溶葡萄球菌酶在製備治療骨髓炎的藥物中的應用的製作方法

2023-06-19 04:30:56 1

專利名稱：：溶葡萄球菌酶在製備治療骨髓炎的藥物中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及溶葡萄球菌酶的一種新用途，尤其涉及在製備治療骨髓炎的藥物中的應用。
背景技術：
：骨髓炎是骨組織(包括骨髓、骨質、骨膜)的化膿性感染，屬骨科常見病，其發病急劇，病情綿延，治療棘手，往往因合併症而致終身殘疾，嚴重影響人體健康和生活，是醫學界公認的僅次於骨癌的頑症，按病情可分為急性和慢性兩類。1.急性血源性骨髓炎急性血源性骨髓炎是由於病人自身免疫功能低下，導致化膿菌由某一部位的病灶經血流進入骨內而引起，常見的病灶多位於體表，如癤、癰、毛囊炎、中耳炎以及上呼吸道感染等。最常見於小兒，2-12歲的小兒約佔80%，病兒多為男孩，約為女孩的4倍。急性血源性骨髓炎大多發生在長管狀骨的幹骺端，因是終末動脈，血流較慢，細菌栓子容易停留。細菌的繁殖和局部骨組織的變態反應引起一系列炎性病變，結果使骨組織壞死，形成一個小的骨膿腫，隨後病灶持續擴大，侵入更多的骨組織，甚至波及整個骨幹。急性血源性骨髓炎發病突然，因感染程度不同而有不同的表現。一般有中毒症狀如發冷、寒戰、體溫急劇上升，高達3940。c，脈搏加速，全身虛弱，白細胞計數增高，可高達30,000以上，血沉率快，血細菌培養常為陽性。患肢劇痛，腫脹，不敢活動。嚴重者可發生中毒性休克，甚至死亡。2.慢性化膿性骨髓炎急性骨髓炎治療不及時或不徹底即轉變為慢性化膿性骨髓炎，常有一個或多個竇道，時愈時發，經久不愈，反覆排出膿液或死骨，如果膿液引流不暢，局部腫脹疼痛加劇，出現發熱和全身不適等症狀，經休息或治療，上述症狀消退，但多仍遺留竇道，如此反覆發作。慢性骨髓炎長期不愈可導致如下併發症①畸形由於骨骺受炎症的刺激，使患肢過度生長而變長，或因骨骺板破壞，影響發育，結果肢體短縮，骨骺板一側受破壞，發育不對稱，使關節呈內翻或外翻畸形；由於軟組織疤痕攣縮，也可引起屈曲畸形。②關節強直由於感染擴散到關節內，關節軟骨面破壞，使關節呈纖維性或骨性強直。⑧癌變竇道口皮膚由於不斷受刺激，可合併癌變，常見為鱗狀上皮瘍。更為嚴重的是部分患者由於無法治療而必需截肢，甚至死亡。目前臨床上主要採用大劑量的抗生素進行治療，但是先期採用的抗生素全身性給藥治療，如果抗生素選用不當，藥品對致病菌不敏感或藥量不夠大、用藥時間不夠長，往往使得病症無法治癒，遲早(長達數年)病變仍會復發。這些病變周而復始地發展下去形成長期不癒合的竇道，造成嚴重病殘。而且由於大劑量地使用抗生素，藥物在體內的蓄積也會對病人的肝、腎、耳等器官造成不可逆的損害。近二十年來，隨著一系列有機高分子材料的發展，局部藥物釋放系統的新型給藥方式得到了廣泛的研究和應用。其在治療骨髓炎上有著較為有利的藥動學特點，不但可在感染局部產生較高的藥物濃度，且不會產生全身毒副作用，因此抗生素的局部藥物釋放系統逐漸得到了廣泛的應用。然而研究表明，目前臨床上治療骨髓炎常用的慶大黴素、替硝唑等在較高濃度的情況下，對於骨髓炎病人的骨再生及癒合過程中起關鍵作用的成骨細胞具有明顯的抑制作用[盧丙侖，馮志華等.體外評價抗生素對人重組骨形成蛋白一2誘骨活性的影響.中國臨床康復.2002，6(22):3344-3345]，使得成骨細胞無法增殖、修復骨缺損，病人的病灶部位癒合緩慢，病程延長，大大增加了病人的痛苦。因此，尋找一種能有效治療骨髓炎、並且對成骨細胞無明顯影響的藥物是本發明需要解決的主要內容。
發明內容本發明需要解決的技術問題是公開溶葡萄球菌酶在製備治療骨髓炎的藥物中的應用。本發明的發明構思是這樣的骨髓炎是病菌從局部感染的病灶(如上呼吸道感染、毛囊炎等)進入血液，停滯在骨的幹骺端，導致局部骨組織的變態反應從而引起一系列炎性病變，結果使骨組織壞死，形成一個小的骨膿腫，隨後病灶持續擴大，侵入更多的骨組織而形成。溶葡萄球菌酶(lysostaphin)是一種含鋅的金屬蛋白酶，它能專一降解革蘭氏陽性菌(如金黃色葡萄球菌)細胞壁肽聚糖層的甘氨酸肽鍵，從而裂解金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌的細胞壁，起到徹底殺死細菌的目的，尤其對耐藥性金黃色葡萄球菌等難以根除的致病菌的效果非常好。而且，溶葡萄球菌酶本身是一種蛋白質，其在體內最終被降解成胺基酸為人體所吸收，因此既不會如抗生素類藥物一樣在體內蓄積而產生毒副作用，也不會對成骨細胞產生抑制作用。將溶葡萄球菌酶與一些骨替代材料相配伍製成的藥物製劑，在有效治療骨髓炎的同時，溶葡萄球菌酶也不會對成骨細胞產生影響，使其充分發揮骨修復的作用，同時骨替代材料還能明顯加快骨缺損的修復進程，縮短病人的預後時間，大大減輕病人的痛苦。試驗證明，溶葡萄球菌酶對於骨髓炎具有十分顯著的療效，可以以組合物的形式施加於需要治療的患者，所說的組合物，至少包括溶葡萄球菌酶0.0001-10wt。/。和醫藥學上人體可接受的藥物載體材料，劑量為70-99wt所說的溶葡萄球菌酶可採用採用上海高科聯合生物技術員研發有限公司市售的產品；所述及的組合物還可包括溶菌酶0.1-10wt^。所說的溶菌酶可採用大連綠雪蛋品發展有限公司市售的產品；所述及的藥物載體材料包括聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、膠原、纖維蛋白原、聚乳酸/聚羥基乙酸、幾丁糖、磷灰石矽灰石多孔剝離陶瓷(PGC)、丙烯酸樹脂、纖維素、骨水泥、磷酸鈣、硫酸鈣、明膠、聚酸酐、多孔玻璃陶瓷、纖維蛋白凝膠的一種或一種以上。其主要作用是作為藥物組分的載體，使藥物緩慢釋放，並作為病變部位的填充物。所述及的藥物製劑的製備方法包括如下步驟根據溶葡萄球菌酶和溶菌酶使用方式的不同可分為以下兩種製備方法1.以酶溶液進行製備的藥物製劑。(1)按上述比例稱取溶葡萄球菌酶及溶菌酶與水混和製成酶溶液。(2)將製得的具有一定形狀的藥物載體置於酶溶液中，經真空吸附、凍幹處理製得所需的載藥模塊。2.以酶凍乾粉末進行製備的藥物製劑。將上述比例的酶凍乾粉末、藥物載體粉末按等量遞加法混勻，加入溶劑(水或磷酸鈉緩衝液或有機溶劑)混勻，採用適當方法(冷凍乾燥或減壓蒸餾或自固化)處理，製得具有一定形狀的載藥模塊。混勻用溶劑選自水、磷酸鈉緩衝液、丙酮、乙醚、二氯甲垸中的一種；乾燥固化成型處理方式選自冷凍乾燥、減壓蒸餾、自固化中的一種。本發明製得的藥物製劑，以溶葡萄球菌酶為主要治療組分與骨替代材料(載體材料)混合製成局部抗菌藥物緩釋系統植入骨髓炎的病變部位，能有效治療細菌感染引發的骨髓炎，同時不會對成骨細胞造成抑制，還能明顯加快骨缺損的修復，縮短病程，是一種高效、安全的骨髓炎新型治療藥物。具體實施例方式實施例中的溶葡萄球菌酶凍乾粉末，採用上海高科聯合生物技術研發有限公司的產品，溶菌酶凍乾粉末採用大連綠雪蛋品發展有限公司的產品。實施例1稱取溶葡萄球菌酶凍乾粉末3mg，以滅菌注射用水6ml溶解，配製成濃度為0.5mg/ml的儲備液，備用；稱取170mg聚乳酸，在無菌層流操作臺上加入丙酮3.6ml，攪拌溶解後加入儲備液0.4ml，混勻，繼續攪拌揮去丙酮，待聚乳酸析出並粘結成塊時取出，再用模具塑形，待殘留溶劑揮千後放入乾燥器中，8h後取出，採用環氧乙垸或7射線照射滅菌，備用。實施例2取明膠10g加蒸餾水75ml浸泡，待膨脹軟化後，在水浴上加熱使之完全溶解，加入已稀釋的4%的甲醛溶液10ml，保持水浴溫度35°C，攪拌(900轉/分)，使之產生豐富細膩的泡沫，分裝於麻布盒中，放入-15"C冰箱中冷凍，取出置於室溫鼓風乾燥後，加工成具有一定形狀的小塊，12(TC乾熱滅菌lh。將製得的明膠海綿小塊置lmg/ml溶葡萄球菌酶水溶液中，經真空吸附、冷凍乾燥值得載有溶葡萄球菌酶的明膠海綿小塊。實施例3取溶葡萄球菌酶凍乾粉末7mg，溶菌酶凍乾粉末2mg，硫酸鈣(a—半水石膏)140mg，按等量遞加法混合均勻，加磷酸鈉緩衝液(0.25M/0.25M磷酸氫二鈉/磷酸二氫鈉)56pL調勻成糊狀，置模具中塑形，室溫固化24小時製得載有抗菌肽的硫酸鈣骨水泥，採用環氧乙烷或7射線照射滅菌，備用。實施例4將溶葡萄球菌酶溶於水中配製成15^g/ml水溶液備用；將磷酸鈣粉末140mg(a—磷酸三鈣80mg，磷酸氫轉60mg)按等量遞加法混勻，加15/xg/ml溶葡萄球菌酶溶液56pL調勻成糊狀，置模具中塑形，在37i:、相對溼度1000%環境中固化4小時製得載有溶葡萄球菌酶(0.001%)的磷酸鈣骨水泥，採用環氧乙烷或7射線照射滅菌，備用。實施例5取聚甲基丙烯酸甲酯140mg，加入溶葡萄球菌酶凍乾粉末14mg，混勻，再以液體甲基丙烯酸甲酯調配成粘稠狀料漿，將粘稠料漿模鑄或搓成3lOmm小珠，並以手術縫線串成珠鏈，採用環氧乙烷或7射線照射滅菌，備用。實施例6抑菌試驗葡萄球菌的接種用無菌棉拭子蘸取濃度為5*105cfU/mL溶葡萄球菌(ATCC6538)懸液，在營養瓊脂培養基平板表面均勻塗抹3次。每塗抹1次，平板應轉動60度，最後將棉拭子繞平板邊緣塗抹一周。蓋好平皿，置室溫乾燥5分鐘。載藥模塊貼放按實施例1實施例5分別製備載藥模塊(5mn^4mm)，用無菌鑷子取模塊貼放於平板表面，貼放好後，用無菌鑷子輕壓模塊，使其緊貼於平板表面。蓋好平皿，置37'C溫箱，培養17小時觀察結果，用遊標卡尺測量抑菌環的直徑並記錄。用鑷子將載藥模塊取出，貼放於另一塊平板表面，繼續重複上述實驗，觀察結果並記錄。x抑菌試驗結果complextableseeoriginaldocumentpage9實施例7溶葡萄球菌酶對成骨細胞活性影響的體外實驗成骨細胞的培養取健康成年志願者骨髓5ml，採用全骨髓法置於含100g/L胎牛血清的DMEM完全培養基中於37°C、含5g/L(302溼化空氣中進行原代培養。傳代後改用含100g/L胎牛血清的條件培養基(DMEM完全培養基中加入地塞米松l(T8mol/L、/3—甘油磷酸鈉10mmol/L、維生素C50mg/mL)繼續培養約2周，使骨髓基質幹細胞定向誘導分化為成骨細胞。溶葡萄球菌酶對成骨細胞活性的影響將第3代成骨細胞用2.5g/L胰酶消化後，製成濃度為5*104/mL單細胞懸液，將細胞分2組接種於96孔培養板中，每組20孔，毎孔25mL，每組再分別加入含有1%溶葡萄球菌酶DMEM條件培養基275jliL(實驗組)、DMEM條件培養基(對照組)，另設一組每孔僅加入DMEM條件培養基300/aL作為空白對照組，繼續培養。分別在加樣後第2，4，8，14d各取5孑L，去上清，採用MTT法(四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法)測定每孔的光密度值A570。結果見下表。各組細胞增值測定結果(A570,i±s)組別培養時間complextableseeoriginaldocumentpage10實施例8動物病理試驗(1)動物模型的建立紐西蘭兔用氯胺酮麻醉，右後肢膝關節外側剪毛，用6號針頭經膝關節穿刺進入兔脛骨近端骨髓腔1/3處，分別注入5。^魚肝油酸鈉O.lml及6*109cfii/ml金黃色葡萄球菌懸液O.lml，取出針頭，放入籠中正常飼養。4周後，X線攝片可見骨膜增生，皮質骨增厚，密度增加成為包殼，其內有死骨及死腔，作為實驗造模成功。(2)給藥治療將造模成功的36隻紐西蘭兔(雌雄各半，體重1.92.6kg)麻醉，8%的硫化鈉脫毛，新潔爾滅酊液常規消毒，在患骨處縱行切開皮膚，長約10mm，分離，用3.5mm鑽頭由股骨外側向內側橫向鑽孔，鑽透兩側皮質骨，衝盡骨碎屑，分3組分別植入空白磷酸鈣骨水泥、載有4%慶大黴素的骨水泥和載有溶葡萄球菌酶的骨水泥模塊(按實施例4製備)，縫合傷口，術後正常分籠飼養和飲食，不口服或靜脈應用抗菌化療藥物。4周後觀察治療效果。(3)治療後骨X光片對比治療後取患骨拍X光片，將紐西蘭兔患骨X線表現分為輕度、中度、重度三級，輕度為治癒恢復型，中度為增殖型和X線穩定型，重度為破壞進展型和死骨形成型，由三位放射科醫師盲法對比評定X光片表現。結果見表l。表lX光片對比結果complextableseeoriginaldocumentpage11(4)患骨組織病理改變比較由三位病理科醫師盲法評價患骨組織病理切片光鏡下所見，結果見表2。結果表明載酶骨水泥組與載慶大黴素骨水泥組均優於空白骨水泥組。表2骨組織病理學對比結果complextableseeoriginaldocumentpage11權利要求1.溶葡萄球菌酶在製備治療骨髓炎的藥物中的應用。2.如權利要求1所述的溶葡萄球菌酶在製備治療骨髓炎的藥物中的應用，其特徵在於，以所說的藥物的總重量計，組分中至少包括溶葡萄球菌酶0.0001-10%和醫藥學上人體可接受的藥物載體材料。3.如權利要求2所述的溶葡萄球菌酶在製備治療骨髓炎的藥物中的應用，其特徵在於，所述及的藥物中還包括溶菌酶0.1-10%重量比。4.根據權利要求2或3所述的溶葡萄球菌酶在製備治療骨髓炎的藥物中的應用，其特徵在於，所述及的藥物載體材料選自聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、膠原、纖維蛋白原、聚乳酸/聚羥基乙酸、幾丁糖、磷灰石矽灰石多孔剝離陶瓷(PGC)、丙烯酸樹脂、纖維素、骨水泥、磷酸鈣、硫酸鈣、明膠、聚酸酐、多孔玻璃陶瓷、纖維蛋白凝膠中的一種或一種以上。5.根據權利要求4所述的溶葡萄球菌酶在製備治療骨髓炎的藥物中的應用，其特徵在於，所述的藥物的製備方法包括如下步驟(1)以酶溶液進行製備的藥物製劑；按上述比例稱取溶葡萄球菌酶及溶菌酶與水混和製成酶溶液，將製得的具有一定形狀的藥物載體置於酶溶液中，經真空吸附、凍幹處理製得所需的載藥模塊；(2)以酶凍乾粉末進行製備的藥物製劑；將上述比例的酶凍乾粉末、藥物載體粉末按等量遞加法混勻，加入溶劑混勻，乾燥固化成型處理，製得具有一定形狀的載藥模塊。6.根據權利要求5所述的溶葡萄球菌酶在製備治療骨髓炎的藥物中的應用，其特徵在於，所述及製備方法中，混勻用溶劑選自水、磷酸鈉緩衝液、丙酮、乙醚、二氯甲垸中的一種；乾燥固化成型處理方式選自冷凍乾燥、減壓蒸餾、自固化中的一種。全文摘要本發明公開了溶葡萄球菌酶在製備治療骨髓炎的藥物中的應用，試驗證明，溶葡萄球菌酶對於骨髓炎具有十分顯著的療效，本發明以溶葡萄球菌酶為主要治療組分與骨替代材料(載體材料)混合製成局部抗菌藥物緩釋系統植入骨髓炎的病變部位，能有效治療細菌感染引發的骨髓炎，同時不會對成骨細胞造成抑制，還能明顯加快骨缺損的修復，縮短病程，是一種高效、安全的骨髓炎新型治療藥物。文檔編號A61K38/48GK101195027SQ200610119208公開日2008年6月11日申請日期2006年12月6日優先權日2006年12月6日發明者磊宋,李國棟,黃青山申請人:上海高科聯合生物技術研發有限公司