簡化了其製備工藝，節約成本。
[0027]瓊脂糖的製備方法為懸浮攪拌法，將瓊脂糖凝膠溶液倒入有機相後，進行攪拌乳化，在體系中形成小液滴，加入環氧氯丙烷並間斷的加入NaOH溶液作為催化劑催化交聯反應，促使成球和交聯同時進行。
[0028]水相倒入油相，在機械攪拌和表面活性劑的雙重作用下，水相在油相中被分散成小液滴。鹼性環境下，瓊脂糖的-OH與有機相中擴散到液滴內的環氧氯丙烷發生交聯反應(反應方程式如下)，在濃度差的作用下使交聯繼續進行，直至達到化學平衡，隨著反應的進行水相體系的粘度增加，最後完全變成固化;同時PVAc降低了甲苯-瓊脂糖水溶液間的界面張力，並吸附於液滴表面，形成保護膜，防止滴間合併;攪拌反應足夠長，則液滴的破碎-合併以及PVAc和油酸在液滴表面的吸附和解吸達到平衡，液滴粒徑分布不再變化。此時交聯反應主要發生在微球表面，這樣製備的微球存在內部交聯和外層交聯，機械強度更好。
[0029]傳統的交聯微球的製備為兩步法:第一，製備出沒有交聯的瓊脂糖基球;第二，將製備出的成品凝膠微球加入環氧氯丙烷進行交聯反應;該方法下的交聯反應環氧氯丙烷只能在球的表面進行交聯，目前常見微球瓊脂糖的濃度為4%、6%、8%、12%，剩下的為水。環氧氯丙烷與水不互溶，因此交聯反應只能停留在球表面。
[0030]本申請中交聯微球的製備方法邊成球邊交聯，在成球中瓊脂糖在不停地碰撞和分配過程中瓊脂糖相與有機相中的環氧氯丙烷發生交聯，輕微交聯的水相瓊脂糖可能又與下一個水相液滴相溶，交聯繼續進行，在這個過程中凝膠微球交聯在表面逐漸穩定，這樣製備的微球存在內部交聯，機械強度更好。
[0031]球均勻度與表面活性劑聚醋酸乙烯酯(PVAc)和油酸有關，PVAc降低了甲苯-瓊脂糖水溶液間的界面張力，並吸附於液滴表面，形成保護膜，防止了滴間合併。分散時間足夠長，則液滴的破碎-合併以及PVAc和油酸在液滴表面的吸附和解吸達到平衡，液滴粒徑分布不再變化。本專利經過多次優化和驗證，探索出瓊脂糖凝膠微球均勻的表面活性劑比例。
[0032]本發明製備的交聯瓊脂糖凝膠介質同其他的層析介質相比，其明顯的優點是，原料便宜，製備過程簡便經濟，設備簡單;一步法製備的瓊脂糖凝膠微球較兩步製備的微球機械強度更好，球大小更均勻，且不影響其後期的微球表面接枝。
【附圖說明】
[0033]圖1為光學顯微鏡下本申請的實施例1製備的4B交聯瓊脂糖介質的照片(放大倍數為40)；
[0034]圖2為光學顯微鏡下GE4FF瓊脂糖介質的照片(放大倍數為40);
[0035]圖3為光學顯微鏡下本申請的實施例1製備的4B交聯瓊脂糖介質的照片(放大倍數為 100);
[0036]圖4為光學顯微鏡下GE4FF瓊脂糖介質的照片(放大倍數為100);
[0037]圖5為實施例1製備的交聯瓊脂糖凝膠介質和Sephar0Se4FF流速和壓力的關係曲線；
【具體實施方式】
[0038]下面的實例將對本發明提供的方法予以進一步的說明。
[0039]實施例1
[0040]取7.5g瓊脂糖於250mL水中(瓊脂糖水溶液濃度為3%)，常溫攪拌lh，加入
0.12gKCl繼續攪拌0.5h後，加熱至瓊脂糖沸騰，溶液呈現透明狀。準備1.5L甲苯溶液，加入23.49g聚醋酸乙烯酯和2.349g油酸。將有機相於70°C下恆溫攪拌至混合均勻，將沸騰的瓊脂糖水溶液倒入有機相中，一定攪拌下瓊脂糖的分散乳化lh。一次性加入22.5g環氧氯丙烷，分次滴加20mL50 %的NaOH溶液，Ih內滴加完畢。一定攪拌下固化3h後再進行冷凝，控制冷卻速度2°C/min至溫度冷卻至10°C以下。多次清洗後製備出粒徑為100-300目的瓊脂糖凝膠微球。
[0041 ] 實施例2
[0042]取1g瓊脂糖於250mL水中(瓊脂糖水溶液濃度為4%)，常溫攪拌lh，加入0.2gKCl繼續攪拌0.5h後，加熱至瓊脂糖沸騰，溶液呈現透明狀。準備1.75L甲苯溶液，加入30.45g聚醋酸乙烯酯和3.045g油酸。將有機相於70°C下恆溫攪拌至混合均勻，將沸騰的瓊脂糖水溶液倒入有機相中，一定攪拌下瓊脂糖的分散乳化lh。一次性加入30g環氧氯丙烷，分次滴加25mL50 %的NaOH溶液，Ih內滴加完畢。一定攪拌下固化3h後再進行冷凝，控制冷卻速度2 °C/min至溫度冷卻至10°C以下。多次清洗後製備出粒徑為100-300目的瓊脂糖凝膠微球。
[0043]實施例3
[0044]取15g瓊脂糖於250mL水中(瓊脂糖水溶液濃度為6%)，常溫攪拌lh，加入
0.375gKCl繼續攪拌0.5h後，加熱至瓊脂糖沸騰，溶液呈現透明狀。準備1.625L甲苯溶液，加入35.3g聚醋酸乙烯酯和3.53g油酸。將有機相於70°C下恆溫攪拌至混合均勻，將沸騰的瓊脂糖水溶液倒入有機相中，一定攪拌下瓊脂糖的分散乳化lh。一次性加入45g環氧氯丙烷，分次滴加38mL50 %的NaOH溶液，Ih內滴加完畢。一定攪拌下固化3h後再進行冷凝，控制冷卻速度2°C/min至溫度冷卻至10°C以下。多次清洗後製備出粒徑為100-300目的瓊脂糖凝膠微球。
[0045]實施例4
[0046]取20g瓊脂糖於250mL水中(瓊脂糖水溶液濃度為8% )，常溫攪拌lh，加入0.36gKCl繼續攪拌0.5h後，加熱至瓊脂糖沸騰，溶液呈現透明狀。準備1.7L甲苯溶液，加入32.5g聚醋酸乙烯酯和3.25g油酸。將有機相於70°C下恆溫攪拌至混合均勻，將沸騰的瓊脂糖水溶液倒入有機相中，一定攪拌下瓊脂糖的分散乳化lh。一次性加入60g環氧氯丙烷，分次滴加50mL50 %的NaOH溶液，Ih內滴加完畢。一定攪拌下固化3h後再進行冷凝，控制冷卻速度2 °C/min至溫度冷卻至10°C以下。多次清洗後製備出粒徑為100-300目的瓊脂糖凝膠微球。性能測試
[0047]I，圖1和圖3是本申請的實施例1製備的4B交聯瓊脂糖介質分別放大40和100倍數的圖片；圖2和圖4是GE4FF介質分別放大40和100倍數的圖片；相同放大倍數下圖1和圖2對比，圖3和圖4對比，圖1和圖3的樣相對比較均勻。(通過對比圖可以看出用該方法得到的瓊脂糖凝膠更均勻，從而具有更好的使用性能。)
[0048]2，採用層析系統測定，取交聯凝膠裝於1.6cm*20cm的柱中。柱床穩定後，通過逐步間隔式增大流速，觀察壓力的變化。記錄流速穩定時所呈現的恆定壓力值，繪製耐壓-流速曲線。如圖5所示。圖5反映了本專利下製備的瓊脂糖的交聯凝膠微球的機械強度可以達到GE4FF的水平。
【主權項】
1.一種瓊脂糖交聯凝膠微球的方法，其特徵在於，具體步驟如下: 1)懸浮液製備 將質量濃度為3-8%的瓊脂糖水溶液作為水相，倒入油相70°C的甲苯中，從而製備出懸浮液;所述的瓊脂糖水溶液中添加有KCl，且KCl的質量是瓊脂糖質量的1.5-3.5% ;所述的甲苯中含有的聚醋酸乙烯酯和油酸，且其質量分別為甲苯質量的1.5-3%和0.1-1%;所述的油相與水相的體積比為6-8:1; 2)分散乳化 將步驟I)所得的懸浮液，維持在70 °C條件下，攪拌0.5-2h; 3)交聯反應 在步驟2)處理後的溶液中加入環氧氯丙烷，並滴加質量濃度為50%的NaOH溶液，且在Ih內滴加完畢;保持溫度在70°C下，反應3h;所述的環氧氯丙烷與瓊脂糖的質量比為3:1;所述的NaOH溶液的體積與環氧氯丙烷的體積相同； 4)固化 將步驟3)交聯反應後得到的產品，進行冷凝，控制冷卻速度2°C/min至溫度冷卻至10°C以下;多次清洗後製備出粒徑為100-300目的瓊脂糖凝膠微球。2.如權利要求1所述的瓊脂糖交聯凝膠微球的方法，其特徵在於，所述的KCl的質量是瓊脂糖質量的1.5-2.5%。3.如權利要求1所述的瓊脂糖交聯凝膠微球的方法，其特徵在於，所述的油相與水相的體積比為6-7:1。4.如權利要求1所述的瓊脂糖交聯凝膠微球的方法，其特徵在於，所述的聚醋酸乙烯酯加入量為甲苯質量的1.8-2.5%。5.如權利要求1所述的瓊脂糖交聯凝膠微球的方法，其特徵在於，所述的油酸加入量與聚醋酸乙烯酯加入量質量比為1:10。
【專利摘要】本發明屬於高分子領域，具體為一種瓊脂糖交聯凝膠微球的製備方法。本申請提供了一種機械性能好、耐熱、耐壓性強並且粒度均一的微球；以瓊脂糖溶液為水相，甲苯為油相，採用環氧氯丙烷對瓊脂糖微球的形成過程進行交聯，製備機械性能較好的瓊脂糖凝膠微球。另一個目的是提供一種方便簡潔的交聯瓊脂糖凝膠微球的製備方法。
【IPC分類】C08J3/24, C08J3/16, C08K5/1515, C08L31/04, C08L5/12, C08K3/16, C08K5/09
【公開號】CN105713212
【申請號】CN201610168364
【發明人】劉書霞, 羅文軍, 王玲, 楊申勇
【申請人】艾美科健（中國）生物醫藥有限公司