表面功能化的共振發光微球、含共振發光微球的試劑盒及應用的製作方法

2023-06-18 20:12:16 2

專利名稱：表面功能化的共振發光微球、含共振發光微球的試劑盒及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於檢測技術領域，具體涉及一種利用螢光或磷光的特性進行定性和定量 檢測的技術，更具體的涉及一種表面功能化的共振發光微球、含共振發光微球的試劑盒和 檢測裝置及應用。
背景技術：
由於螢光光譜具有高探測靈敏度，目前螢光光譜技術已廣泛應用於化學、生物檢測和成像等行業。螢光聚合物微球還可以放大信號，使檢測靈敏度進一步提高，從而在商 業上有非常廣泛的應用。然而，傳統的螢光檢測技術中所用的作為探針的螢光分子和微球 具有很多局限性。比如，許多螢光探針和發射器承受著嚴重的光褪色。大多數的有機熒 光探針具有較窄的斯託克頻移(Stoke shifts)，從而很難從背景中區分出螢光信號。熒 光檢測試驗往往需要昂貴的光學元件如帶通濾波器。這些限制使得傳統的螢光檢測技術 在一些需要非常高探測靈敏度的應用中不盡人意。近10年來，時間分辨的螢光檢測技術 得到了很多的關注，並已被證明在化學檢測和生物樣品檢測領域能提供高靈敏度探測， 這是因為與傳統的螢光檢測技術相比，時間分辨的螢光檢測技術具有更低的背景要求和 更高的信噪比(Merio, L. ；Pattersson, K. ；Lovgren, T. Clin. Chem. 1996，42，1513-1517. Harma, H. ；Soukka T. ；Lovgren, Τ. Clin. Chem. 2001,47,561-568). (Qin, Q. ；Peltola, 0. ；Pettersson, K. Clin. Chem. 2003,49,1105-1113. Wang, G, ；Yuan, J. ；Matsumoto, K.； Hu, Ζ. Anal. Biochem. 2001,299,169-172. Hai, X. ；Tan, Μ. ；Wang, G. ；Ye, Ζ. ；Yuan, J.； Matsumoto, K.Anal.Sciences,2004,2,245)。目前只發現了有限種的螢光探針具有足夠長的螢光壽命足以明顯區分典型背景 螢光和散射光。對於構造簡單、低成本的時間分辨的螢光檢測儀器來說，長螢光壽命也是 一個決定性的條件。最為人熟知的適合時間分辨螢光檢測技術的螢光探針是銪(Eu)螯 合探頭。銪螯合物和封裝有螯合物的納米微球具有高螢光輸出，大斯託克頻移(Stoke shifts)以及較長的使用壽命，已成功地用於生物化驗和醫療診斷中。(Qin，Q. ；Peltola, 0. ；Pettersson, K. Clin. Chem. 2003,49,1105-1113. Wang, G, ；Yuan, J. ；Matsumoto, K.； Hu, Ζ. Anal. Biochem. 2001,299,169-172. Hai, X. ；Tan, Μ. ；Wang, G. ；Ye, Ζ. ；Yuan, J.； Matsumoto, K. Anal. Sciences, 2004, 2, 245)。但是，現有的銪螯合物只能在270 370nm被激發。在這個波長範圍的強紫外光 源並不便宜，而且銪螯合物存在著嚴重的光褪色現象。此外，大部分的生物樣本、食物樣本 及環境樣品對這個波長範圍具有很強的吸收，會大大幹擾測量。另外，大多數的生物樣品能 被該範圍內紫外線破壞。最近，一些新類型的採用束縛的配體的銪螯合物被合成出來，以增 加它們的結合常數和提高螢光的輸出。儘管如此，他們仍然有光褪色問題，仍然需要昂貴的 紫外線激發光源。銪螯合物也被封裝在聚合物微球中來增強化學穩定性和進行信號放大。 銪螯合物的聚苯乙烯微球已被商業應用。然而，他們仍然有嚴重的光褪色問題，以及需要昂貴的紫外激發光源。相對於普遍應用在分析化學、生物檢測、生物成像、醫學診斷、食品監測和環境監測領域的螢光檢測技術，雖然磷光檢測技術也具有很多優點，但磷光光譜還沒有應用在這 些領域。例如，磷光一般有很長的螢光壽命，對理想的時間分辨發光檢測來說消除背景噪聲 和提高信噪比方面非常理想，可大幅度提高檢測靈敏度。有以下兩個主要原因導致磷光光 譜的應用不足。首先，只發現了有限數量的強磷光發射器；第二，磷光很容易被氧猝滅。氧 猝滅磷光對螢光檢測技術的實際應用來說是非常不利的，特別是定量分析來說。然而，磷光 已被廣泛研究其在化學和生物檢測和分析上的潛在應用。(Papkovsky，D. B. ；0』 Riordan, T. ；Soini, A.Biochem.Soc.Transactions,2000,28,74-77. Hendrix, J.L.U.S.Patent 5，464，741 (1995) · Sagner, G. ；De Hass, R. ；Gi jlswi jk. R. ；Tanke, H. U. S. Patent 6, 004, 530(1999). Sun, B. ；Yi, G. ；Zhao, S. ；Chen, D. ；Zhou. , Y. ；Cheng, J. Anal. Lett. ,2001,34,1627-1637. Scholl, P. F. ；Bargeron, C. B. ；Phillips, Τ. Ε. ；Wong, Τ.； Abubaker, S. ；Groopman, J. D. ；Strickland, P. Τ. ；Benson, R. C. in in-VitroDiagnostic Instrumentation of Proceedings of SPIE,2000,3913,204-213.Christopoulos, T. K. ；Diamandis, Ε.P.Anal.Chem. 1992,64,342-346. Phimphivong, S. ；Saavedra, S.S.Bioconjugate Chem. 1998,9,350-357. Matveeva, E. G. ；Gribkova, Ε. V. ；Sanborn, J. R. ；Gee, S. J. ；Hammock, B. D. ；Savitsky，A. P. Anal. Lett. 2001，34，2311-2320)。令人遺 憾的是產生強磷光無一例外都需要無氧的環境。把磷光分子封裝在低氧或無氧的基體內也許可以解決氧猝滅的問題。已經發現 含滷聚合物可以作為非常好的一個封裝磷光分子的基體，以防止明顯的磷光猝滅。但是， 還沒有可以簡單地製造單分散的磷光微球的可靠、穩定的方法。聚丙烯腈也被報導是一 個封裝磷光分子的很好的選擇，可以在室溫條件下得到強磷光性，這是由於它的低氧滲透 性.報導中它們的磷光強度和壽命和相應的無氧環境的磷光分子很相似。0』 Riordan, T. C. ；Soini, Α. E. ；Papkovsky, D.B.Anal.Biochem.2001,290,366-375. 0』 Riordan, Τ. C. ；Soini, Α. Ε. ；Soini, J. Τ. ；Papkovsky, D. B. Anal. Chem. 2002, 74, 5845. Ponomarev, G. V. ；Vladimirovich, D. ；Meltola, J. J. ；Soini, A. E. U. S. Patent6, 582, 930 Bl (2003). Kuerner, J. M. ；Klimant, I. ；Krause, C. ；Preu, H. ；Kunz, W. ；ffolfbeis, 0. S. Bioconjugate Chemistry, 2001,12,883-889.然而，報導中聚丙烯腈磷光微球非常小，非常容易聚集而難 以製造。這些聚丙烯腈磷光微球不交聯，並經常有穩定性問題。聚苯乙烯的磷光微球已經 商用。然而，聚苯乙烯的磷光微球的磷光性很弱，壽命也較短，這是因為它相對較高的氧滲 透性和溶解性。聚苯乙烯的磷光微球不適合用於高靈敏度檢測。對時間分辨發光探測技術來說，一種在室溫條件下具有長壽命強磷光性，能製造 成形狀和大小都單分散的，可以具有使生物和化學分子共價標記的表面官能團，並能在紫 外線以外的區域被有效激發，以及具有化學和光化學穩定性的磷光分子需求十分迫切。本 發明因此而來。

發明內容
本發明目的在於提供一種表面功能化的共振發光微球，解決了現有技術中螢光分 子發光壽命時間短以及磷光分子易被氧猝滅導致在通常環境下較短壽命的強磷光性以及螢光分子化學穩定性差等問題。為了解決現有技術中的這些問題，本發明提供的技術方案是一種表面功能化的具有較長使用壽命的共振發光微球，其特徵在於所述微球包括 以下組成聚甲基丙烯酸甲酯的聚合物或共聚體，所述聚合物或共聚體形成封裝基體，且甲 基丙烯酸甲酯單體至少佔所述共振發光微球的總重量的50% ；至少兩種光致發光分子的混合物；所述光致發光分子選自磷光分子和螢光分子， 所述磷光分子在無氧或低氧環境下產生磷光，所述螢光分子在適當的波長激發下可發射熒 光，所述混合物中光致發光分子的光譜共振實現能量轉移，且光致發光分子均勻分布在所 述的聚甲基丙烯酸甲酯的聚合物或共聚體形成的封裝基體中；所述微球表面具有一種或一種以上的官能團，所述官能團直接與配體或生物學大 分子反應形成微球表面的共價鍵連接，所述表面官能團也可以激活後與配體或生物學大分 子進行共價標記。本發明也涉及一種共振發光微球，包含作為封裝基體的PMMA(聚甲基丙烯酸甲 酯)聚合物和共聚物、至少一個磷光分子和至少一個螢光分子。磷光分子可以在缺氧環境 下發射出長壽命的強磷光；螢光分子在適當的波長激發下可發射強螢光。該磷光分子的磷 光光譜和螢光分子的吸收光譜有顯著的重疊，從而可以允許有效的磷光共振能量轉移。磷 光分子和螢光分子非常均勻地分布在PMMA聚合物基體內。該微球可以至少包含一種能夠在低氧氣濃度的條件下產生長壽命強磷光的磷光 分子。在某些情況下，兩種或多種類型的磷光分子被封裝入一個微球基體中。磷光分子在 整個包含PMMA (聚甲基丙烯酸甲酯)的基體微球中非常均勻地分布，通常，微球包含佔總重 量的0. 05% 10%的磷光分子。優選的，磷光分子佔總微球的重量的0. 2 0Z0 5%。優選的，所述共振發光微球的粒徑在40納米到10微米之間。優選的，所述共振發光微球為球形微球。優選的，所述聚甲基丙烯酸甲酯的聚合物具有式(1)的結構通式
Λ
L 知(1)；其中，η >50。優選的，所述聚甲基丙烯酸甲酯的聚合物具有式(1)的結構通式
I
0 丫0 、^Λ
L Jn Cl)；
其中，η>100。優選的，所述聚甲基丙烯酸甲酯的共聚物具有式(2)的結構通式AnBm(2)；其中n，m大於50，Α為甲基丙烯酸甲酯單體，B選自與甲基丙烯酸甲酯單體連接且 不包括甲基丙烯酸甲酯單體本身的任何單體。優選的，所述共振發光微球為核_殼結構的微球。優選的，所述共振發光微球的核心包括封裝有磷光分子的聚甲基丙烯酸甲酯聚合 物。優選的，所述共振發光微球的外殼包括封裝有螢光分子的聚苯乙烯聚合物。優選的，所述的磷光分子包括有機磷光分子和有機/無機混合材料、磷光金屬螯 合物。優選的，所述的磷光分子選自與配體螯合的鉬，鈀，釕，鋨，銥，銦，鉬，鎝，銅，鐵， 鉻，鎢，鋅，錸螯合物；所述配體選自卟啉及其衍生物，嚇吩及其衍生物，多吡啶及其衍生物， 吡啶，吡嗪，異煙醯胺，咪唑，雙聯吡啶，三聯吡啶，鄰菲羅啉和雙吡啶吩嗪；所述配體可為以 下有機基團任選取代烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、取代芳烷基、羧基、甲醛基、 羧胺基、氰基、氨基、羥基、亞氨基、醇羰基、氨羰基、脒、胍、醯脲、含官能團的硫基、含官能團 磷基和N-羥基琥珀醯亞胺羧酸酯基。優選的，所述的磷光分子選自雙[(4，4'-甲氧基)_2，2'聯吡啶]2-[3_(4_甲 基_2，2'-聯吡啶_4基)丙烷基]-1，3-二氧戊環釕(II)、雙(2，2'聯吡啶)[4_( 丁 醛)-4'-甲基_2，2'-雙吡啶]釕(II)、雙(2，2'聯吡啶)[4-(4'-甲基_2，2'-聯 吡啶4'-基)丁酸]釕(II)、三(2，2'聯吡啶)釕(11)、(2，2'聯吡啶)[雙二(1，2_ 二 苯基膦基)乙烯]2-[3-(4_甲基_2，2'-聯吡啶4'-基)丙基]-1，3-二氧戊環鋨(II)、 雙(2，2'聯吡啶)[4-(4'-甲基_2，2'-吡啶)丁基]釕(II)、雙(2，2'-聯吡啶) [1-溴-4(4'-甲基-2，2'-聯吡啶-4-基)丁烷]釕(II)、雙(2，2'-雙吡啶)馬來 醯亞胺基己酸，4-甲基_2，2'-聯吡啶4' -丁醯胺釕(II)、鉬(二)四-氟苯基卟盼，鈀 (II)四-氟苯基卟吩。優選的，所述的磷光分子佔所述微球總重量的0. 05% 5%。優選的，所述磷光分子佔所述微球總重量的0. 2% 5%。優選的，所述的螢光分子選自螢光素及其衍生物、若丹明(rhoadamine)及其衍生 物、腎上腺素染料、Alexa Fluor系列染料。優選的，所述共振發光微球包括以下組成聚甲基丙烯酸甲酯的聚合物或共聚體，所述聚合物或共聚體形成封裝基體，且甲 基丙烯酸甲酯單體至少佔所述共振發光微球的總重量的50% ；兩種磷光分子的混合物；所述磷光分子在無氧或低氧環境下產生磷光，所述混合 物均勻分布在所述的聚甲基丙烯酸甲酯的聚合物或共聚體形成的封裝基體中；所述微球表面具有一種或一種以上的官能團，所述官能團直接與配體或生物學大 分子反應形成微球表面的共價鍵連接，所述表面官能團也可以激活後與配體或生物學大分 子進行共價標記。優選的，所述兩種磷光分子的混合物中第一磷光分子與第二磷光分子的重量比在0. 1 10範圍內。優選的，所述共振發光微球包括以下組成聚甲基丙烯酸甲酯的聚合物或共聚體，所述聚合物或共聚體形成封裝基體，且甲基丙烯酸甲酯單體至少佔所述共振發光微球的總重量的50% ；一種磷光分子和一種螢光分子的混合物；所述磷光分子在無氧或低氧環境下產生磷光，所述螢光分子在適當的波長激發下可發射螢光，所述混合物均勻分布在所述的聚甲 基丙烯酸甲酯的聚合物或共聚體形成的封裝基體中；所述微球表面具有一種或一種以上的官能團，所述官能團直接與配體或生物學大 分子反應形成微球表面的共價鍵連接，所述表面官能團也可以激活後與配體或生物學大分 子進行共價標記，所述螢光分子的吸收光譜和所述的磷光分子的磷光光譜顯著的交疊。優選的，所述一種磷光分子和一種螢光分子的混合物中磷光分子與螢光分子的重 量比在0. 1 10範圍內。優選的，所述的表面官能團選自一種或一種以上的以下基團羧基，乙醇胺基，
羥基，胺基，氨基，亞胺基，環氧基，異氰酸酯基，三聚氰胺基，金屬醇鹽，水解類甲矽烷基， β-酮酸酯基和聚乙二醇基。優選的，所述的共振發光微球還包括一種或一種以上的交聯兩個或兩個以上的聚 甲基丙烯酸甲酯的聚合物或共聚體的交聯劑。優選的，所述的交聯劑選自雙功能交聯丙烯酸單體、多功能交聯丙烯酸單體和雙 反應丙烯酸單體。優選的，所述的雙功能交聯丙烯酸單體選自乙烯基乙二醇二甲基丙烯酸脂和1， 10-癸烷二甲基丙烯酸脂。優選的，所述的多功能交聯丙烯酸單體選自季戊四醇三丙烯酸酯和三甲基色氨酸 丙烷三丙烯酸酯。優選的，所述的雙反應丙烯酸單體選自2-氨乙基甲基丙烯酸鹽氫氯化物和2-氰 乙基丙烯酸鹽。優選的，所述的交聯劑佔微球總質量的0. 5% 25%。優選的，所述共振發光微球還包括一種或一種以上的通過所述官能團共價連接而 覆蓋在所述微球表面的生物活性物種。優選的，所述的生物活性物種選自抗體、抗原、半抗原、核酸、配體、受體、人工多 肽、蛋白質和多糖，所述生物活性物種能參與特異性識別和結合反應。優選的，所述的生物活性物種選自酶反應物。本發明的另一目的在於提供了一種所述表面功能化的共振發光微球在分析檢測 和成像方面的應用。本發明的又一目的在於提供了一種試劑盒，其特徵在於所述試劑盒包括權利要求 1所述的共振發光微球，作為分析檢測用的探針或標記物。本發明的又一目的在於提供了 一種試劑盒在免疫檢測技術、核酸雜交技術和酶檢 測技術方面的應用。本發明的又一目的在於提供了 一種試劑盒在溼化學領域方面的應用。本發明的又一目的在於提供了 一種試劑盒在幹化學領域方面的應用。
本發明的又一目的在於提供了 一種檢測裝置，其特徵在於所述裝置內設置共振發 光微球為探針或標記物。本發明的又一目的在於提供了一種所述的檢測裝置在免疫層析方面的應用。封裝基體的選擇本發明技術方案中所述 的封裝是指將磷光分子和/或螢光分子非常均勻地嵌入 在基體中。PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)的聚合物和共聚物可指甲基丙烯酸甲酯單體重量超 過50%的任意聚合物。由於現有技術中還沒有理想的磷光微球可以應用於時間分辨磷光檢測技術。本發 明人經長期研究開發發現了基於PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)的共振發光微球，該微球是非 常理想的檢測器，可以用於時間分辨磷光檢測技術。發明人發現，基於PMMA(聚甲基丙烯酸 甲酯)的共振發光微球除了環境條件下的長使用壽命，還可以很容易地被製造，且具有制 備穩定性和良好的單分散性。此外，基於PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)的共振發光微球可以 很容易用各種官能團和生物物種對微球的表面進行改性，使微球在時間分辨磷光檢測技術 中成為高靈敏度分析檢測和定量測試中的理想標記。本發明涉及的表面功能化共振發光微球中，多種磷光分子和/或螢光分子被封裝 入主要是PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)聚合物或PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)共聚物的聚合物 基體中。PMMA的聚合物和共聚物作為一個封裝基體。微球中的PMMA(甲基丙烯酸甲酯)單 體重量佔微球總重量的比例從50%至99%。磷光分子被充分均勻地置入微球基體的中心， 磷光分子的成分佔總體的比例為10%或更低。這裡的總體是指兩個或多個直接物理連接的 磷光微球形成的簇。所述聚甲基丙烯酸甲酯的聚合物具有式(1)的結構通式
L Jn Cl)；其中，η為大於50的自然數。更優選的，η為大於100的自然數。所述聚甲基丙烯 酸甲酯的共聚物具有式(2)的結構通式AnBm(2)；其中n，m大於50，Α為甲基丙烯酸甲酯單體，B選自與甲基丙烯酸甲酯單體連接且 不包括甲基丙烯酸甲酯單體本身的任何單體。當然，本發明人經研究發現，除了 PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)聚合物和/或 PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)共聚物，微球可能還包含50%或更少的其他類的基體成分。一 些基體成分也可以採用丙烯酸和甲基丙烯酸的聚合物和共聚物；而另一些基體成分可以採 用包括具有以下單體的聚合物和共聚物氟乙烯，氯乙烯，溴乙烯和乙烯碘化，苯乙烯和丙 烯酸。磷光分子的選擇可用於封裝的磷光分子可以有不同的結構。它們可以是有機化合物、有機/無機 混合材料，以及具有有機配體的金屬螯合物。適合封裝的磷光分子包括、但不局限於與各種配體絡合的鉬，鈀，釕，鋨，銥，銦，鉬，鎝，銅，鐵，鉻，鎢，鋅，錸絡合物。與這些金屬絡合的配 體包括卟啉及其衍生物，卟吩及其衍生物，多吡啶及其衍生物，吡啶，吡嗪，異煙醯胺，咪唑， 雙聯吡啶，三聯吡啶，鄰菲羅啉和雙吡啶吩嗪。合適的配體可用烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、取代芳烷基、羧基、甲醛 基、羧胺基、氰基、氨基、羥基、亞氨基、醇羰基、氨羰基、脒、胍、醯脲、含官能團的硫基、含官 能團磷基和N-羥基琥珀醯亞胺羧酸酯基取代。卟啉及卟吩金屬絡合物具有耦合成亞甲基 橋的吡咯基，從而形成具有金屬螯合內部空穴的環狀結構。許多這樣的分子在室溫情況下、 在適當的溶劑(例如水)中和無氧的環境中能表現出強烈的磷光特性。一些能夠表現出磷 光特性的卟啉絡合物包括但不限於鉬(II)糞卟啉I和III、鈀(II)糞卟啉、釕糞卟啉、鋅 (II)糞卟啉I及其衍生物等等。同樣，一些能夠表現出磷光特性的卟吩絡合物包括但不限 於鉬(II)四-氟苯基卟吩，和鈀(II)四-氟苯基卟吩。如上所述，雙吡啶金屬絡合物也可以用於本發明。一些合適的雙吡啶絡合物的例子包括但不局限於雙[(4，4'-甲酯基)-2，2'雙吡啶]2-[3-(4_甲基_2，2'-雙吡啶_4 基)丙基]-1，3-釕(II)；雙(2，2'雙吡啶)[4-( 丁醛)-4'-甲基_2，2'-雙吡啶]釕 (II)；雙(2，2'雙吡啶)[4-(4'-甲基-2，2'-雙吡啶4'-基)丁酸]釕(II)；三(2， 2'雙吡啶)釕(II) ;(2，2'雙吡啶)[雙二(1，2_ 二苯基膦基)乙烯]2-[3-(4_甲基-2， 2'-雙吡啶4'-基)丙基]1，3_ 二氧戊環鋨(II)；雙(2，2'-雙吡啶)[4-(4'-甲 基_2，2'-吡啶)丁基]釕(II)；雙(2，2'雙吡啶)[1-溴-4(4'-甲基_2，2'-雙吡 啶-4-基)丁烷]釕(II)，雙(2，2'-雙吡啶)馬來醯亞胺基己酸，4-甲基_2，2'-雙吡 啶4' -丁醯胺釕(II)等等。本發明的技術方案中兩種或兩種以上的磷光分子在同一微球中，這兩種磷光分子 要不會相互影響。這兩種磷光分子各自獨立地發射出磷光。它們可以由相同波長或不同波 長的光子激發，可能會放出相同波長或不同波長的光子。它們放射磷光的時長可能相同或 明顯不同。在許多情況下，優選採用放射磷光的壽命和發射波長有很大不同的情況，從而使 它們的磷光放射性可以通過不同的波長和/或壽命來區分出來。例如，光學過濾器可用於 分離不同波長的光放射。時間閘技術也可用於分離不同壽命的光放射。在某些情況下，光 學過濾器和時間閘技術可以同時使用，以實現不同波長和壽命的光放射分離。螢光分子的選擇除了嵌在包含PMMA的基體中的磷光分子，微球可能進一步包含一個或多個螢光 分子。螢光分子的吸收光譜和上述的磷光分子的吸收光譜有明顯的交疊部分，從而能夠在 螢光分子和磷光分子一同嵌入在微球中時能有效地進行磷光共振能量轉移。為使螢光分 子能在微球基體中均勻分布，螢光分子首選採用疏水性的、並與PMMA基體相容性良好的 螢光分子。有用的螢光分子如螢光素及其衍生物，rhoadamine及其衍生物，氟硼熒，由 MolecularProbes, Oregon Green dyes, Texas Red dyes, coumarin dyes 公司出售的商品 名為Alexa的螢光染料。表面官能團的選擇存在於微球表面的官能團可直接與配體或生物高分子反應，使這些配體或生物高 分子附著在微球的表面形成共價連接，或者被激活後和這些分子共價標記。表面官能團優 選採用選自由羧酸基、乙醇胺基、羥基，胺基，氨基，亞胺基及其它們的組合物組成的親水性基團。 此外，微球可以有一個以上的表面官能團。這些基團包括，但不限於硫酸鹽，磷酸 鹽，羥(基)氫氧基，羧基，酯，醯胺，脒，胺，巰基和乙醛。這些表面基團在修飾該微球的物 理性質方面很重要。交聯劑的選擇和交聯方法雖然非交聯的PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)微球已足夠適用於一些應用。但在某些 應用中，使用更穩定的交聯PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)微球是更優的選擇。在本發明中，微 球可進一步地包含至少一種可以交叉結合兩個或更多PMMA聚合物的交聯劑，從而使這些 微球可以更穩定，即使在相對惡劣的條件下，如高溫、存在有機溶劑和表面活性劑的情況下 也難以降解。這種交聯劑通常佔微球總重量的0. 5% 25%。目前存在許多可以用於交聯PMMA聚合物、共聚物或微球其他組分的交聯劑， PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)聚合物和共聚物可通過聚合物部分和部分之間的連接實現直接 交聯，或者通過其他單獨的橋接或交聯材料來實現交聯。例如，包含但不限於由比如順丁 烯二酸酐、順丁烯二酸、反丁烯二酸和甲叉丁二酸等不飽和二酸製成的不飽和聚合物；或是 如聚乙二醇-二(烯丙基碳酸鹽)、聚醯亞胺、聚馬來醯亞胺的不飽和聚合物；或是有兩個 完全相同的反應終點的同源雙功能交聯劑，比如雙(磺基琥珀醯亞胺)辛二酸鹽、雙琥珀醯 亞胺基酒石酸鹽和雙磺基琥珀醯亞胺酒石酸鹽；或是有兩個不同的反應終點的異源雙功能 交聯劑，比如m-順丁烯醯胺苯甲酸-N-羥基丁二醯亞胺酯，[N-(E-馬來醯亞胺己酸)-琥 珀醯亞胺]，以及馬來醯亞胺順丁烯二醯亞胺PEG醯胼聚合物，或是能夠交叉連接包含滷素 的聚合物的小分子，其他的連接單元可以包含乙醇胺基、羥基、胺基、氨基、亞胺基、或聚乙 二醇基。另一種交聯方法是，通過利用兩個或多個PMMA共聚物，其中一個作為主封裝基體， 另一個或其他的作為交叉連接用聚合物，這樣的結構同樣能產生非常穩定的微球。在本發明的範圍內還有一種交聯方法，由包含嵌段共聚物和一個或更多交聯的小 分子的一個或多個PMMA(甲基丙烯酸甲酯嵌段)共聚物組成的聚合物系統，嵌段共聚物可 為隨機嵌段。嵌段共聚物可以從兩嵌段、三嵌段、星形嵌段、多嵌段中選擇。嵌段和嵌段之 間的排列可以是頭對尾、頭對頭、尾對尾這些形式，且尾端基團連接。其中至少有一個共聚 物要有能提供生物製劑結合的親水基聚合物。例如，包括但不限於甲基異丁烯酸鹽[酯] 單體和順丁烯二酸酐單體組成的共聚物，或是順丁烯二乙酯單體和反丁烯二乙酯單體組成 的共聚物。另一種交聯微球的方法是通過磷光材料的交聯形成(比如共價耦合的方式)，這 種磷光材料可以用包含滷原子的聚合物封裝起來。另一種方法是使用含滷原子的磷光材 料和一個單獨的交聯材料。例如採用包括但不限於獨立使用的主要是基於基礎胺反應的 交聯劑，如醯亞胺酯和N-羥基-琥珀醯亞胺酯，基於巰基反應的交聯劑如馬來醯亞胺(順 丁烯二醯亞胺)，滷代乙醯化合物和吡啶基二硫化物；羰基反應交聯劑如等醯胼，碳化二亞 胺，以及光反應交聯劑如P-疊氮苯甲醯胼，4-(ρ-疊氮水楊醯胺)丁胺和N-羥基琥珀醯亞 胺-4-疊氮水楊酸。最後，可以使用一種交聯的、含有滷原子的磷光材料。微球的交聯可以 採用本領域熟知的方法來實現，比如通過熱、光引發和自由基交聯。生物活性共振發光微球及其製備本發明涉及的一種生物活性共振發光微球，可以以共價鍵形式、也可以物理形式包覆在化學和生物物種表面，這些物種可以參與特異性識別反應，包括特異性結合、核酸雜 交和酶反應。要麼只包含磷光分子，要麼包含作為發射源的磷光分子和螢光分子的微球以微球 表面的生物活性物種進行共價標記。生物活性物種可通過一個具有明顯親水性的間隔區域 來實現共價標記。這種間隔區域可以是諸如乙烯乙二醇低聚物的小分子間隔區域，也可以 是諸如肽、蛋白質、聚乙二醇、sacharrides和多糖的大分子實體。微球表面和生物活性種 的結合包括氨基鍵結合，酯鍵結合，C-C鍵結合，C-N鍵結合和包含電荷相互作用的螯合。這 裡所指的生物活性物種包括可以參與特定的結合反應或酶反應的任何化學實體。生物活性 物種的例子包括包含在特定的識別和結合中的分子實體，比如抗體、抗原/半抗原、核酸、 配體、受體、人工多肽、蛋白質、多糖。生物活性物種的例子還包括參與酶反應的化學實體， 比如酶作用物。酶作用物的例子包括多肽、核酸、蛋白質、小分子脂、糖和多糖。該生物活性物種一般都可以採用多種眾所周知的技術中的任何一種附著在表面功能化的微球上。例如，可以通過使用羧基、氨基、醛、溴乙醯、碘乙醯、硫醇、環氧和其他活 性或鍵合功能基、以及剩餘的自由基和陽離子自由基將生物活性物種共價附著在微球上， 同時也實現了蛋白質的耦合反應。一個表面官能團也可以作為官能共聚用單體的一個組 合，因為微球的表面可以包含表面濃度相對較高的極性基。此外，雖然微球往往合成被功能 化，在某些情況下，如聚(苯硫酚)微球可以直接共價鍵連接蛋白質，而不需要進一步的修 改。例如，共價鍵結合生物活性物種到微球上的第一步是用碳化二亞胺激活微球表面的羧 基。第二步，激活的羧基與抗體的氨基反應形成醯胺鍵。激活和/或抗體耦合可以發生在 諸如磷酸(鹽)緩衝液(PBS)(例如，pH值7. 2)或2-(N-嗎啉)乙烷磺酸(MES)(例如，pH 值5. 3)的緩衝劑中。由此產生的微球可以與乙醇胺嵌段，例如，形成微球結合物。共振發光微球的結構及其製備正於發明人所發現的，該共振發光微球也可能有核殼結構。核_殼的化學成分可 能相同或不同。核可以只裝入磷光分子，殼裡面嵌有螢光分子，反之亦然。一種具體的實現 為一個核主要包含封裝有磷光分子的PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)聚合物和共聚物，外殼由 聚苯乙烯構成。另一種實現為核主要包含封裝有螢光分子的聚苯乙烯，殼主要包含封裝有 磷光分子的PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)聚合物和共聚物。核和殼的相對質量可以改變。優 選的方案是所述微球的核心包括封裝有磷光分子的聚甲基丙烯酸甲酯聚合物。優選的，所 述微球的外殼包括封裝有螢光分子的聚苯乙烯聚合物。目前存在著許多技術可以製作表面功能化的PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)的微球。 可以採用現知的很多方法將磷光分子和/或螢光分子一同納入到基於PMMA(聚甲基丙烯 酸甲酯)的微球中，比如甲基丙烯酸甲酯單體和包含染料的共聚用單體的共聚合，或在聚 合物微球水懸浮液中添加在合適的有機溶劑中的合適的染料衍生物。例如，PMMA(聚甲基 丙烯酸甲酯)的微球可以自由激發的、單一不飽和的單體的懸液的無氧或低氧性共聚合產 生，可能包含或可能不包含如羧基、氨基或羥(基)氫氧基的共價鍵組，和含有螢光單體的 混合物佔由適當數量的磷光分子和/或螢光分子的單體總重量的至少10%。磷光聚甲基丙 烯酸甲酯微球也可以通過以下方法來得到往攪拌的PMMA微球的水懸浮液中逐步增加泡 在合適的溶液中的螢光染料溶液。表面功能化的共振發光微球可以通過分散聚合技術產生。典型的，甲基丙烯酸甲酯單體、提供表面官能團的其他如甲基丙烯酸的單體、引發劑、諸如12-羥基硬脂酸的穩定 齊U、可能或者可能沒有如乙烯基的聚合體的磷光分子和/或螢光分子在一個溶劑系統中都 是分散的。排除分散系統的氧氣後通過溫度升高開始聚合形成微球。當然，分散系統也可 以包含可導致的交叉連接的表面功能化微球的交聯劑。具體製造微球的分散聚合過程可能 會有所不同，這取決於所需要的微球的大小、該磷光分子和螢光分子的溶解性。表面功能化PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)微球也可由眾所周知的乳液聚合來產生。 典型的包括，形成含有丙烯酸甲酯單體、其他如提供表面官能團的甲基丙烯酸的單體，可能 包含或可能不包含聚合體的磷光和/或螢光分子、如P-苯乙烯酯的乳化穩定劑，如過硫酸 鉀水溶液之類的引發劑的乳液。如果想得到交聯微球，乳化系統也可以包含如乙烯乙二醇 二甲基丙烯酸酯的交聯劑。乳劑聚合反應通過加熱進行，得到微球。表面功能化的聚甲基丙烯酸甲酯的微球也可以由將脂溶性的、但微溶於水的磷光 分子和/或螢光分子封裝入預先製成的表面功能化的空聚甲基丙烯酸甲酯微球中，或通過 膨脹技術使它要麼不交叉連接，要麼交叉連接。這種方法的一大好處是可以預先準備具有 預期特性的統一的聚合體微球，通過仔細地優化程序，然後加入精選的螢光染料系列。此 夕卜，基於溶液的添加程序提供了很大的靈活性，可以調整染料的相對濃度，相對濃度是實現 高效率的能量轉移時的一個關鍵參數。在某些情況下，這可能是得到理想的微球的首選方 法。這種技術的典型步驟包括，首先通過使用一個包括水和諸如丙酮和二氯甲烷的有機溶 液的溶劑系統，使要麼不交聯要麼交聯的空白表面功能化聚甲基丙烯酸甲酯的微球溶脹。 溶脹系統可能還包含其他物種，如用以保護溶脹的PMMA微球的表面活性劑。在PMMA微球溶 脹後，加入磷光分子和/或螢光分子，使分子能穿透進入到溶脹的微球內。去除溶脹溶劑驅 動磷光分子和/或螢光分子進入微球內。另一種驅動磷光分子和/或螢光分子到微球內的 方法為在反應體系中加入水等溶劑降低溶劑與磷光分子和/或螢光分子的親性(親脂性)。無論封裝的微球是以何種技術形成的，它們的形狀一般不同。具體的可以是，例如 微球呈球形。但是，應了解，其他形狀也是可能的，如平板狀、棒狀、圓盤狀、條狀、管狀、和其 他不規則形狀等，此外，微球的大小可能也不同。例如微球的平均大小(比如直徑)可以從 納米到0. 1納米到約100微米，一種具體的情況是從大約0. 1納米到50微米左右，另一種 具體的情況是從約1納米到大約10微米。例如，微米級微球通常是人們想要得到的。當利 用時，這樣的「微米尺度」微球可能具有約1微米到1000微米的平均尺寸，在某種具體的情 況時，從約1微米至100微米左右，在某種具體的情況時，從1微米到10微米。同樣，納米 微球也可以被利用。這種納米級微球可能具有約0. 1納米至約10納米的平均尺寸，在某種 具體的情況時，從大約0. 1納米到5納米，而且在某種具體的情況時，約1納米至5納米大 小。共振發光微球的用途由於長壽命的磷光分子具有強磷光性，可以應用於時間分辨磷光檢測技術，這種 表面功能化微球是檢測核酸(如RNA和DNA)、蛋白質、多肽、微生物、酶、抗原、抗體、病毒、 半抗原、和其他化學物質的理想試劑。使用微球的時間分辨磷光檢測技術可以匹敵同位素 放射性檢測試劑的檢測靈敏度，還具有最小的毒性和高穩定性。這個檢測技術的靈敏度高 於傳統的螢光檢測，這是因為時間分辨磷光檢測技術具有較低的背景幹擾，顯著提高信號 /噪聲比，特別是非常複雜的樣品，諸如檢測生物樣本，包括組織、食物樣本、血樣和環境樣品。該微球可以作為結合試驗中的檢測任何物種的標記物。多種多樣的結合試驗中使 用的各種標記物，包括放射性同位素、螢光分子、螢光微球、酶和有色微球。這些標籤可以用 本發明的微球取代。採用微球後可以提高許多不同類型的結合試驗的檢測靈敏度，包括核 酸雜交化驗，抗體抗原結合試驗，抗體半抗原為基礎的化驗，和糖蛋白-凝集素結合化驗。 為了提供一個檢測信號，在結合反應中一個或多個微球被附著於物種上，形成微球標記探 針。或者一個或多個結合的組分附著到一個單一的微球上。附著一項結合組分到微球上通 常通過使用特異性識別並緊密結合的成對分子來實現。比如，特異性結合成對的部分(如 抗生物素蛋白和生物素，或地高辛和抗地高辛抗體)。其中的一個組分要麼直接耦合或者通 過連接分子耦合到另一個結合組分上。微球標記的探針可以用於很寬範圍的結合檢驗試驗 中，包括夾心法檢測和競爭法檢測。一個典型的用微球標記探針的夾心結合實驗包括(1)固定一個結合的部分(例 如，一個抗體或一個核酸低聚物)特別是為了在固體基質上的感興趣的分析物(如抗原或 基因組DNA或RNA)的情況。(2)孵化一個含有分析物的樣本，以便與固定的部分結合。(3) 去除留下來的樣本的非結合的其他組成部分；(4)孵化微球標記探針，使在微球上的一個 結合部分(例如，抗體識別抗原的一個不同的抗原決定基，或其他核酸低聚物補充與分析 物的DNA或RNA不同的序列)與分析物結合；(5)去除沒有結合的微球標記探針；(6)用脈 衝激發光測量從結合微球標記探針中發出的時間分辨的磷光信號；(7)與標準曲線比較， 從而得到分析無的濃度和數量的信息。當然，其他類型的夾心結合實驗形式和程序也適用 於使用微球標記探針。微球標記探針也可以用於取代通常用於螢光競爭結合試驗的螢光探針，例如競爭 免疫檢測。與用螢光探針測量螢光信號不同，從捕獲的微球標記探針中測量得到時間分辨 的磷光，與標準曲線相比，獲得樣本中分析物的數量。除了應用於溶液的結合化驗，微球標記探針也可用於幹化學的結合化驗。例如，微 球標記的探針可以在基於膜的橫向流動免疫測定中取代有色微球聯合(如金微球或乳膠 微球)。微球標記的探針也可以在得到分析物量化情況的基於膜的橫向流動免疫測定中取 代螢光微球聯合。勝於在側流試驗裝置的檢測線上測量被捕獲的有色微球或被捕獲的螢光 微球的螢光的吸收率或是反射率，時間分辨螢光用於被捕獲的微球探針的測量。


下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述圖1為在室溫環境條件下，懸浮在水中的PMMA鉬微球(微球I)和懸浮在水中的 PMMA螢光微球(微球II)的激發光譜和發射光譜；在650nm處收集微球I的激發光譜，在 680nm處收集微球II的雷射光譜。微球1的發射光譜在395nm處收集，微球II的發射光譜 在630nm處採集；圖2為實施例1 3製備的三種微球的時間分辨發射光譜，以650nm處收集的微 球I的發射強度作為相對發光強度進行均一化處理。
具體實施例方式以下結合具體實施例對上述方案做進一步說明。應理解，這些實施例是用於說明本發明而不限於限制本發明的範圍。實施例中採用的實施條件可以根據具體廠家的條件做 進一步調整，未註明的實施條件通常為常規實驗中的條件。實施例1含有磷光分子的磷光微球(微球I)的製備取Polysciences公司產的聚甲基丙烯酸甲酯微粒(2. 7%，0. 324 μ m) 5ml，清洗離 心後在10毫升超純水中懸浮超聲。加入含聚乙烯醇15毫克的0.5毫升水，攪拌2分鐘。然 後，加入含8毫克的十二烷基硫磺酸鈉的0. 5毫升水，並混合2分鐘。然後加入20毫升乙 醇，攪拌5分鐘。通過注射器緩慢加入含1 毫克的 Pt-TMFPP (platinum(II) tetra-meso-f Iuorophe nylporphine)750ul 二氯甲烷，加入時間可以超過5分鐘，繼續攪拌5分鐘。通過注射泵以 0. 5ml/minute速度加入水25毫升，然後空氣氣流去除一些溶劑定容到30毫升。對微球進 行離心去除上清液，用90%醇清洗3遍，清洗後的微球用50毫升水懸浮。實施例2含有螢光受體的螢光微球(微球II)的製備取Polysciences公司產的聚甲基丙烯酸甲酯微粒(2. 7%，0. 324um) 5ml，清洗離 心後在10毫升超純水中懸浮超聲。加入含聚乙烯醇15毫克的0.5毫升水，攪拌2分鐘。然 後，加入含8毫克的十二烷基硫磺酸鈉的0. 5毫升水，並混合2分鐘。然後加入5毫升乙醇， 攪拌5分鐘。通過注射器緩慢加入含1毫克的螢光分子(6-(((4，4-difluoro-5-(2-pyrroly 1)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-lyl)styryloxy)acetyl)aminohexanoic acid)的 750ul 二氯甲烷，加入時間可以超過5分鐘，繼續攪拌5分鐘。通過注射泵以0. 5ml/minute 速度加入水25毫升，然後空氣氣流去除一些溶劑定容到30毫升。對微球進行離心去除上 清液，用90%醇清洗3遍，清洗後的微球用30毫升水懸浮。實施例3共振發光微球的製備(聚甲基丙烯酸甲酯鈀微球)取Polysciences公司產的聚甲基丙烯酸甲酯微粒(2. 7%，0. 324um) 5ml，清洗離 心後在10毫升超純水中懸浮超聲。加入含聚乙烯醇15毫克的0.5毫升水，攪拌2分鐘。然 後，加入含8毫克的十二烷基硫磺酸鈉的0. 5毫升水，並混合2分鐘。然後加入5毫升乙醇， 攪拌5分鐘。通過注射器緩慢加入含1毫克的1毫克螢光分子(6-(((4，4-difluoro-5-(2 -pyrrolyl)-4-bora~3a,4a-diaza-s-indacene-3-lyl)styryloxy)acetyl)aminohexanoic acid)禾口 1 毫克 Pt_TMFPP (platinum (II) tetra_meso_fluorophenylporphine)的 750ul 的 二氯甲烷，加入時間可以超過5分鐘，繼續攪拌5分鐘。通過注射泵以0. 5ml/minute速度 加入水25毫升，然後空氣氣流去除一些溶劑定容到30毫升。對微球進行離心去除上清液， 用90%乙醇清洗3遍，清洗後的微球用30毫升水懸浮。實施例4微球的物性檢測1、微球I和微球II的激發和發射光譜取實施例1和2製備的IOul微球1、11，懸浮在750UL水中進行檢測，在650nm處 收集微球I的激發光譜，在680nm處收集微球II的雷射光譜。微球1的發射光譜在395nm 處收集，微球II的發射光譜在630nm處採集，如圖1所示。2、微球I、II、III的時間分辨發射光譜取20 μ 1實施例1，2和3製備的微球I、微球11和微球III，分別懸浮在750 μ 1水中進行檢測，得到的參數繪製成時間-發射光譜變化曲線。檢測的條件是樣品的激發波長為395nm，延遲的時間為0. 04ms，樣本窗口為2 μ s，每閃時間是50 μ s，收集10個脈衝的 發射光譜，收集5次取其均值。用650nm處收集的微球I的發射強度作為相對發光強度進 行均一化處理。如圖2所示，微球I在650nm處延遲後40us明顯產生強烈發射的譜峰。微 球II在665nm處延遲40us基本上沒有發射強度。微球III在661nm處延遲40us後產生 強烈發射的譜峰。在延遲40us後磷光分子將能量轉移給螢光分子產生微球III所示的譜 峰。 上述實例只為說明本發明的技術構思及特點，其目的在於讓熟悉此項技術的人是 能夠了解本發明的內容並據以實施，並不能以此限制本發明的保護範圍。凡根據本發明精 神實質所做的等效變換或修飾，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。
權利要求
一種表面功能化的共振發光微球，其特徵在於所述微球包括以下組成聚甲基丙烯酸甲酯的聚合物或共聚體，所述聚合物或共聚體形成封裝基體，且甲基丙烯酸甲酯單體至少佔所述共振發光微球的總重量的50％；至少兩種光致發光分子的混合物；所述光致發光分子選自磷光分子和螢光分子，所述磷光分子在無氧或低氧環境下產生磷光，所述螢光分子在適當的波長激發下可發射螢光，所述混合物中光致發光分子的光譜共振實現能量轉移，且光致發光分子均勻分布在所述的聚甲基丙烯酸甲酯的聚合物或共聚體形成的封裝基體中；所述微球表面具有一種或一種以上的官能團，所述官能團直接與配體或生物學大分子反應形成微球表面的共價鍵連接，所述表面官能團也可以激活後與配體或生物學大分子進行共價標記。所述共振發光微球的粒徑在40納米到10微米之間。
2.根據權利要求1所述的表面功能化的共振發光微球，其特徵在於所述聚甲基丙烯酸 甲酯的共聚物具有式(2)的結構通式AnBffl(2)；其中n，m大於50，A為甲基丙烯酸甲酯單體，B選自與甲基丙烯酸甲酯單體連接且不包 括甲基丙烯酸甲酯單體本身的任何單體。
3.根據權利要求1所述的表面功能化的共振發光微球，其特徵在於所述共振發光微球 為核_殼結構的微球；所述共振發光微球的核心包括封裝有磷光分子的聚甲基丙烯酸甲酯 聚合物或共聚物。
4.根據權利要求3所述的表面功能化的共振發光微球，其特徵在於所述共振發光微球 的外殼包括封裝有螢光分子的聚苯乙烯聚合物。
5.根據權利要求1所述的表面功能化的共振發光微球，其特徵在於所述的磷光分子包 括有機磷光分子和有機/無機混合材料、磷光金屬螯合物。
6.根據權利要求1所述的表面功能化的共振發光微球，其特徵在於所述的磷光分子 選自與配體螯合的鉬，鈀，釕，鋨，銥，銦，鉬，鎝，銅，鐵，鉻，鎢，鋅，錸螯合物；所述配體選自 卟啉及其衍生物，卟吩及其衍生物，多吡啶及其衍生物，吡啶，吡嗪，異煙醯胺，咪唑，雙聯吡 啶，三聯吡啶，鄰菲羅啉和雙吡啶吩嗪；所述配體可為以下有機基團任選取代烷基、取代 烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、取代芳烷基、羧基、甲醛基、羧胺基、氰基、氨基、羥基、亞氨 基、醇羰基、氨羰基、脒、胍、醯脲、含官能團的硫基、含官能團磷基和N-羥基琥珀醯亞胺羧 酸酯基。
7.根據權利要求1所述的表面功能化的共振發光微球，其特徵在於所述的磷光分子選 自雙[(4，4'-甲氧基)-2，2'聯吡啶]2-[3-(4_甲基_2，2'-聯吡啶_4基)丙烷基]-1， 3-二氧戊環釕(II)、雙(2，2'聯吡啶)[4-( 丁醛)-4'-甲基_2，2'-雙吡啶]釕(II)、 雙(2，2'聯吡啶)[4-(4'-甲基_2，2'-聯吡啶4'-基)丁酸]釕(II)、三(2，2『聯吡 啶)釕(Π)、(2，2'聯吡啶)[雙二(1，2_ 二苯基膦基)乙烯]2-[3-(4_甲基_2，2'-聯吡 啶4'-基)丙基]-1，3-二氧戊環鋨(II)、雙(2，2'聯吡啶)[4-(4'-甲基_2，2'-吡 啶)丁基]釕(II)、雙(2，2'-聯吡啶Kl-溴-4(4'-甲基_2，2'-聯吡啶_4_基)丁 烷]釕(II)、雙(2，2'-雙吡啶)馬來醯亞胺基己酸，4-甲基_2，2'-聯吡啶4' -丁醯 胺釕(II)、鉬(二)四-氟苯基卟吩，鈀(II)四-氟苯基卟吩。
8.根據權利要求1所述的表面功能化的共振發光微球，其特徵在於所述的磷光分子佔 所述微球總重量的0. 05% 5%。
9.根據權利要求1所述的表面功能化的共振發光微球，其特徵在於所述的螢光分子選 自螢光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、腎上腺素染料、Alexa Fluor系列染料。
10.根據權利要求1所述的表面功能化的共振發光微球，其特徵在於所述共振發光微 球包括以下組成聚甲基丙烯酸甲酯的聚合物或共聚體，所述聚合物或共聚體形成封裝基體，且甲基丙 烯酸甲酯單體至少佔所述共振發光微球的總重量的50% ；兩種磷光分子的混合物；所述磷光分子在無氧或低氧環境下產生磷光，所述混合物均 勻分布在所述的聚甲基丙烯酸甲酯的聚合物或共聚體形成的封裝基體中；所述微球表面具有一種或一種以上的官能團，所述官能團直接與配體或生物學大分子 反應形成微球表面的共價鍵連接，所述表面官能團也可以激活後與配體或生物學大分子進 行共價標記。
11.根據權利要求10所述的表面功能化的共振發光微球，其特徵在於所述兩種磷光分 子的混合物中第一磷光分子與第二磷光分子的重量比在0. 1 10範圍內。
12.根據權利要求1所述的表面功能化的共振發光微球，其特徵在於所述共振發光微 球包括以下組成聚甲基丙烯酸甲酯的聚合物或共聚體，所述聚合物或共聚體形成封裝基體，且甲基丙 烯酸甲酯單體至少佔所述共振發光微球的總重量的50% ；一種磷光分子和一種螢光分子的混合物；所述磷光分子在無氧或低氧環境下產生磷 光，所述螢光分子在適當的波長激發下可發射螢光，所述混合物均勻分布在所述的聚甲基 丙烯酸甲酯的聚合物或共聚體形成的封裝基體中；所述螢光分子的吸收光譜和所述的磷光 分子的磷光光譜顯著的交疊實現能量轉移；所述微球表面具有一種或一種以上的官能團，所述官能團直接與配體或生物學大分子 反應形成微球表面的共價鍵連接，所述表面官能團也可以激活後與配體或生物學大分子進 行共價標記。
13.根據權利要求12所述的表面功能化的共振發光微球，其特徵在於所述一種磷光分 子和一種螢光分子的混合物中磷光分子與螢光分子的重量比在0. 1 10範圍內。
14.根據權利要求1所述的表面功能化的共振發光微球，其特徵在於所述的表面官能 團選自一種或一種以上的以下基團羧基，乙醇胺基，羥基，胺基，氨基，亞胺基，環氧基，異 氰酸酯基，三聚氰胺基，金屬醇鹽，水解類甲矽烷基，β -酮酸酯基和聚乙二醇基。
15.根據權利要求1所述的表面功能化的共振發光微球，其特徵在於所述的共振發光 微球還包括一種或一種以上的交聯兩個或兩個以上的聚甲基丙烯酸甲酯的聚合物或共聚 體的交聯劑；所述的交聯劑佔微球總質量的0. 5% 25%。
16.根據權利要求15所述的表面功能化的共振發光微球，其特徵在於所述的交聯劑選 自雙功能交聯丙烯酸單體、多功能交聯丙烯酸單體和雙反應丙烯酸單體；所述的雙功能交 聯丙烯酸單體選自乙烯基乙二醇二甲基丙烯酸脂和1，10_癸烷二甲基丙烯酸脂；所述的多 功能交聯丙烯酸單體選自季戊四醇三丙烯酸酯和三甲基色氨酸丙烷三丙烯酸酯；所述的雙 反應丙烯酸單體選自2-氨乙基甲基丙烯酸鹽氫氯化物和2-氰乙基丙烯酸鹽。
17.根據權利要求1所述的表面功能化的共振發光微球，其特徵在於所述共振發光微 球還包括一種或一種以上的通過所述官能團共價連接而覆蓋在所述微球表面的生物活性 物種。
18.根據權利要求17所述的表面功能化的共振發光微球，其特徵在於所述的生物活性 物種選自抗體、抗原、半抗原、核酸、配體、受體、人工多肽、蛋白質、多糖和酶反應物，所述生 物活性物種能參與特異性識別和結合反應。
19.一種權利要求1所述的表面功能化的共振發光微球在分析檢測和成像方面的應用。
20.一種試劑盒，其特徵在於所述試劑盒包括權利要求1所述的共振發光微球，作為分 析檢測用的探針或標記物。
21.一種權利要求20的試劑盒在免疫檢測技術、核酸雜交技術和酶檢測技術方面的應用。
22.—種權利要求20的試劑盒在溼化學領域或幹化學領域方面的應用。
全文摘要
本發明公開了一種表面功能化的共振發光微球，包括聚甲基丙烯酸甲酯的聚合物或共聚體、至少兩種光致發光分子的混合物；所述微球表面具有一種或一種以上的官能團，所述官能團直接與配體或生物學大分子反應形成微球表面的共價鍵連接，所述表面官能團也可以激活後與配體或生物學大分子進行共價標記。所述共振發光微球的粒徑在40納米到10微米之間。這些磷光微粒有效地抑制在外界環境下三重態氧與受激發的三重態磷光分子之間的直接相互作用，從而具有強磷光性，甚至在室溫條件下，這些微球也能保持相當長時間的磷光性，可以應用於醫療診斷、生物檢測、環境監測和食品安全監測以及不同物種檢測技術領域中。
文檔編號G01N33/53GK101805483SQ20101011618
公開日2010年8月18日 申請日期2010年2月26日 優先權日2010年2月26日
發明者何愛民 申請人:光景生物科技(蘇州)有限公司