大引物pcr進行定點突變的方法
2023-06-05 09:19:26
專利名稱：：大引物pcr進行定點突變的方法
技術領域：
：本發明涉及定點突變的聚合酶鏈式反應，特別是一種大引物PCR進行定點突變的方法。首先由突變引物和相應的外側引物進行第一步PCR，其產物即大引物不需純化，與加入另一外側引物引發第二輪PCR擴增出目標片段。本發明是克服了常規大引物和外側引物退火溫度(Tm)相差顯著的要求，並使突變效率達到100%。適合實驗室分子生物學手段研究。
背景技術：
：聚合酶鏈式反應(PolymeraseChainReaction,PCR)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，為最常用的分子生物學技術之一。典型的PCR由(1)高溫變性模板；(2)引物與模板退火；(3)引物沿模板延伸三步反應組成一個循環，通過多次循環反應，使目的DNA得以迅速擴增。其主要步驟是將待擴增的模板DNA置高溫下(通常為93'C-94°C)使其變性解成單鏈；人工合成的兩個寡核苷酸引物在其合適的復性溫度下分別與目的基因兩側的兩條單鏈互補結合，兩個引物在模板上結合的位置決定了擴增片段的長短；耐熱的DNA聚合酶(Taq酶)在72'C將單核苷酸從引物的3'端開始摻入，以目的基因為模板從5'—3'方向延伸，合成DNA的新互補鏈。PCR能快速特異擴增任何已知目的基因或DNA片段，並能輕易在皮克(pg)水平起始DNA混合物中的目的基因擴增達到納克、微克、毫克級的特異性DNA片段。因此，PCR技術一經問世就被迅速而廣泛地用於分子生物學的各個領域。它不僅可以用於基因的分'離、克隆和核苷酸序列分析，還可以用於突變體和重組體的構建，基因表達調控的研究，基因多態性的分析，遺傳病和傳染病的診斷，腫瘤機制的探索，法醫鑑定等諸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有著以下多種用途1)生成雙鏈DNA中的特異序列作為探針；2)由少量mRNA生成cDNA文庫；3)從cDNA中克隆某些基因；4)生成大量DNA以進行序列測定；5)突變的分析；6)染色體步移；7)RAPD、AFLP、RFLP等DNA多態性分析等。經典的大引物PCR定點突變技術需要三個引物，兩條外側正向和反向引物以及內部突變引物。首先由突變引物和相應外側引物進行第一輪PCR得到大引物，經純化後與另一外側引物引發第二輪PCR得到目標片段。近年來，國內外學者對大引物PCR方法進行了改進優化，使得第一步PCR產物不需純化，可直接在一個反應管內進行第二步PCR。但此方法要求引物的Tm有顯著差異，第二輪PCR引物Tm高於第一輪PCR引物Tm值，才能排除低Tm值外側引物的幹擾，省略了第一步的純化，進行特異性擴增。然而此方法的突變效率不能達到100%。
發明內容本發明的目的是提供一種新的大引物PCR進行定點突變的方法。突破了現有大引物PCR方法對引物設計時退火溫度差距顯著的要求，同時解決了突變效率不高的缺點，使之更加簡單、高效，並使突變效率達到100%，適合實驗室分子生物學手段研究。本發明提供的大引物PCRiS行定點突變的方法的步驟包括設計的正反向引物不受退火溫度差距大的要求的限制，長度為24—39bp，優選長度27-34bp，5'端根據原模板需要引入各種酶切位點，3'端與模板互補，互補的鹼基數為9-14bp，優選鹼基數為9bp;根據要突變的鹼基所處序列的位置設計突變引物，包括要突變原始序列的後部分的鹼基，則突變引物要與下遊引物相對應，二者引發第一輪PCR反應；要突變原始序列前半部分的鹼基，則應與上遊引物相對應，二者引發第二輪PCR反應；將需要突變的鹼基替換成期望突變後的鹼基，並在其位點前後各延伸12bp，實現定點突變；突變引物的退火溫度要高於正反向引物，具體的步驟1)首先由突變引物和其對應的外側引物引發第一輪PCR反應，擴增出含突變鹼基的基因片段，實現大片段的合成，即大引物；2)產物不需純化，直接在同一反應管中加入另一外側引物、四種脫氧核糖核苷酸和DNA聚合酶，引發第二輪PCR反應，實現目標片段的合成；兩條外側引物和突變引物的退火溫度相差10"16'C。一種大引物PCRS行定點突變的方法，包括的步驟編碼人幹擾素a2b的全長原始序列(IFN-a2b)為模板，498bp，根據該原序列模板設計的上、下遊引物和2個突變引物上遊引物5，-CATAAGCTTATGTGTGATCTGCCTCAA-3，下遊引物5'陽GTCGAATTCTTCCTTACTTCTTAATCT-3，突變引物1:5'-TGTGTGATACAGGAGGTGGGGGTGGAGGAGACTCCCCTG陽3，突變引物25，-CTCATGGAGGACGCTGATGGCCTGAGCCTTTTGGAA-3'1)首先由突變引物和其對應的外側引物引發第一輪PCR反應，擴增出含突變基因片段，即大引物；PCR反應體系10^1Buffer緩衝液，8nldNTP，2pl下遊引物,2nl突變引物1,1(11幹擾素原始序列為模板,76nl超純水，lplpfil酶；第一輪PCR反應條件94'C變性4min，6(TC下退火30s,72。C下延伸30s;94'C變性40s,60'C下退火30s，72'C下延伸30s;(24個循環)94。C變性40s，60。C下退火30s，72。C下延伸5min;(2)產物不需純化，直接在同一反應管中加入另一外側引物、四種脫氧核糖核酸(dNTP)和DNA聚合酶(pfU酶)，引發第二輪PCR反應。PCR反應體系10nlBuffer緩衝液,8pldNTP，2pl上遊引物，lplpfti酶；第二輪PCR反應條件94。C變性40s,68X:下退火25s，72'C下延伸lmin;(10個循環)94°C變性40s，55°C下退火25s，72°C下延伸1min;(12個循環)最後72'C下延伸5min。所述的定點突變是多個位點的突變，且多個突變位點間可以相鄰或者間隔。所述的兩條外側引物的長度為27—30鹼基，解鏈溫度為55—65'C。所述的突變引物的長度為36—39鹼基，解鏈溫度為70—75°C。在所設計的突變引物長度範圍內，突變點是1一5個多個位點突變，最適多個位點突變數目為3—4個。所述的方法得到的突變後的基因序列。所述的方法得到的幹擾素a2b的突變後的基因序列。含有權利要求7所述的IFN-a2b突變後的基因序列的質粒pET-IFN-a2bl和pET-IFN-a2b2以及具有Top10(rh-IFN-a2bl)和ToplO(rh-IFN-a2b2)的轉化子，分別由所述質粒pET-IFN-a2bl和pET-IFN-a2b2轉化大腸桿菌感受態細胞而獲得。所述的原模板為幹擾素a2b原始基因序列。所述的引物濃度為2(HiM。本發明的大引物PCR新方法，不僅克服了常規大引物和外側引物退火溫度(Tm)相差顯著的要求，解決了突變效率不高的缺點，使之更加簡單、高效，並使突變效率達到ioo%。適合實驗室分子生物學手段研究。圖l是實施例1的兩輪PCR產物電泳結果圖。圖2是實施例2的兩輪PCR產物電泳結果圖。圖3是實施例l的酶切產物電泳結果圖。圖4是實施例2的酶切產物電泳結果圖。圖5是質粒pET-IFN-a2b構建示意圖。具體實施例方式實施例h實驗步驟'(1)通過NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)資料庫檢索的人源幹擾素a2b原始序列，運用primerpremier5.0軟體設計出該序列的上、下遊引物，再根據要突變的鹼基，設計出含有突變鹼基的突變引物l。(2)由突變引物l和其對應的外側引物(所述的引物濃度為20pM)引發第一輪PCR反應，擴增出含突變基因片段，即大引物。設計上、下遊引物和突變引物序列，結果見表l。tableseeoriginaldocumentpage7表l中下劃線部分是突變後的鹼基。上遊引物中CAT是保護鹼基，AAGCTT是酶切位點；下遊引物中GTC是保護鹼基，GAATTC是酶切位點。由突變引物1和下遊引物引發第一輪PCR反應，反應結束後再加入上遊引物，它和上一輪PCR形成的大引物引發第二輪PCR反應。由表中退火溫度可知，突變引物和上、下遊引物的退火溫度相差在10-16。C之間，上、下遊引物之間退火溫度相差在0-5。C之間。PCR反應體系10plBuffer緩衝液(200mMTris-HCl,100mM(NH4)2SO4，100mMKC1,1%TritonX-100，20mMMgCl2,pH8.8),8pldNTP,2^1下遊引物，2nl突變引物1,1pi幹擾素a2b原始序列為模板,76nl超純水，l^ilpfo酶(北京鼎果生物技術有限公司)。第一輪PCR反應條件94。C變性4min，60。C下退火30s，72。C下延伸30s;94'C變性40s,6(TC下退火30s，72。C下延伸30s;(24個循環)94r變性40s,60。C下退火30s，72。C下延伸5min。取出5nl產物跑EB(Ethidiumbromide,溴化乙錠)電泳，根據其條帶位置與marker(DNA標準條帶)比較驗證合成的大引物鹼基數目是否正確。如果正確，可進行下一步;不正確的話，適當改變反應條件重新進行PCR反應。(3)產物不需純化，直接在同一反應管中加入另一外側引物、四種脫氧核糖核酸(dNTP)和DNA聚合酶(pfU酶)，引發第二輪PCR反應。PCR反應體系6pldNTP，2nl上遊引物,lnlpfu酶(同上)。第二輪PCR反應條件94。C變性40s，68。C下退火25s，72。C下延伸lmin;(10個循環)94。C變性40s,55。C下退火25s，72。C下延伸lmin;(12個循環)最後72'C下延伸5min。(4)反應結束後，取出5pl產物跑EB電泳，根據其條帶位置與marker比較驗證合成的含突變位點的幹擾素序列的鹼基數目是否正確。條帶位置正確，將PCR產物純化(採用EZSpinColumnPCRProductPurificationKit(BBI)試劑盒純化)。(5)用下面結果檢驗方法驗證突變的位點。結果檢驗和對比-將突變後的幹擾素a2b片斷和pET28C載體質粒分別用HindIII、EcoRI雙酶切，按插入的突變後的幹擾素a2b片段載體=3:1的比例混合上述酶切純化後的產物，用同體積的連接緩衝液(DNALigationKitVer2.O(TakaRa寶生物大連有限公司)試劑盒的SolutionI(酶溶液))，在16'C下連接lh，將合成的突變基因片段插入到質粒pET-28C的HindIII和EcoRI酶切位點之間，即可得到含有突變後的幹擾素a2b基因序列的質粒PET-IFN-a2bl。將連接產物在42'C熱擊條件下轉化到Topl0大腸桿菌感受態細胞中，加入40(HULB液體培養基預培養50min後，取200W塗布在加有卡納黴素的平板上，37'C培養，即可獲得命名為T叩10(rh-IFN-a2bl)的轉化子。用牙籤挑取轉化子加入有5mlLB液體培養基的試管中搖床培養12h後，提取質粒，用HindIII、EcoRI雙酶切，酶切產物用1%的EB電泳驗證，結果如圖3所示，在500bp有片斷。將菌液測序(北京三博遠志生物技術有限責任公司)，測序結果進行比對，突變位點正確，準確率100%。實施例2:實驗步驟(1)同實例l，運用primerpremier5.0軟體設計出幹擾素a2b原始序列的上、下遊引物，再根據要突變的鹼基，設計出含有突變鹼基的突變引物2。(2)首先由突變引物和其對應的外側引物引發第一輪PCR反應，擴增出含突變基因片段，即大引物。設計上、下遊引物和突變引物序列，結果見表2。表2tableseeoriginaldocumentpage8表2中下劃線部分是突變後的鹼基。上遊引物中CAT是保護鹼基，AAGCTT是酶切位點；下遊引物中GTC是保護鹼基，GAATTC是酶切位點。由突變引物2和上遊引物引發第一輪PCR反應，反應結束後再加入下遊引物，它和上一輪PCR形成的大引物引發第二輪PCR反應。由表中退火溫度可知，突變引物和上、下遊引物的退火溫度相差在10-16'C之間，上、下遊引物之間退火溫度相差在0-5'C之間。PCR反應體系10plBuffer緩衝液(同上)，8nldNTP，2pl上遊引物，2pl突變引物2,1pl幹擾素a2b原始序列為模板,76pl超純水，lnlpfti酶(同上)。第一輪PCR反應條件94'C變性4min,60'C下退火30s，72。C下延伸30s;94。C變性40s，60。C下退火30s，72。C下延伸30s;(24個循環)94。C變性40s,6(TC下退火30s，72。C下延伸5min。取出5pl產物跑EB電泳，根據其條帶位置與marker比較驗證合成的大引物鹼基數目是否正確。如果正確，可進行下一步；不正確的話，適當改變反應條件重新進行PCR反應。(3)產物不需純化，直接在同一反應管中加入另一外側引物、四種脫氧核糖核酸(dNTP)和DNA聚合酶(pfU酶)，引發第二輪PCR反應。PCR反應體系6|aldNTP，2nl下遊引物，lnlpfia酶(同上)。第二輪PCR反應條件94'C變性40s,68。C下退火25s，72'C下延伸lmin;(10個循環)94。C變性40s，55。C下退火25s，72。C下延伸lmin;(12個循環)最後72'C下延伸5min。(4)反應結束後，取出5nl產物跑EB電泳，根據其條帶位置與marker比較驗證合成的含突變位點的幹擾素序列的鹼基數目是否正確。條帶位置正確，將PCR產物純化(同上)，即得到含有突變位點的幹擾素基因序列。(5)結果檢驗和對比方法同實施例l。由於突變位點不同，獲得的幹擾素a2b突變片斷不同，我們將實例2中獲得的轉化子命名為T叩10(rh-IFN-ci2b2)。將菌液測序(北京三博遠志生物技術有限責任公司)，測序結果進行比對，突變位點正確，準確率100%。序列表SEQUENCELISTING天津大學〈120〉大引物PCR進行多位點定點突變的方法〈130>200707〈160>7〈170〉Patentlnversion3.41〈211〉27〈212〉DNA〈213〉幹擾素(IFN-a2b)〈400〉1cataagcttatgtgtgatctgcctcaa27〈210〉2〈211>27〈212〉DNA〈213〉幹擾素(IFN-a2b)〈400>2gtcgaattcttccttacttcttaatct27〈210>3〈211〉39〈212〉DNA〈213〉幹擾素(IFN-a2b)3tgtgtgatac鄉aggtgggggtggaggagactcccctg39〈210〉4〈211>36〈212〉DNA〈213>幹擾素(IFN-a2b)4ctcatggaggacgctgatggcctgagccttttggaa36〈210〉5.498DNA〈213〉幹擾素(IFN—a2b)〈400>5tgtgatctgcctcaaacccacagcctgggtagcaggaggaccttgatgctcctggcacag60atgaggagaatctctcttttctcctgcttgaaggacagacatgactttggatttccccag120gaggagtttggcaaccagttccaaaaggctgaaaccatccctgtcctccatgagatgatc180cagcagatcttcaatctcttcagcacaaaggactcatctgctgcttgggatgagaccctc240ctagacaaattctacactgaactctaccagcagctgaatgacctggaagcctgtgtgata300cagggggtgggggtgacagagactcccctgatgaaggaggactccattctggctgtgagg360aaatacttccaaagaatcactctctatctgaaagagaagaaatacagcccttgtgcctgg420gaggttgtcagagcagaaatcatgagatctttttctttgtcaacaaacttgcaageiaagt480tt33gaagta3gg38tg3498〈210>6〈211>516重組幹擾素(rh-IFN-a2b)6cataagcttatgtgtgatctgcctcaaacccacagcctgggtagcaggaggaccttgatg60ctcctggcacagatgaggagaatctctcttttctcctgcttgaaggacagacatgacttt120ggatttccccaggaggagtttggcaaccagttccaaaaggctgaaaccatccctgtcctc180catgagatgatccagcagatcttcaatctcttcagcacaaaggactcatctgctgcttgg240gatgagaccctcctagacaaattctacactgaactctaccagcagctgaatgacctggaa300gcctgtgtgatacaggaggtgggggtggaggagactcccctgatgaaggaggactcc&tt360ctggctgtgaggaaatacttccaaagaatcactctctatctgaaagagaagaaatacagc420ccttgtgcctgggaggttgtcagagcagaaatcatgagatctttttctttgtcaacaaac480ttgcaagaaagtttaagaagtaaggaagaattcgac516〈210>7DNA〈213〉重組幹擾素(rh-IFN-a2b)〈400〉7cataagcttatgtgtgatctgcctcaaacccacagcctgggtagcaggaggaccttgatg60ctcctggcacagatgaggagaatctctcttttctcctgcttgaaggacagacatgacttt120ggatttcccceiggaggagtttggcaaccagttccaaaaggctcaggccatcagcgtcctc180catgagatgatccagcagatcttcaatctcttcagcacaaaggactcatctgctgcttgg240gatgagaccctcctagacaaattctacactgaactctaccagcagctgaatgacctggaa300gcctgtgtgatacagggggtgggggtgacagagdctcccctgatgaaggaggactccatt360ctggctgtgaggaaatacttccaaagaatcactctctatctgaaagagaagaaatacagc420ccttgtgcctgggaggttgtcagagcagaaatcatgagatctttttctttgtcaacaaac■ttgcaagaaagtttaagsagt犯ggaag犯ttcgsc51權利要求1、一種大引物PCR進行定點突變的方法，其特徵在於包括的步驟設計的正反向引物不受退火溫度差距大的要求的限制，長度為24-39bp，優選長度27-34bp，5』端根據原模板需要引入各種酶切位點，3』端與模板互補，互補的鹼基數為9-14bp，優選鹼基數為9bp；根據要突變的鹼基所處序列的位置設計突變引物，包括要突變原始序列的後部分的鹼基，則突變引物要與下遊引物相對應，二者引發第一輪PCR反應；要突變原始序列前半部分的鹼基，則應與上遊引物相對應，二者引發第二輪PCR反應；將需要突變的鹼基替換成期望突變後的鹼基，並在其位點前後各延伸12bp，實現定點突變；突變引物的退火溫度要高於正反向引物，具體的步驟1)首先由突變引物和其對應的外側引物引發第一輪PCR反應，擴增出含突變鹼基的基因片段，實現大片段的合成，即大引物；2)產物不需純化，直接在同一反應管中加入另一外側引物、四種脫氧核糖核苷酸和DNA聚合酶，引發第二輪PCR反應，實現目標片段的合成；兩條外側引物和突變引物的退火溫度相差10-16℃。2、一種大引物PCR進行定點突變的方法，其特徵在於包括的步驟編碼人幹擾素a2b的全長原始序列(IFN-a2b)為模板，498bp，根據該原序列模板設計的上、下遊引物和2個突變引物上遊引物5，-CATAAGCTTATGTGTGATCTGCCTCAA-3，下遊引物5，-GTCGAATTCTTCCTTACTTCTTAATCT-3，突變引物1:5，-TGTGTGATACAGGAGGTGGGGGTGGAGGAGACTCCCCTG-3'突變引物2:5，-CTCATGGAGGACGCTGATGGCCTGAGCCTTTTGGAA-3'1)首先由突變引物和其對應的外側引物引發第一輪PCR反應，擴增出含突變基因片段，即大引物；PCR反應體系lOplBuffer緩衝液，8pldNTP，2^1下遊引物,2iul突變引物l,lW幹擾素原始序列為模板,76nl超純水，lplpfU酶；第一輪PCR反應條件94'C變性4min，60'C下退火30s，72。C下延伸30s;94'C變性40s，60。C下退火30s，72。C下延伸30s;(24個循環)94°C變性40s，60°C下退火30s，72°C下延伸5min;(2)產物不需純化，直接在同一反應管中加入另一外側引物、四種脫氧核糖核酸(dNTP)和DNA聚合酶(pfo酶)，引發第二輪PCR反應。PCR反應體系10plBuffer緩衝液，8pldNTP，2W上遊引物，linlpfu酶；第二輪PCR反應條件94"C變性40s,68'C下退火25s，72'C下延伸lmin;(10個循環)94'C變性40s，55'C下退火25s，72'C下延伸lmin;(12個循環)最後72'C下延伸5min。3、根據權利要求l所述的方法，其特徵在於所述的定點突變可以是多個位點的突變，且多個突變位點間相鄰或者間隔。4、根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於所述的兩條外側引物的長度為27—30鹼基，解鏈溫度為55—65'C。5、根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於所述的突變引物的長度為36—39鹼基，解鏈溫度為70—75'C。6、根據權利要求3所述的方法，其特徵在於在所設計的突變引物長度範圍內，突變點是2—5個多個位點突變，最適多個位點突變數目為3—4個。7、權利要求1或2所述的方法得到的突變後的基因序列。8、權利要求2所述的方法得到的幹擾素a2b的突變後的基因序列。9、含有權利要求7所述的IFN-a2b突變後的基因序列的質粒pET-IFN-a2bl和pET-IFN-a2b2。10、具有ToplO(rh-IFN-a2bl和rh-IFN-a2b2)的轉化子，由權利要求8所述質粒pET-IFN-a2bl和pET-IFN-a2b2轉化大腸桿菌感受態細胞而獲得。全文摘要本發明提供一種大引物PCR進行定點突變的方法。首先由突變引物和相應的外側引物進行第一步PCR，其產物即大引物不需純化，與加入另一外側引物引發第二輪PCR擴增出目標片段。本發明克服了常規大引物和外側引物退火溫度(Tm)相差顯著的要求，並使突變效率達到100％，適合實驗室分子生物學手段研究。文檔編號C12N15/01GK101210240SQ20071006015公開日2008年7月2日申請日期2007年12月25日優先權日2007年12月25日發明者元英進,劉春傑,祝琳琪,趙廣榮,超黃申請人:天津大學