一種用轉基因羊大規模生產人纖溶酶原激活劑重組蛋白的方法

2023-06-04 22:01:36 1

專利名稱：一種用轉基因羊大規模生產人纖溶酶原激活劑重組蛋白的方法
技術領域：
本技術結合基因工程和細胞工程技術，屬生物工程領域的技術發明專利，本技術應用於大規模生產人重組纖溶酶原激活劑(hrPA)，其生產成本較細胞培養或工業發酵明顯降低，生產流程簡單，無需貴重儀器設備，而且獲得的生物藥品材料較其它方法製備的活性高，與人體的相容性好。
背景技術：
動物乳腺生物反應器技術是指利用哺乳動物乳腺特異性表達的啟動子元件構建表達載體並製備轉基因動物，使外源基因在轉基因動物的乳腺中表達，並從動物的乳汁中獲取重組蛋白，具有很高的商業應用價值。奶山羊具有產乳量高、飼養成本低等優點。雖然國外已有應用山羊開發生物藥品之先例，並已有兩個產品分別由美國FDA或歐洲藥品委員會批准應用於臨床。但在國內外尚無採用山羊乳腺生物反應器生產人重組溶血栓藥物的報導，因此，該技術屬原創性發明。近年來，隨著人們對血栓形成機制的不斷深入了解。有許多抗血栓藥物在臨床上已正式批准使用和試用，其中如:t-PA (組織型纖溶酶激劑)、pro-UK (尿激酶原)、rt-PA (重組t-PA)、APSAC (對-甲氧苯酚纖溶原鏈激酶激活劑複合物)、STAR (重組型葡萄球菌激酶)、TNK-t-PA和重組纖溶酶原激活劑(rPA)。以上溶栓劑開始作為藥物使用到至今，其開發基本分為三個階段。第一代溶栓劑包括鏈激酶(SK)和尿激酶(UK)，但缺乏纖維蛋白選擇性，易使α 2抗纖溶酶大量消耗及纖維蛋白原降解而產生全身性出血的副作用、重複使用有過敏反應。第二代溶栓劑包括t-PA (組織型纖溶酶激活劑)、pro-UK (尿激酶原)、APSAC(對-甲氧苯酚纖溶酶原鏈激酶激活劑複合物)。有明顯的纖維蛋白親和性，出血副作用較小，並在一定程度上能抵抗α2_抗纖溶酶的抑制作用。但由於t-PA治療後易出現再通，儘管t-PA的價格最高，一般人們普遍認為t-PA治療最有效安全。其中主要的第二代溶血栓藥物alteplase (中文商品名為阿替普酶，t_PA)是一種重組組織型纖溶酶原激活劑，這是世界上第一個基因重組溶栓藥，由美國Genetech公司開發上市。由於該藥需要在真核細胞中表達，工藝要求高，而且臨床使用劑量大，作用時間短，所以在生產上存在一些問題。目前溶栓藥已經發展到第三代。第三代溶栓劑包括STAR(重組型葡萄球菌激酶)、rt-PA (重組t-PA)、KlK2Pu、rPA和TNK-PA等以及正在制的新型溶栓劑。相比於前兩代溶栓劑，它們基本具備以下特點:溶栓能力強，特異性高，出血副作用小，在血液中的半衰期長，總使用劑量少等。其中，1996年德國寶靈曼(Boehringer Mannheim GmbH)公司研製的Reteplase (商品名Retavase,瑞替普酶)是其中的代表。瑞替普酶是一種蛋白質修飾藥物，為重組人組織型纖維蛋白溶解酶原激活劑缺失變異體，具有半衰期長、溶栓作用強、副作用小等優點，受到心腦血管病專家的重視。
第三代溶血栓藥物因其半衰期長、副作用小等特點，在臨床上具有較強的競爭性，但價格比較昂貴。國產瑞替普酶定價格為4000元/套(2004年)，這一售價對工薪階層來說還是相當昂貴。由於該藥物為國外自主智慧財產權，雖然價格昂貴，國內製藥企業利潤空間卻很小，大部分利潤歸於國外藥商。因此研究開發低成本的溶血栓藥物具有顯著的經濟效益和重大的社會意義。隨著基因工程技術和蛋白質工程技術的進步，更新、更有效、更方便使用、副作用更小的溶栓藥的開發勢在必行。利用轉基因動物乳腺生物反應器生產藥用蛋白是一種全新的生產模式，與以往的製藥技術相比，具有不可比擬的技術優越性:產量高、成本低、表達產物經過了充分的修飾和加工、生物活性高。因此，轉基因動物乳腺生物反應器的研究受到了各國科學家的關注，許多大的醫藥公司都紛紛投入資金資助此項研究。但由於這一技術的固有瓶頸，獲得生物學活性好轉、由轉基因動物生產的溶血栓藥品，目前尚無先例。綜上所述，目前臨床上用於治療血栓病的溶栓藥物以t-PA為代表，其主要依靠原核生物和哺乳動物細胞生產，存在生產成本高、產量小、比活性低、含內毒素等缺陷，致使其價格昂貴臨床治療費用高。除此之外，rPA在血中的半衰期甚短(3-5分鐘)，使得在臨床治療中為維持其有效濃度而必須大劑量靜脈滴注，從而增加了引起系統性出血的危險。此外，原核生產的生物藥品較哺乳動物生產的生物藥品與人體的相溶低差，有較高的免疫原性，易引起過敏。因此，設計並研製延長半衰期，降低系統出血傾向，高溶栓活性，給藥途徑簡單，價格便宜的新型rPA愈發重要，對於心血管病的治療具有實用意義。

發明內容
為了優化溶栓藥的生產和改良其藥物特性，本發明提供了一種新的方法，該方法可大規模製備人重組纖溶酶原激活劑(hrPA)。本技術針對目前hrPA生產和臨床應用所存在的優缺點，重新構建hrPA(pBC-hrPA)乳腺特異 性表達載體。並通過電轉染將外源基因導入山羊胎兒成纖維細胞，細胞經篩選獲得轉hrPA基因轉基因胎兒成纖維細胞。獲得的轉基因細胞株作為供核細胞，進行體細胞核移植，製備乳腺特異性表達的轉基因克隆羊，收集轉基因羊乳汁可提取具有溶栓活性的hrPA，用於生產溶血栓生物藥品。本發明公開了一種人重組組織纖溶酶原激活劑的結構基因，該基因的序列如SEQID N0.1所不，其中103 — 765為編碼序列。編碼蛋白的胺基酸序列如SEQ ID N0.2所不。本發明進一步構建了用於生產人纖溶酶原激活劑重組蛋白的乳腺特異性表達調控序列，由5』上遊3773bp調控序列、序列SEQ ID N0.1和3』的1608bp下遊調控序列組成；所述5』上遊3773bp調控序列取自Genebank:DQ417346.1序列的第94-3866片段，所述3』的1608bp下遊調控序列取自GenBank:Z33881.1序列的第6254-7862片段。一種用轉基因羊大規模生產人纖溶酶原激活劑重組蛋白的方法，步驟如下:(I)構建含有權利要求2所述結構基因的轉基因羊表達載體；(2)應用步驟(I)構建的基因表達載體轉染30-40日齡胎兒成纖維細胞，轉染條件為:細胞密度:1.0 - 1.6X IO6VrnL ;基因濃度:10_26ng/yL;應用Eppendorf公司生產的Multiportor電轉染儀進行電轉染，電參數:電壓280V、脈衝時間100 μ S、脈衝次數為I ;細胞在600-900 μ g/mL G418的DMEM培養液中篩選；獲得轉基因細胞；
(3)應用獲得的轉基因細胞進行細胞核移植，可出生hrPA轉基因克隆羊，獲得具有人纖溶酶原激活劑重組蛋白的羊奶。本技術利用動物乳腺生物反應器生產hrPA不僅維持了低成本生產，而且產量高，活性高(可進行翻譯後修飾和正確摺疊)，不需要復活，較天然t-PA具有更好的溶解的活性和更長的作用時間。本發明利用分子生物學技術，構建乳腺特異性表達載體，重新設計了編碼序列和乳腺特異性表達調控序列，實現了重組人溶栓酶原激活劑在山羊乳腺中表達。(I)轉基因羊高效表達重組hrPA是藥物材料製備技術的新突破；(2)通過試驗證明，從轉基因羊奶中獲得乳腺特異性表達產物hrPA具有溶解纖維蛋白的生物活性，表明該技術可用於製備溶栓劑，有潛在的巨大社會經濟效益及商業價值；(3)通過乳腺特異性表達轉基因羊獲得的hrPA可從羊奶中提取和純化，表明建立工藝流程和規模化生產該生物藥品的可行性。本發明的創新特點是人組織纖溶酶原激活劑基因作適當改造後其重組產物的溶纖比活性更高、表達載體的設計新穎而高效、獲得的人重組纖溶酶原激活劑分泌山羊乳汁中，這種表達產物可以從乳汁中被分離獲得並作進一步純化。(I)應用轉基因山羊生產具有溶纖活性的重組人纖溶酶原激活劑hrPA，通過編碼序列改造獲得重組hrPA。(2)設計了高效表達載體，應用該表達載體不僅能在動物乳腺中高效表達重組人纖溶酶原激活劑，而且產生的hrPA比活性高，能提取和純化，可用於製備治療血栓病的生物藥品。 (3)乳腺細胞中合成的人重組纖溶酶原激活劑經細胞內修飾、加工，具有激活纖維蛋白酶原的功能和有溶栓活性。(4)轉基因羊可大量生產的重組人hrPA，成本低、產量高、無需作進一步化學修飾或加工，通過該方法進行藥品生產具有完全自主智慧財產權。


圖1:hrPA乳腺特異性表達載體pBC_hrPA構建流程圖。圖2:利用轉基因山羊製備人纖溶酶原激活劑技術路線圖。圖3:轉基因羊整合檢測結果泳道1-4為DRB引物(內參引物)擴增電泳，I:BP21基因組，2:BP21基因組，3:正常羊基因組DNA，4:空白對照，泳道5-8為Pcmv+hrPA引物擴增電泳條帶，5:BP21羊組織基因組DNA，6:質粒pBC-hrPA，7:正常羊基因組DNA，8:空白對照。圖4:轉基因羊乳樣ELISA檢測結果Al-All 分別為 BP-21 (2011 年 3 月 8 日)、BP_21 羊(2012 年 5 月 10 日)、BP_21 羊(2012年4月9日)乳樣、陰性乳樣對照、陽性乳樣對照、陽性乳樣對照、正常乳樣對照、陽性對照、標準品32.lpg/ml、標準品1000pg/ml、藥品瑞替普酶0.018ng/ml。圖片顯示Al、A2、A3、A8、A9、A10、A11 為陽性。圖5:乳汁中hrPA表達產物Western Blot檢測
M:蛋白質分子量標準，Protein Molecular Weight Marker (Broad), TaKaRa,D532A; 1:陽性對照，2:BP-21羊乳清、3:BP-21羊乳清、4:正常羊乳清。圖6:轉基因羊乳汁溶纖活性檢測轉基因羊BP-21乳汁溶纖活性試驗，透明圓斑為纖維蛋白溶解部分，其圓斑直徑大，表明溶菌活性高。
具體實施例方式利用轉基因山羊製備人纖溶酶原激活劑技術路線如圖2，具體操作如下。實施例一:載體構建1、乳腺特性表達構件構建1.1 材料1.1.1質粒與菌株pUC57購自MBI公司；質粒pCEP4、購自Promega公司；質粒BnF95帶有山羊BLG基因5'、3'調控區和Nec/基因，由胚胎工程實驗室自製，可從本實驗室採購，或參考文獻:(中國博士論文庫，「乳蛋白與CMV複合啟動驅動hLF cDNA乳腺特異性表達」，作者:成勇，P57-83)自行構建 。大腸桿菌DH5a、 Η10β均可從生物工程公司購得。1.1.2主要試劑1.1.2.1所需Taq DNA聚合酶、dNTP Mixture,DNA Marker及各種限制性內切酶均來自TaKaRa公司產品；T4DNA Ligase購自上海生工生物工程有限公司；PCR純化試劑盒來自TaKaRa公司，膠回收試劑盒來自QIAGEN公司產品；其它化學試劑為分析純級。1.1.2.1 溶液配方(I)質粒提取溶液 1:50mM 葡萄糖，25mM Tris *HC1 (pH7.4), IOMmEDTA (pH7.4),高壓滅菌30min ;質粒提取溶液I1:0.4N NaOH, 2%SDS,現配現用；質粒提取溶液III:5M乙酸鉀60ml,冰乙酸11.5ml,加雙蒸水28.5ml, 4°C保存。(2) 4NNaOH:80g NaOH,加雙蒸水至 500mL。(3)10% SDS:100g SDS 溶於 90mL 水中，加熱至 68°C助溶，用 HCL 調 pH 值至 7.2，最後加雙蒸水至1000mL。(4) 5M LiCl.2H20:302.05g加900mL雙蒸水溶解後，定容至IOOOmL,高壓滅菌。(5) LB液體培養基:蛋白腖10g，酵母粉5g，NaCllOg,溶於900ml蒸餾水中，調節pH值至7.5，定溶至1000ml，高壓滅菌；LB固體培養基:蛋白腖10g，酵母粉5g，NaCl 10g，溶於800ml蒸餾水中，加瓊脂粉15g，調節pH值至7.5，定溶至1000ml，高壓滅菌。(6) TE 緩衝液:IOmMTris.Cl, ImM EDTA, ρΗ8.0，高壓滅菌。(7) 3MNaAc (pH5.2):246.04g無水乙酸鈉溶幹90mL水中，用冰乙酸調節pH值至
5.2,定容至IOOmL,高壓蒸汽滅菌。(8)氨苄青黴素貯存液:100mg/ml氨苄青黴素鈉，保存於-20°C。(9) RNaseA 溶液:將 RNaseA 溶於 IOmMTris.Cl (pH8.0)，15mMNaCl 中，配成 IOmg/ml的濃度，加熱煮沸100°C 15min, -20°C保存。(10) IPTG溶液:2g IPTG溶於9mL雙蒸H20，定容至10mL。用0.22 μ m的濾器過濾除菌，分裝成ImL/瓶，-20°C保存。
(ll)X-gal溶液:20mg X-gal溶於ImL 二甲基甲醯胺中，避光保存於_20°C。(12) PCR 退火緩衝液:IOmM Tris (pH7.5-8.0), 50mM NaCl, ImM EDTA，高壓蒸汽滅菌。1.1.3主要儀器DNA擴增儀，美國Bio-Rad公司，SlOOOThermal Cycler ；DNA電泳儀；恆溫水浴搖床；隔水式電熱恆溫培養箱均為國內產品；數碼凝膠成像儀，上海天能科技有限公司；電子分析天平，上海精密天平儀器總廠；pH檢測儀，梅特勒託利多上海公司；低溫高速離心機，；電轉染儀，電轉染杯是德國Eppendorf公司產品；-20°C低溫冷凍冰箱，_80°C低溫冷凍冰箱；超淨工作檯，蘇州淨化儀器設備廠。1.1.4DNA 分析軟體引物設計軟體:Primer premier5.0 ;序列同源性分析軟體:DNAstar和NCBI (www.ncb1.nlm.nih.gov)中的在線軟體BLSAT ；WP32質粒圖譜繪製軟體。1.2 方法1.2.1常規分子生物學操作方法常用分子克隆操作方法如:SDS鹼裂解法製備質粒DNA、純化質粒DNA、製備感受態大腸桿菌、大腸桿菌的電擊轉化、IPTG和X-gal篩選細菌菌落、DNA連接、瓊脂糖凝膠電泳、菌種的保存等實驗方法，依照《分子克隆實驗指南》第三版進行。hrPA乳腺特異性表達載體pBC_hrPA構建流程圖如圖1，具體操作如下:1.2.2hrPA突變體合成根據SEQ ID N0.1序列合成hrPA編碼序列，並在上、下遊兩'端分別添加Xho I酶切位點，送DNA合成公司進行基因合成。1.2.3合成基因克隆載體PUC57合成SEQ ID N0.1DNA 序列插入 pUC57 多克隆位點:「XbaI5』ACTCGA-NNN_TCGAGA3』BamHI」，連接產物轉化DH5a感受態細胞，塗LB平板(Amp，IPTG，X-Gal)，37°C培養14h 16h，篩選白色陽性克隆菌落，常規鹼裂解法提取重組質粒。重組質粒命名為pUC-hrPA。純化產物與PUC57載體連接體系如下:，
權利要求
1.一種人重組組織纖溶酶原激活劑的基因，其特徵在於該基因的序列如SEQ ID N0.1所不，其中103 — 765為編碼序列。
2.一種用於生產人纖溶酶原激活劑重組蛋白的結構基因，其特徵在於由5』上遊3773bp調控序列、權利要求1所述的序列SEQ ID N0.1和3』的1608bp下遊調控序列構成；所述5』上遊3773bp調控序列取自Genebank:DQ417346.1序列的第94-3866片段，所述3』的1608bp下遊調控序列取自GenBank: Z33881.1序列的第6254-7862片段。
3.一種用轉基因羊大規模生產人纖溶酶原激活劑重組蛋白的方法，其特徵在於步驟如下: (1)構建含有權利要求2所述結構基因的轉基因羊表達載體， (2)應用步驟(I)構建的基因表達載體轉染30-40日齡胎兒成纖維細胞，轉染條件為:細胞密度:1.0 — 1.6X107mL;基因濃度:26ng/yL;應用Eppendorf公司生產的Multiportor電轉染儀進行電轉染，電參數:電壓280V、脈衝時間100 μ S、脈衝次數為I ;細胞在600-900 μ g/mL G418的DMEM培養液中篩選；獲得轉基因細胞； (3)應用獲得的轉基因細胞進行細胞核移植，可出生hrPA轉基因克隆羊，獲得具有人纖溶酶原激活劑重組蛋白的羊奶。
全文摘要
本發明屬生物工程領域，提供了重組人纖溶酶原激活劑的新序列，如SEQ ID NO.1所示，這種序列可用製備乳腺特異性表達重組人纖維蛋白酶原激活劑；此DNA序列的動物表達重組產物促進纖維蛋白溶解的作用也得到試驗和證實；本發明還公開了用於hrPA轉基因羊製備的乳腺表達載體的結構。細胞轉染外源基因操作步驟、轉染外源基因的細胞篩選及轉基因細胞核移植，獲得轉基因克隆羊；該技術可用於大規模製備用於人心血病治療的溶血栓藥物，其生產成本低、安全性高、產物活性高。本發明具有完全自主的智慧財產權，後續開發產品為自主產品。該發明具有廣闊的產業前景和巨大的經濟效益。
文檔編號C12N15/58GK103194468SQ201310147589
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月25日 優先權日2013年4月25日
發明者成勇 申請人:揚州大學