生物降解磁性納米顆粒及其製法和應用的製作方法
2023-06-18 11:09:26
專利名稱：生物降解磁性納米顆粒及其製法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬納米材料領域，特別涉及應用於生物技術的納米材料。
背景技術：
細胞分離技術的基本原理是根據不同細胞群具有不同的物理學、化學、生物學以及免疫表型特性，選擇相應的一種或幾種方法將特定的靶細胞群從混合的細胞群或組織中分離出來。最初分離富集細胞的主要方法即是依據細胞具有不同比重，採用包括速度離心沉澱、密度梯度離心等技術進行分離，但是時間長、效果差。七十年代中後期流式細胞分析及分選技術和單克隆抗體技術的出現和發展，使細胞分離技術出現了質的飛躍。應用單克隆抗體螢光染色與流式細胞分選相結合的螢光激活細胞分選(Fluorescence-activated cellsorting，FACS)技術極大地提高了細胞分離純化的效率，使得高效快速分離純化一些含量極少的細胞群成為可能。但是經螢光標記後，細胞的活性受到了一定程度的影響，這對後續研究工作產生了阻礙。磁珠分離可以克服以上缺點，它是基於抗體對細胞表面抗原的特異識別，將偶聯在抗體上的磁珠標記在細胞上，在磁場作用下達到分離細胞的目的，可以在幾分鐘內從複雜的細胞混合物中分離出高純度的靶細胞。磁珠是細胞分選的關鍵。磁珠應是超順磁性、鐵磁性或者亞鐵磁性的材料構成，具有良好的磁響應、低矯頑力和低剩磁的特點，目前最廣泛使用鐵單質、鐵氧化物等磁性材料。由於這些材料形成粒子後團聚嚴重、化學性質活潑，因此，在應用中，常常將它們進行包裹改性，形成「磁核」-「包覆物」的核殼結構的粒子，以解決這些問題。但現在用以包裹的無機物質無法在體內被降解並且對細胞還是有一定影響。因此，需要選擇一種能被降解的天然無毒物質進行包裹。
作為包覆層材料須滿足的條件有具有良好的生物相容性和抗原性，在體內可生物降解，代謝產物無毒，並在一定時間內排出體外；具有包裹一定量「磁核」的能力，有一定的機械強度。天然高分子材料因其生物學特性和成膜性(或成球性)較好，從而倍受研究人員關注。如脂質體、聚天然胺基酸類的白蛋白、明膠、絲素蛋白等；聚多糖類的澱粉、殼聚糖等。
脂質體(Liposomes)是由磷脂膽固醇等為膜材包合而成。磷脂分散在水中時能形成多層微囊，且每層均為脂質雙分子層，各層之間被水相隔開，這種微囊就是脂質體。脂質體作為藥物載體在惡性腫瘤的靶向給藥治療方面極具潛力。為克服脂質體作為載體的靶向分布不理想、穩定性較差的缺點，近年來開發了一些新型脂質體，如溫度敏感型、PL敏感型、免疫、聚合膜脂質體。
殼聚糖是一種天然多糖類纖維素，廣泛存在於昆蟲、甲殼類動物外殼及真菌細胞壁中，又稱為可溶性甲殼素，是自然界中唯一帶有陽離子的可食纖維素，殼聚糖具有無毒、生物相容性好、可降解等優點，還具有抗菌、抗腫瘤、抗血凝、抗酸、抗潰瘍等活性，可阻止或減弱藥物對胃部的刺激性，並具有在酸性環境下形成水凝膠、具有黏膜性的特性，這些生物活性決定了殼聚糖在醫藥領域有廣泛的應用，並且通過對殼聚糖進行改性，擴大了其在醫學上的應用範圍，現已成為高分子材料研究的熱點之一。
絲素蛋白來源於蠶絲，由18種胺基酸組成。它沒有免疫反應，具有良好的血液、組織相容性和抗凝血性。在負載與釋放藥物時，具有一定程度的pH值響應性和酶分解性。以上這些特點為其作為可控(或緩釋)骨架材料提供了條件。目前的研究主要集中在緩釋膜材方面，而作為微球壁材的報導很少。
磁性殼聚糖微球，是指用殼聚糖包裹「磁核」的核殼型結構顆粒，可以在微球表面通過化學反應引入多種反應性功能基(如羥基、羧基、醛基、氨基等)，也可以通過共價鍵來固定酶、細胞、抗體等生物活性物質，因此在固定化酶、細胞分離、免疫診斷及腫瘤靶向治療，蛋白質、DNA的分離和提純等方面有廣泛的應用。
免疫細胞分離是基於抗體對細胞表面抗原的特異識別，將偶聯在抗體上的磁珠標記在細胞上，在磁場作用下達到分離細胞的目的，可以在幾分鐘內從複雜的細胞混合物中分離出高純度的細胞。
免疫磁性細胞分離法(Immunomagnetic cell separation methods)在細胞生物學中越來越成為專家學者關注的焦點。免疫磁性細胞分離依靠兩種機制實現靶細胞分離。直接方法就是通過將親和配基(即抗體)連接到磁性微球上，形成表面結合單克隆抗體的免疫磁性微球(immunomagnetic microspheres，IMMS)，此微球能特異性地與靶細胞結合併使之具有磁響應性，在外磁場作用下，可以使靶細胞與其它雜質分離。間接法就是先將抗體加到細胞懸液中，孵化後沒有結合抗體的細胞被洗掉，而抗體-靶細胞複合物則通過標記有另一配基(即二抗)的免疫磁性微球富集。用無機物作為包裹層的免疫磁性微球，無法在體內降解，在細胞分選結束後須將其從被標記細胞上除去。但即使用高分子進行包裹，磁性顆粒的大小也會對細胞有很大的影響。若顆粒大小與細胞接近，則在分離之後必須將粒子除去；如果顆粒直徑在100nm以內，粒子可以被生物體直接降解，對細胞活性影響較小，分離後無需除去，得到的細胞可直接用於體內細胞移植的研究。
此外，固定化酶是指利用物理吸附或化學結合法將自由酶固定到載體上，以提高酶的操作穩定性和反覆回收利用酶的技術。常用的酶固定方法有吸附法、包埋法、共價結合法和交聯法。還沒有用磁性微球作為固定化酶的載體以使固定化酶的分離簡單易行的研究。
另外，用化學療法治療惡性腫瘤常不盡如人意，這主要是因為傳送到腫瘤部位的藥物不夠。而目前尚無通過用一種磁性引導的、對細胞無害的殼聚糖製備微球作為載體固載抗癌藥物，利用其結構中的陽離子結合負電荷的糖肫聚糖(GAG)、肝素、腦血管中的細胞，達到靶向給藥、緩釋控藥的目的，從而提高藥物利用率和對腫瘤的治療效果的報導。
發明內容
所要解決的技術問題本發明需要解決的技術問題是提供一種生物降解磁性納米顆粒及其製法和應用，以克服現有技術中磁性納米顆粒無法進行生物降解、對所接觸的細胞有不利影響的缺陷。
技術方案本發明的內容之一是提供一種生物降解磁性納米顆粒，具備內核和外殼的核殼型結構，其特徵在於內核層為磁性氧化鐵，外殼層為天然高分子材料；且粒徑為1-100nm。
上述的生物降解磁性納米顆粒的優選方案之一為，所說的天然高分子材料選自脂質體、血液白蛋白、明膠、絲素蛋白、澱粉或殼聚糖，或者其組合。優選所說的天然高分子材料為殼聚糖。
上述的生物降解磁性納米顆粒的另一優選方案為，所說的納米顆粒粒徑為25-50nm。
上述的生物降解磁性納米顆粒的又一優選方案為，所說的磁性氧化鐵成分為γ-Fe2O3。
本領域的普通技術人員無需特別的實驗即可理解，製備所說的外殼層成分可以是不同種類的可生物降解的天然高分子材料，比如脂質體、血液白蛋白、明膠、澱粉或者殼聚糖；也可以是這些成分的組合，比如組成明膠在外殼聚糖在內的雙層外殼、或者血液白蛋白在內澱粉在外的雙層外殼；還可以是澱粉和脂質體的均勻混合外殼、或者殼聚糖和明膠的均勻混合外殼。較佳地，其外殼成分採用明膠、血液白蛋白、殼聚糖或者其組合；最佳地，所述的外殼成分是殼聚糖。之所以說這些外殼成分都可採用，是由於其在生物降解性能上均比較好，且與細胞的相容性良好，沒有細胞毒性。在原料提供和製備上也比較簡單，只需在本發明的殼聚糖磁性納米顆粒製備方法的基礎上稍加改動，即可獲得脂質體磁性納米顆粒、血液白蛋白磁性納米顆粒、明膠磁性納米顆粒、或者澱粉磁性納米顆粒。
本發明的內容之二是提供一種製備所說的生物降解磁性納米顆粒的方法，其步驟依次如下(1)將殼聚糖加入到酸性溶液中溶解，加入γ-Fe2O3粒子，分散均勻，作為水相；(2)取石蠟與表面活性劑、助表面活性劑混合，得均勻體系，作為油相；(3)將水相加入到油相中，攪拌均勻，得到油包水型反相微乳液；(4)向體系中加入交聯劑，25～40℃下攪拌；(5)洗滌粒子，除去粒子表面活性劑和有機物，真空乾燥。
上述的生物降解磁性納米顆粒的製備方法的優選方案之一為，所說的殼聚糖的脫乙醯度為80～95％。
上述的生物降解磁性納米顆粒的製備方法的優選方案之二為，所說的交聯劑為戊二醛。
上述的生物降解磁性納米顆粒的製備方法的優選方案之三為，表面活性劑為司班，所說的助表面活性劑為吐溫。
本領域的普通技術人員無需特別的實驗即可理解，對於選定的外殼成分，如脂質體、血液白蛋白、明膠、澱粉或者殼聚糖等等，一般技術人員可根據現有技術選用合適的外殼——內核交聯劑。例如以可溶性澱粉為原料，環氧氯丙烷為交聯劑，Span 60為乳化劑，甲苯和蓖麻油的混合物為油相，採用逆相懸浮交聯聚合法合成澱粉微球。
本發明的內容之三是提供一種權利要求1所述的生物降解磁性納米顆粒在生物材料分離中和作為生物材料載體或藥物載體的應用。
所說應用的一種方式為，利用生物降解磁性納米顆粒與免疫抗體或者抗原一起製備免疫磁性微球，利用特異性免疫反應分離富集相應的細胞。
所說應用的另一種方式為，利用生物降解磁性納米顆粒以物理吸附或化學結合法將自由酶固定到顆粒上，製成固定化酶，利用磁性分離固定化酶，使其反覆使用。
所說應用的再一種方式為，利用生物降解磁性納米顆粒作為載體固載抗癌藥物，進行靶向給藥、緩釋控藥。
本領域的普通技術人員無需特別的實驗即可理解，由於所說的生物降解磁性納米顆粒並不限於磁性殼聚糖，還有脂質體磁性納米顆粒、血液白蛋白磁性納米顆粒、明膠磁性納米顆粒、或者澱粉磁性納米顆粒，以及幾種天然高分子組合而成的磁性納米顆粒，故利用不同外殼材料的性質不同，比如脂質體本身攜帶藥物的特性、容易進入細胞的特性，可以製成良好的抗癌藥物磁性納米載體；利用血液白蛋白與外周血的相容性和逐步代謝的特性製備肝臟疾病藥物，以維持肝臟的營養代償和緩慢持續作用於疾病組織，形成藥物和營養的雙重支持等等。
有益效果1.本發明的生物降解磁性納米顆粒其外殼層採用脂質體、血液白蛋白、明膠、澱粉或者殼聚糖等無毒、具有生物相容性的材料，使其應用於生物化學領域成為可能。
2.由於其生物降解特性，本發明的生物降解磁性納米顆粒與現有技術中生物惰性的磁性納米粒子相比，可以使納米顆粒不但具備一般磁性納米粒子在體外對核酸、蛋白質、動植物細胞的分離能力，還具有體內應用的生物功能。
3.本發明製備生物降解磁性納米顆粒如磁性殼聚糖納米複合材料的方法，所得的粒子直徑為1-100nm可控，比如優選的目標粒徑為40nm左右，即可通過調節反應條件，獲得大小均勻，分散性良好，磁響應優良，且粒徑分布窄的納米顆粒，工藝簡單，重現性好。
4.本發明的實驗表明，將生物降解磁性納米顆粒用於富集的CD34+細胞，純度達80％左右，是一種良好的檢測用納米材料。
5.採用納米顆粒聯結生物相容材料，可以有效的發揮納米材料的表面積優勢，提高生物反應的效率、加快反應時間，同時減小反應體系的總量，使得進行微量檢測和微量反應簡便易行。
6.本發明提供的生物降解磁性納米顆粒特別是磁性殼聚糖是蛋白質的良好生物吸附劑。通過磁性殼聚糖微球對蛋白質的分離和提純，可達到對資源回收利用的目的，並且經過吸附的蛋白質很容易被洗脫分離，蛋白質的活性也能大大提高。
7.本發明的磁性殼聚糖微球作為固定化酶的載體可以使固定化酶的分離簡單易行。
8.利用本發明磁性殼聚糖微球作為載體固載抗癌藥物，利用其結構中的陽離子結合負電荷的糖肫聚糖(GAG)、肝素、腦血管中的細胞，可以達到靶向給藥、緩釋控藥的目的，提高藥物利用率和對腫瘤的治療效果。
9.本發明的製備方法採用成本低廉的天然有機高分子、外殼交聯劑等，使得實際大規模生產具有可行性。
10.生物降解的磁性納米顆粒對於納米水平上的生物材料的理化性質的研究提供了基礎，同時進一步提供了擴大應用的可能性。
11.在本發明的納米粒子上連接核酸、蛋白質、核苷酸、胺基酸、抗體、多肽、動植物細胞、亞細胞結構、病毒、細菌等等，可以廣泛應用於各類分子的體外檢測和疾病的體內示蹤治療。
圖1是殼聚糖(a)、磁性殼聚糖材料(b)、Fe2O3(c)的紅外譜圖。在圖中a的2882cm-1的吸收峰是殼聚糖殘糖基上的甲基或次甲基的C-H的伸縮振動峰，圖中b在2920cm-1和2845cm-1處吸收峰，這是戊二醛中的-CH2伸縮振動峰；在1729cm-1處出現新的吸收峰，這是製備納米粒子時生成的懸掛醛基的吸收峰；在1665cm-1處出現了席夫鹼反應產物C＝N的伸縮振動吸收峰；在圖中c同時還出現了572cm-1和632cm-1的吸收峰是γ-Fe2O3的兩個特徵峰。
圖2是磁性殼聚糖納米複合材料的原子力顯微鏡圖(a)以及對應的磁掃描圖(b)。從圖1中可以看到製備的磁性納米材料粒徑在40nm左右，大小均勻，有很好的分散性，並且粒子的磁響應性能非常好。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如化工產品手冊，或按照製造廠商所建議的條件。所有無機化學試劑和有機溶劑購自上海化學試劑廠，γ-Fe2O3購自Sigma公司。
實施例1本發明採取反相微乳液的方法，製備磁性殼聚糖納米複合材料，得到粒徑大小為40nm左右的球形納米粒子，具體實施方法如下1.稱取1～100mg脫乙醯度分別為80~95％的殼聚糖粉末加入到1～10mL 1％醋酸溶液中，超聲溶解，加入5～25mg γ-Fe2O3粒子，分散均勻，作為水相；2.取5～50g石蠟，加入5～10g司班，5～10g吐溫，攪拌，得均勻體系，作為油相；3.將水相加入到油相中，攪拌均勻，得到透明褐色油包水型(W/O型)反相微乳液；4.向體系中加入1～3mL戊二醛作為交聯劑，恆溫水浴25～40℃恆溫水浴，機械攪拌，反應後用異丙醇洗滌粒子，除去粒子表面活性劑、有機物，在60℃真空乾燥箱中烘乾；5.用紅外光譜儀、原子力顯微鏡，透射電鏡等儀器對所製備的樣品進行表徵。
圖1、2的結果表明微球為殼聚糖和γ-Fe2O3的複合材料。
實施例2採用經典的反相蒸發法製備磁性脂質體。將適量的大豆磷脂、膽固醇(摩爾比為2∶1)溶解在甲醇一氯仿(1∶1)混合溶劑中，旋轉蒸發形成均一透明脂膜，以適量乙醚溶解脂膜後，加適量γ-Fe2O3粒子懸濁液，超聲乳化後進行第二次旋轉蒸發，而後進行超聲勻化，最後將脂質體懸液擠壓通過450nm的微孔濾膜即得磁性脂質體，操作過程中通氮氣保護。
脂質體具有類細胞結構，進入體內主要被網狀內皮系統吞噬而激活機體的自身免疫功能，並改變被包封藥物的體內分布。脂質體在淋巴中穩定，靠巨噬細胞的吞噬進入淋巴結，而後被溶酶體破壞。
實施例3採取與實施例1相同的反相微乳液的方法，製備磁性血液白蛋白納米複合材料，得到粒徑大小為50nm左右的球形納米粒子。白蛋白帶負電荷時在受體介導下可被淋巴吸收，且吸收速度與所帶的負電荷相關。負電荷白蛋白可到達淋巴結的胚胎中心和卵泡周圍，不僅本身對愛滋病病毒的複製有抑制作用，而且還可作為抗愛滋病藥的載體。
實施例4採取與實施例1相同的反相微乳液的方法，製備磁性明膠納米複合材料，得到粒徑大小為100nm左右的球形納米粒子。明膠易與甲醛或戊二醛進行交聯反應，形成具有三維網絡結掏的堅膜層是其緩釋作用的基礎，控制形成網絡的稠密度、厚度及牢度。
實施例5採取與實施例1相同的反相微乳液的方法，製備磁性澱粉納米複合材料，得到粒徑大小為50～370nm的球形納米粒子。澱粉微球成本低、貯存穩定、無毒、不會引起免疫反應，其本身具有微孔結構，易吸附藥物；在生物體內具有一定的可變形性，能夠根據血管叢的微環境來改變自己的形狀；經酶降解時，微球的骨架崩解前其載藥能力可保持相當長時間，因而可有效延長所載藥物的釋放時間，提高藥物的療效。
實施例6CD34+細胞富集1.CD34免疫磁性微球的製備將製得的磁性殼聚糖顆粒分散在2mLPBS溶液中，超聲分散後，加入5mL 5％的戊二醛溶液，室溫振蕩12小時，用PBS緩衝溶液洗滌，加入人CD34單抗，抗體為標記了藻紅蛋白的抗CD34單抗。4℃反應12小時。將CD34免疫磁性微球磁性分離，4℃保存在PBS緩衝溶液中，備用。
2.CD34+細胞富集將細胞懸液經PBS緩衝溶液稀釋，淋巴細胞分離液梯度密度離心，分出單個核細胞(MNC)，洗滌備用。加入製備的CD34免疫磁性微球進行磁性分離。
3.細胞純度測定經流式細胞儀檢測，富集的CD34+細胞純度為達80％～87％，分離後臍血中得到的CD34+細胞佔臍血樣品中MNC總數的1.29％±0.31％。
實施例7纖維素酶的固定化稱取一定量磁性明膠微粒，加入適量纖維素酶，室溫振蕩8h，重蒸水充分洗滌，直至無酶蛋白洗出，即得磁性固定化纖維素酶(MIE)。採用Folin2酚法測定，以牛血清蛋白作標準。並對酶活性進行測定。纖維素酶的最大載量達138mg/g，活性回收率可達77％。
實施例8靶向抗癌藥物採用乳液-化學交聯法製備磁性-氟尿嘧啶-殼聚糖微球，磁性氟尿嘧啶殼聚糖微球具有強順磁性，粒徑分布100nm，γ-Fe2O3質量分數為4.5％~11.5％，藥物包封率為40％~85％。體外藥物釋放實驗表明，對氟尿嘧啶的緩釋作用明顯，釋放周期比較長，γ-Fe2O3粒子和含量對微球的釋藥速率影響不明顯；藥物釋放主要受擴散機制控制，藥物含量越大，藥物從微球中釋放出來的速率越快，可作為理想的磁靶向藥物控釋體系。
權利要求
1.一種生物降解磁性納米顆粒，具備內核和外殼的核殼型結構，其特徵在於內核層為磁性氧化鐵，外殼層為天然高分子材料；且粒徑為1-100nm。
2.根據權利要求1所述的生物降解磁性納米顆粒，其特徵在於，所說的天然高分子材料選自脂質體、血液白蛋白、明膠、澱粉或殼聚糖，或者其組合。
3.根據權利要求2所述的生物降解磁性納米顆粒，其特徵在於，所說的天然高分子材料為殼聚糖。
4.根據權利要求1所述的生物降解磁性納米顆粒，其特徵在於，所說的納米顆粒粒徑為25-50nm。
5.根據權利要求4所述的生物降解磁性納米顆粒，其特徵在於，所說的磁性氧化鐵成分為γ-Fe2O3。
6.一種權利要求1所述的生物降解磁性納米顆粒的製備方法，其步驟依次如下(1)將殼聚糖加入到酸性溶液中溶解，加入γ-Fe2O3粒子，分散均勻，作為水相；(2)取石蠟與表面活性劑、助表面活性劑混合，得均勻體系作為油相；(3)將水相加入到油相中，攪拌均勻，得到油包水型反相微乳液；(4)向體系中加入交聯劑，25～40℃下攪拌；(5)洗滌粒子，除去粒子表面活性劑和有機物，真空乾燥。
7.根據權利要求6所述的生物降解磁性納米顆粒的製備方法，其特徵在於，所說的殼聚糖的脫乙醯度為80~95％。
8.根據權利要求6所述的生物降解磁性納米顆粒的製備方法，其特徵在於，所說的交聯劑為戊二醛。
9.根據權利要求1所述的生物降解磁性納米顆粒的製備方法，其特徵在於，所說的表面活性劑為司班，所說的助表面活性劑為吐溫。
10.一種權利要求1所述的生物降解磁性納米顆粒在生物材料分離中和作為生物材料載體或藥物載體的應用。
全文摘要
本發明涉及一種生物降解磁性納米顆粒及其製備方法和應用。該粒子具備內核和外殼的核殼型結構，內核層為磁性氧化鐵，外殼層為天然高分子材料如脂質體、血液白蛋白、明膠、澱粉或殼聚糖；且粒徑為1－100nm。該納米顆粒通過反相微乳液法合成。在細胞生物學、超微化學、生物大分子體外分離檢測和醫學體內診斷和示蹤治療等領域具有重要應用前景。
文檔編號A61K47/02GK1994469SQ20061003107
公開日2007年7月11日 申請日期2006年9月13日 優先權日2006年9月13日
發明者沈鶴柏, 朱晨華 申請人:上海師範大學