一種負載rhBMP-2殼聚糖微球及其製備方法和應用的製作方法

2023-06-05 06:24:31

專利名稱：：一種負載rhBMP-2殼聚糖微球及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種蛋白類生物活性因子載體及其製備方法，更具體地涉及一種負載重組人骨形態發生蛋白-2(rhBMP1)殼聚糖微球及其製備方法。
背景技術：
：隨著基因工程和生物技術的發展，越來越多的生物活性因子用於治療和預防疾病。骨形態發生蛋白-2(bonemorphogeneticprotein-2，BMP-2)是轉化生長因子β超家族成員之一，具有誘導未分化的間充質幹細胞向成軟骨細胞和成骨細胞定向分化與增殖的能力，在修復骨缺損和促進骨癒合方面起重要作用(Reddi，Α.H.，Bonemorphogeneticproteins:frombasicsciencetoclinicalapplications.JBoneJointSurgAm,2001,83-ASuppll(Pt1):Sl-6)。但純的重組人骨形態發生蛋白-2和其它細胞生長因子一樣，容易被酶降解、體內半衰期短，在局部和全身應用很快被稀釋代謝，生物利用度很低，所以重組人骨形態發生蛋白-2的有效發揮需要合適的載體。殼聚糖(chitosan)是甲殼素的脫乙醯化產物，由2-氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖苷經糖苷鍵連接而成，是自然界中唯一的天然鹼性多糖，也是少數具有正電荷的天然產物之一。許多實驗表明殼聚糖具有良好的生物相容性和生物降解性，而且降解後的產物在體內安全、無毒副作用。目前，利用殼聚糖製備化療藥物、蛋白和基因等藥物的緩釋、控釋微球已取得較好的效果。為達到藥物的持續釋放，通常採用交聯劑對殼聚糖微球進行交聯°馮慶玲等(Niu,X.,etal.,PreparationandcharacterizationofchitosanmicrospheresforcontrolledreleaseofsyntheticoligopeptidederivedfromBMP-2.J.Microencapsulation,2009.26(4)=297-305)採用乳化一離子交聯法製備載重組骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球，將蛋白與殼聚糖的混合溶液滴入含表面活性劑的液體石蠟中，乳化後滴入三聚磷酸鈉溶液進行反應形成微球，產物採用大量石油醚、異丙醇清洗後冷凍乾燥，體外累積釋放7天達62.3%。黃鑫等將rhBMP與殼聚糖的混合溶液加入含表面活性劑的辛醇溶液中，乳化後採用生物交聯劑京尼平進行交聯，產物微球採用異丙醇、石油醚、水反覆漂洗，製得的重組人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球體外釋放可達30天。專利CN1016374M採用靜電液滴一離子交聯法製備了人骨形態發生蛋白_2殼聚糖微球。在靜電場下，將蛋白和殼聚糖的混合溶液滴入含三聚磷酸鈉的凝膠浴中，形成人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球，體外緩釋周期達4周以上。但是採用戊二醛、京尼平和三聚磷酸鈉等交聯劑製備的交聯殼聚糖微球在體內的炎症反應程度較純殼聚糖明顯增加，並且交聯降低了微球在體內降解速率(Mi,F.-L.,etal.，Invivobiocompatibilityanddegradabilityofanovelinjectable-chitosan-basedimplant.Biomaterials,2002,23(1):181-191)。同時製備過程中的界面效應、電壓、超聲攪拌等因素也易使蛋白失去活性，而且殼聚糖微球整個製備過程都要保持無菌操作，工藝相對繁瑣。
發明內容由於殼聚糖對蛋白有良好的親和能力，殼聚糖微球可通過疏水作用、靜電作用和氫鍵相互作用吸附蛋白，條件溫和，操作簡單，因此本發明的目的在於提供一種負載rhBMP-2殼聚糖微球，rhBMP-2吸附在所述殼聚糖微球上，不僅吸附容量高，且rhBMP-2不易失活。本發明的另一目的在於提供上述微球的製備方法。本發明的再一目的在於提供上述微球的應用。本發明的負載rhBMP-2殼聚糖微球，基質為殼聚糖微球，負載的藥物為rhBMP_2，所述rhBMP-2吸附在所述殼聚糖微球上，且rhBMP-2與殼聚糖的重量比為130100。根據本發明，所述殼聚糖微球的平均粒徑為1300μm。根據本發明，所述殼聚糖微球由殼聚糖與離子交聯劑發生反應再採用氫氧化鈉溶液處理製得。本發明的負載rhBMP-2殼聚糖微球的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟(a)、將殼聚糖溶液分散到含有表面活性劑的油相形成W/0型乳狀體系；(b)、將離子交聯劑溶液加入到所述W/0型乳狀體系反應112小時，加入丙酮，收集殼聚糖微球；(C)、經丙酮、無水乙醇和水依次洗滌後，將殼聚糖微球分散於水中，在緩慢攪拌下滴加濃度為0.15%(w/v)的氫氧化鈉溶液，直至反應體系最終PH值大於7，收集殼聚糖微球；(dl)、將殼聚糖微球用水洗滌或在水中透析後冷凍乾燥；或(業)將殼聚糖微球用0.01(w/w)硫酸水溶液浸泡160分鐘後，再用水洗滌或在水中透析後冷凍乾燥；(e)、將凍幹後的殼聚糖微球分散於含有0.1lOmg/mLrhBMP-2的溶液中，被動吸附加載0.512小時後，獲得的分散體直接冷凍乾燥即得所述負載rhBMP-2殼聚糖微球。根據本發明，所述表面活性劑為Span-80、TWeen-80或兩者的混合物；所述表面活性劑和油相的體積比為0.55100。根據本發明，所述油相為液體石蠟、正辛醇、蓖麻油、花生油、大豆油、橄欖油、葵花籽油或石油醚和液體石蠟的混合液。根據本發明，所述殼聚糖溶液和油相的體積比為1310。根據本發明，所述離子交聯劑為硫酸、三聚磷酸鈉、硫酸鈉或檸檬酸鈉。根據本發明，所述離子交聯劑為硫酸，所述離子交聯劑溶液為硫酸水溶液，濃度為1030%(w/w)。本發明提供的負載rhBMP-2殼聚糖微球的應用，用於製備治療骨損傷的藥物。本發明採用先乳化離子交聯，然後再部分脫除交聯結構製備殼聚糖微球，採用溫和的吸附策略製備攜載骨形態發生蛋白-2的殼聚糖微球，對生長因子的吸附容量高，操作簡單易行，製備過程不易染菌，不僅有利於製備過程中生長因子的活性維持，而且微球載體可保護生長因子不被體內的酶降解，提高其體內生物利用度。體外藥物釋放具有前期突釋和後期緩釋的特徵，動物實驗表明本發明的負載rhBMP-2殼聚糖微球能更好地促進新骨形成。圖1為紅外光譜圖，a為殼聚糖原料，b為先離子交聯再氫氧化鈉處理的殼聚糖微球。圖2為XRD圖，a為殼聚糖原料，b為先離子交聯再氫氧化鈉處理的殼聚糖微球。圖3為殼聚糖微球掃描電鏡照片。圖4為負載rhBMP-2殼聚糖微球在PBS(pH=7.4)緩衝液中緩釋曲線。圖5為負載rhBMP-2殼聚糖微球異位成骨的蘇木精一伊紅染色圖，X20。圖6為負載rhBMP-2殼聚糖微球異位成骨活性。具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明做進一步說明。應理解，以下實施例僅用於說明本發明而非用於限制本發明的範圍。通用方法(1)負載rhBMP-2殼聚糖微球的緩釋將20mg的負載rhBMP-2殼聚糖微球放入IOmL塑料試管中，加入PBS(pH=7.4)溶液5mL，在37°C恆溫震蕩，在不同時間點(分別為1，2，3，5，7，10，14，21，28，35和42天)進行離心分離，收集試管中上清液，同時補充新的PBS(pH=7.4)溶液5mL。取上清液ImL溶液，加入考馬斯亮蘭G250顯色劑5mL，混勻，放置^iin後用紫外分光光度計於595nm處測定吸光度，以不加蛋白溶液為空白。然後由rhBMP-2標準曲線方程計算上清液中rhBMP-2濃度。每個樣品平行測定三次，計算rhBMP-2累計釋放百分比並繪製釋放曲線。實施例1將分子量為30KDa、脫乙醯度為90%的殼聚糖，溶於2%(ν/ν)乙酸溶液中，配製成4(w/v)%殼聚糖溶液，脫泡後緩慢加入到5倍體積的含表面活性劑(Span-80和Tween-80體積比為21，表面活性劑和油相的體積比為1100。)的油相液體石蠟中，攪拌池，形成W/0乳液，加入等體積的20%(w/w)硫酸溶液進行交聯，繼續攪拌交聯4小時後，加入丙酮脫水，靜置分層，用丙酮、無水乙醇蒸餾水分別洗滌沉澱。然後將沉澱分散於水中，在磁力攪拌下滴加濃度為4%(w/v)的氫氧化鈉溶液，直至反應體系最終pH值大於7，再用丙酮、無水乙醇和水充分洗滌，冷凍乾燥後即得殼聚糖微球。採用紅外光譜和XRD對殼聚糖微球和殼聚糖原料進行分析，結果分別如圖1、圖2所示，表明殼聚糖微球和殼聚糖原料具有相同的化學結構，未引入其它基團；且殼聚糖微球經NaOH處理後，其結晶度下降，主要以無定形態存在。採用掃描電鏡觀察殼聚糖微球，如圖3所示，殼聚糖微球外觀圓整，平均粒徑為94士53μπι。按照rhBMP-2與殼聚糖微球重量比為110，將殼聚糖微球分散於含有rhBMP-2的水溶液中，被動吸附加載6小時後，將懸浮液直接冷凍乾燥得到負載rhBMP-2殼聚糖微球。如圖4所示，在PBS溶液(pH=7.4)中，rhBMP-2前期緩釋較快，7天累積釋放65%，隨後緩慢釋放達4周以上。先將生長2w的昆明種小鼠按體重的3%進行戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，仰臥固定於手術板上，將右大腿後外側剃毛消毒，切開約Icm的皮膚切口，鈍性分離大腿肌袋，植入如上製備的負載rhBMP-2的殼聚糖微球(其中含有100微克的rhBMP-幻後，縫合肌膜層和皮膚。手術後放入飼養盒中，進行正常的潔淨級標準飼料餵養。於手術後4周處死小鼠，其中1隻小鼠迅速取出植入材料及其周圍軟組織浸入10%的福馬林溶液中固定，切片，蘇木精一伊紅染色觀察成骨情況進行組織學觀察，如圖5所示，發現橫紋肌組織中可見骨組織，包括骨小梁及骨髓。另外4隻小鼠解剖其右腿取出新長的骨頭，如圖6所示，新骨的平均鮮重為300mg；把新骨放在高溫爐中600°C下煅燒6h，隨爐冷卻後，取出稱其灰分平均重量為39mg，證實所製備的負載重組人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球具有很好的誘導成骨活性。實施例2將分子量為50.5KDa、脫乙醯度為90%的殼聚糖，溶於3%(ν/ν)乙酸溶液中，配製成3%殼聚糖溶液脫泡後，緩慢加入到7倍體積的含表面活性劑Span-80(表面活性劑和油相的體積比為1100)的油相液體石蠟中，攪拌4h，形成W/0乳液，加入2倍體積的10%(w/w)硫酸溶液進行交聯，繼續攪拌交聯6小時後，加入丙酮脫水，靜置分層，用丙酮、無水乙醇蒸餾水分別洗滌沉澱。然後將沉澱分散於水中，在磁力攪拌下滴加濃度為2%(w/v)的氫氧化鈉溶液，直至反應體系最終PH值大於7；再將殼聚糖微球用(w/w)硫酸水溶液浸泡1分鐘後，再用丙酮、無水乙醇和水充分洗滌，冷凍乾燥後即得殼聚糖微球。殼聚糖微球平均粒徑為62士25μπι。按照重組人骨形態發生蛋白-2/殼聚糖微球重量比為120，將殼聚糖微球分散於含有重組人骨形態發生蛋白-2的溶液中，被動吸附加載8小時後，將懸浮液直接冷凍乾燥得到負載重組人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球，在PBS溶液(ρΗ=7.4)中重組人骨形態發生蛋白-2前期緩釋較快，7天累積釋放55%;隨後緩慢釋放達4周以上。樣品經如上小鼠肌袋內植入異位成骨活性試驗測試表明，4周後含100微克rhBMP-2的微球的樣品在肌袋內形成新鮮骨的平均重量為312mg；灰分平均重量為46mg，證實所製備的負載重組人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球具有很好的誘導成骨活性。實施例3將分子量為50KDa、脫乙醯度為95%的殼聚糖，溶於2%(ν/ν)乙酸溶液中，配製成3%殼聚糖溶液脫泡後，緩慢加入到3倍體積的含表面活性劑Tween-80(表面活性劑和油相的體積比為2100)。的油相液體石蠟中，攪拌池，形成W/0乳液，加入等體積的30%(w/w)硫酸溶液進行交聯，繼續攪拌交聯1小時後，加入丙酮脫水，靜置分層，用丙酮、無水乙醇蒸餾水分別洗滌沉澱。然後將沉澱分散於水中，在磁力攪拌下滴加濃度為4%(w/v)的氫氧化鈉溶液，直至反應體系最終PH值大於7；再用丙酮、無水乙醇和水充分洗滌，冷凍乾燥後即得殼聚糖微球。殼聚糖微球平均粒徑為27士10μm。按照重組人骨形態發生蛋白-2/殼聚糖微球重量比為18，將殼聚糖微球分散於含有重組人骨形態發生蛋白-2的溶液中，被動吸附加載4小時後，將懸浮液直接冷凍乾燥得到負載重組人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球，在PBS溶液(pH=7.4)中重組人骨形態發生蛋白-2的7天累積釋放68%。樣品經如上小鼠肌袋內植入異位成骨活性試驗測試表明，4周後含100微克rhBMP-2的微球的樣品在肌袋內形成新鮮骨的平均重量為330mg；灰分平均重量為45mg，證實所製備的負載重組人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球具有很好的誘導成骨活性。實施例4將分子量為30KDa、脫乙醯度為98%的殼聚糖，溶於1.5%(ν/ν)乙酸溶液中，配製成3%殼聚糖溶液脫泡後，緩慢加入到10倍體積的含表面活性劑(Span-80和Tween-80體積比為11，表面活性劑和油相的體積比為5100)。的油相液體石蠟中，攪拌池，形成W/0乳液，加入1.5倍體積的10%(w/w)硫酸溶液進行交聯，繼續攪拌交聯6小時後，加入丙酮脫水，靜置分層，用丙酮、無水乙醇蒸餾水分別洗滌沉澱。然後將沉澱分散於水中，在磁力攪拌下滴加濃度為0.1%(w/v)的氫氧化鈉溶液，直至反應體系最終pH值大於7;再將殼聚糖微球用0.01%(w/w)硫酸水溶液浸泡60分鐘後，再用丙酮、無水乙醇和水充分洗滌，冷凍乾燥後即得殼聚糖微球。殼聚糖微球平均粒徑為5士4μm。按照重組人骨形態發生蛋白-2/殼聚糖微球重量比為30100，將殼聚糖微球分散於含有重組人骨形態發生蛋白-2的溶液中，被動吸附加載0.5小時後，將懸浮液直接冷凍乾燥得到負載重組人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球，在PBS溶液(pH=7.4)中重組人骨形態發生蛋白-2的7天累積釋放73%。樣品經如上小鼠肌袋內植入異位成骨活性試驗測試表明，4周後含100微克rhBMP-2的微球的樣品在肌袋內形成新鮮骨的平均重量為350mg；灰分平均重量為48mg，證實所製備的負載重組人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球具有很好的誘導成骨活性。實施例5將分子量為90KDa、脫乙醯度為95%的殼聚糖，溶於3%(ν/ν)乙酸溶液中，配製成3%殼聚糖溶液脫泡後，緩慢加入到3倍體積的含表面活性劑Span-80(表面活性劑和油相的體積比為0.5100。)的油相液體石蠟和石油醚中，攪拌4h，形成W/0乳液，加入等體積20%(w/w)硫酸溶液進行交聯，繼續攪拌交聯12小時後，加入丙酮脫水，靜置分層，用丙酮、無水乙醇蒸餾水分別洗滌沉澱。然後將沉澱分散於水中，在磁力攪拌下滴加濃度為5%(w/ν)的氫氧化鈉溶液，直至反應體系最終pH值大於7；再用丙酮、無水乙醇和水充分洗滌，冷凍乾燥後即得殼聚糖微球。殼聚糖微球平均粒徑為沈5士35μm。按照重組人骨形態發生蛋白-2/殼聚糖微球重量比為1100，將殼聚糖微球分散於含有重組人骨形態發生蛋白-2的溶液中，被動吸附加載12小時後，將懸浮液直接冷凍乾燥得到負載重組人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球，在PBS溶液(pH=7.4)中重組人骨形態發生蛋白-2前期緩釋較快，7天累積釋放52%；隨後緩慢釋放達4周以上。樣品經如上小鼠肌袋內植入異位成骨活性試驗測試表明，4周後含100微克rhBMP-2的微球的樣品在肌袋內形成新鮮骨的平均重量為302mg；灰分平均重量為35mg，證實所製備的負載重組人骨形態發生蛋白-2殼聚糖微球具有很好的誘導成骨活性。表1實施例6-12製備的微球的性能權利要求1.一種負載rhBMP-2殼聚糖微球，基質為殼聚糖微球，負載的藥物為rhBMP-2，其特徵在於，所述rhBMP-2吸附在所述殼聚糖微球上，且rhBMP-2與殼聚糖的重量比為130100。2.根據權利要求1所述的負載rhBMP-2殼聚糖微球，其特徵在於，所述殼聚糖微球的平均粒徑為1300μm。3.根據權利要求2所述的負載rhBMP-2殼聚糖微球，其特徵在於，所述殼聚糖微球由殼聚糖與離子交聯劑發生反應再採用氫氧化鈉溶液處理製得。4.權利要求13任一項所述的負載rhBMP-2殼聚糖微球的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟(a)、將殼聚糖溶液分散到含有表面活性劑的油相形成W/0型乳狀體系；(b)、將離子交聯劑溶液加入到所述W/0型乳狀體系反應112小時，加入丙酮，收集殼聚糖微球；(C)、經丙酮、無水乙醇和水依次洗滌後，將殼聚糖微球分散於水中，在緩慢攪拌下滴加濃度為0.15%(w/v)的氫氧化鈉溶液，直至反應體系最終pH值大於7，收集殼聚糖微球；(dl)、將殼聚糖微球用水洗滌或在水中透析後冷凍乾燥；或(業)將殼聚糖微球用0.01(w/w)硫酸水溶液浸泡160分鐘後，再用水洗滌或在水中透析後冷凍乾燥；(e)、將凍幹後的殼聚糖微球分散於含有0.1lOmg/mLrhBMP-2的溶液中，被動吸附加載0.512小時後，獲得的分散體直接冷凍乾燥即得所述負載rhBMP-2殼聚糖微球。5.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於，所述表面活性劑為Span-80、Tween-80或兩者的混合物；所述表面活性劑和油相的體積比為0.55100。6.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於，所述油相為液體石蠟、正辛醇、蓖麻油、花生油、大豆油、橄欖油、葵花籽油或石油醚和液體石蠟的混合液。7.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於，所述殼聚糖溶液和油相的體積比為1310。8.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於，所述離子交聯劑為硫酸、三聚磷酸鈉、硫酸鈉或檸檬酸鈉。9.根據權利要求8所述的製備方法，其特徵在於，所述離子交聯劑為硫酸，所述離子交聯劑溶液為硫酸水溶液，濃度為1030%(w/w)。10.權利要求13任一項所述的負載rhBMP-2殼聚糖微球在製備治療骨損傷的藥物中的應用。全文摘要本發明公開了一種負載rhBMP-2的殼聚糖微球及其製備方法和應用。負載rhBMP-2殼聚糖微球的基質為殼聚糖微球，負載的藥物為重組人骨形態發生蛋白-2。先將殼聚糖與離子交聯劑發生反應再採用氫氧化鈉溶液處理製得殼聚糖微球，採用被動負載的方式加載rhBMP-2，rhBMP-2吸附在殼聚糖微球上，rhBMP-2與殼聚糖的重量比為1～30∶100。本發明的製備方法簡單易行，製備條件溫和，有利於rhBMP-2的生物活性保持。負載rhBMP-2殼聚糖微球能夠在較長時間內控制釋放rhBMP-2，促進新骨形成，能用於製備治療骨缺損、骨不連、骨延遲癒合的藥物。文檔編號A61K38/18GK102138905SQ20111006990公開日2011年8月3日申請日期2011年3月22日優先權日2011年3月22日發明者劉昌勝,王靖,錢秀珍申請人:華東理工大學