整體可視化人肺腺癌h1650裸鼠模型及其建立與應用的製作方法

2023-06-19 05:17:06

專利名稱：整體可視化人肺腺癌h1650裸鼠模型及其建立與應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於裸鼠模型及其建立與應用領域，特別涉及一種整體可視化人肺腺癌H1650裸鼠模型及其建立與應用。
背景技術：
肺癌是威脅我國人民健康的頭號殺手。據衛生部發布的《2010年中國衛生統計年鑑》，我國2009年惡性腫瘤在所有疾病死亡原因中居首位，統計資料顯示死亡率排名前十位的惡性腫瘤中，肺癌居首位，為我國的社會發展帶來嚴重的經濟負擔。近年來，肺癌的治療和基礎研究取得了較大發展，但目前肺癌藥物的基礎和臨床前研究尚欠缺一種能更方便的評估藥物療效的可靠的體內、體外研究平臺，這嚴重製約了肺癌的基礎和臨床前研究。肺癌動物模型是肺癌研究的重要手段，移植性肺癌模型是目前臨床前藥物實驗最常用的模型。移植型肺癌模型是將人肺癌細胞移植到動物體內傳代生長，移植的腫瘤細胞形態學特徵、 染色體數量、同工酶水平等將保持不變，對臨床抗癌藥物敏感性也大致相同，移植型肺癌模型建立的常用方法是皮將肺癌細胞或組織塊接種於裸鼠或其他免疫缺陷小鼠的皮下(腋部、背部、後肢等)建立肺癌模型。此模型建模簡單易行，成瘤率高，易監視腫瘤生長情況，所以常用來作抗癌藥物篩選的動物模型，同時該模型還具有動物來源方便、移植腫瘤細胞生長迅速、倍增時間短、耗費低等優點。但目前應用的移植型肺癌模型對藥物療效的評估多需採取解剖的方法進行評估，操作複雜，受人為操作的影響因素大，不便於臨床前研究。如果能夠建立一種整體可視化肺癌模型，能夠直接進行體外成像監測評估腫瘤的生長轉移情況，可以對活體動物進行觀察，將大大便利肺癌的臨床前研究，同時也能減少人為因素的幹擾，提高評估的準確性。螢光素酶報告基因(Luc)的應用便利了肺癌整體可視化動物模型的構建。螢光素酶報告基因根據來源不同主要分為細菌螢光素酶(Bacterial luciferase, BL)、螢火蟲螢光素酶(firefly Iuciferase1FL)以及海星、發光魚、發光甲蟲等為來源的螢光素酶，目前研究最廣泛並且成為商品酶的是BL和FL JL是由2個多肽亞基組成的異二聚體，相對分子質量約為79X 103。在還原性黃素(FMNH)、八碳以上長鏈脂肪醛(RCHO)和氧分子(O2)存在時，發射出藍綠光(45(T490nm)。FL由單一的多肽鏈組成，相對分子質量為(60 64) XlO3,在Mg2+、ATP、O2存在時催化D-螢光素(D-Luciferin)氧化脫羧發光(55(T580nm)。螢火蟲的螢光素-螢光素酶系統是最早建立的發光模型之一，該發光系統採用螢光素底物發光的形式，不需要激發光，具有較高的靈敏度，此外，螢火蟲螢光素酶發出的光組織吸收少，有利於深部組織成像，並且光的強度與標記細胞數量呈線性相關。通過基因工程方法構建螢光素酶的真核表達載體並轉染到癌細胞中，使其表達螢火蟲螢光素酶，進而利用表達螢光素酶的癌細胞接種至動物即可構建整體可視化腫瘤模型，可通過體外成像的方法，對動物體進行活體觀察而不損傷動物。慢病毒感染較其他轉染方式具有較強的優勢，具有感染譜廣、效率高、可感染非分裂細胞、並可使目的基因穩定整合至宿主基因組因而能夠長期表達、免疫反應小等特點，是一種高效的基因轉移工具。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種整體可視化人肺腺癌H1650裸鼠模型及其建立與應用，與傳統的腫瘤模型藥物效果檢測方法相比，觀察更加直觀方便，並且可進行活體觀察而不損傷動物，結果更加可靠，具有良好的應用前景。本發明的一種整體可視化人肺腺癌H1650裸鼠模型，所述裸鼠模型通過採用基因重組技術和慢病毒感染將螢火蟲螢光素酶基因引入人肺腺癌H1650細胞株中,通過亞克隆篩選獲得穩定表達螢光素酶的腫瘤克隆細胞株，然後採用重組的H1650細胞接種於免疫缺陷裸鼠構建而成。本發明的一種整體可視化人肺腺癌H1650裸鼠模型的建立方法，包括(I)以前期構建的攜帶有螢火蟲螢光素酶基因的質粒為模板擴增出螢光素酶 的cDNA，通過基因克隆的方法插入慢病毒真核表達載體PRRL-CMV質粒中，構建重組質粒Luc-PRRL-CMV 表達質粒設計螢火蟲螢光素酶基因特異性引物(該引物為上遊引物CCTTCTAGAATGGAAGATGCCAAAAACATTAAG;下遊引物CCTGTCGACTTACACGGCGATCTTGCCGCCCTTC)；螢光素酶基因的克隆和慢病毒載體的構建使用該特異性引物PCR擴增螢火蟲螢光素酶基因並克隆至PCR-Blunt克隆載體中並轉化大腸桿菌感受態細胞，質粒抽提後運用基因重組方法將螢光素酶目的基因片段插入慢病毒真核表達載體PRRL-CMV空質粒中並轉化大腸桿菌感受態細胞；質粒抽提後進行雙酶切和測序證實構建的表達載體的正確性；(2)慢病毒感染方法將螢光素酶外源基因導入肺癌細胞株的步驟大腸桿菌擴增螢光素酶慢病毒載體和慢病毒包裝質粒，並純化測定濃度；將螢光素酶慢病毒載體的包裝螢光素酶慢病毒表達載體與慢病毒包裝質粒混合後，用轉染試劑共轉染293T細胞，以產生含有螢火蟲螢光素酶慢病毒顆粒的上清，確定慢病毒顆粒的滴度；病毒感染以人肺腺癌H1650為母細胞,用上述病毒上清進行感染；擴增建系進行細胞亞克隆篩選，檢測單克隆細胞內的螢光表達情況，篩選出穩定表達螢光素酶報告基因的重組細胞株並進行擴大培養；(3)腫瘤皮下注射方法將得到的重組人肺腺癌細胞經消化後重懸於氯化鈉溶液中(200 μ 1)，在裸鼠皮下接種(2Χ IO6)該重組人肺腺癌細胞，監測細胞皮下增殖情況，即得到整體可視化人肺腺癌Η1650裸鼠模型。所述步驟(I)中的基因重組方法為酶切和連接；其中，酶切具體為採用Xba I和Sal I雙酶切。所述步驟(2)中的螢光素酶慢病毒表達載體與慢病毒包裝質粒的質量比為1:3、1:6 或 1:9。所述慢病毒包裝質粒包括第三代慢病毒複製所需要的三個基因gag、pol和rev。
所述步驟(2)中的轉染試劑為MV40轉染試劑。所述步驟(2)中通過ELISA法確定慢病毒顆粒的滴度；通過細胞有限稀釋法進行細胞亞克隆篩選；通過螢光測定儀或活細胞成像儀檢測單克隆細胞內的螢光表達情況。所述步驟(3)中的氯化鈉溶液質量百分比濃度為O. 9%。所述步驟(3)中通過遊標卡尺測量和活體成像儀監測細胞皮下增殖情況。本發明的裸鼠模型應用於觀察腫瘤的生長情況和抗腫瘤藥物的治療效果。所選用的動物除了裸鼠，也可以為SCID鼠。有益.效果 本發明與傳統的腫瘤模型藥物效果檢測方法相比，觀察更加直觀方便，並且可進行活體觀察而不損傷動物，結果更加可靠，具有良好的應用前景。


圖IA為螢火蟲螢光素酶Luciferase慢病毒載體示意圖；圖IB為質粒酶切鑑定圖；圖2為螢光顯微鏡下觀察包裝後的慢病毒上清感染人肺腺癌H1650細胞；圖3為穩定表達Luciferase的H1650細胞體內成瘤實驗；其中，A為活體動物成像，B為活體動物成像定量分析，C為腫瘤生長曲線；圖4為人肺腺癌H1650細胞螢光素酶腫瘤模型在抗腫瘤藥物藥效評價中的應用；其中，A為治療後第12天活體成像(左圖為對照組，右圖為加藥組)，B為活體成像定量分析，C為治療後不同天數腫瘤生長曲線。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。實施例I步驟I.螢光素酶基因的克隆和慢病毒載體的構建在設計螢火蟲突光素酶(Firefly-Luciferase)基因特異性引物後，以攜帶Luciferase基因質粒為模板(碧雲天公司)，PCR擴增出Luciferase cDNA。將擴增的Luciferase基因成功插入PCR-Blunt載體,轉化感受態大腸桿菌細胞後質粒小抽，xbal和SalI雙酶切後割膠純化回收Luciferase基因片段，將該片段與慢病毒真核表達載體PRRL-CMV空質粒(Backbone)連接，轉化感受態大腸桿菌細胞後質粒小抽，雙酶切鑑定和測序結果均證明Luciferase-PRRL-CMV表達載體構建成功，經測序證實序列完全正確(約1700bp)。(ATGGAAGATGCCAAAAACATTAAGAAGGGCCCAGCGCCATTCTACCCACTCGAAGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCTGCACAAAGCCATGAAGCGCTACGCCCTGGTGCCCGGCACCATCGCCTTTACCGACGCACATATCGAGGTGGACATTACCTACGCCGAGTACTTCGAGATGAGCGTTCGGCTGGCAGAAGCTATGAAGCGCTATGGGCTGAATACAAACCATCGGATCGTGGTGTGCAGCGAGAATAGCTTGCAGTTCTTCATGCCCGTGTTGGGTGCCCTGTTCATCGGTGTGGCTGTGGCCCCAGCTAACGACATCTACAACGAGCGCGAGCTGCTGAACAGCATGGGCATCAGCCAGCCCACCGTCGTATTCGTGAGCAAGAAAGGGCTGCAAAAGATCCTCAACGTGCAAAAGAAGCTACCGATCATACAAAAGATCATCATCATGGATAGCAAGACCGACTACCAGGGCTTCCAAAGCATGTACACCTTCGTGACTTCCCATTTGCCACCCGGCTTCAACGAGTACGACTTCGTGCCCGAGAGCTTCGACCGGGACAAAACCATCGCCCTGATCATGAACAGTAGTGGCAGTACCGGATTGCCCAAGGGCGTAGCCCTACCGCACCGCACCGCTTGTGTCCGATTCAGTCATGCCCGCGACCCCATCTTCGGCAACCAGATCATCCCCGACACCGCTATCCTCAGCGTGGTGCCATTTCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACGCTGGGCTACTTGATCTGCGGCTTTCGGGTCGTGCTCATGTACCGCTTCGAGGAGGAGCTATTCTTGCGCAGCTTGCAAGACTATAAGATTCAATCTGCCCTGCTGGTGCCCACACTATTTAGCTTCTTCGCTAAGAGCACTCTCATCGACAAGTACGACCTAAGCAACTTGCACGAGATCGCCAGCGGCGGGGCGCCGCTCAGCAAGGAGGTAGGTGAGGCCGTGGCCAAACGCTTCCACCTACCAGGCATCCGCCAGGGCTACGGCCTGACAGAAACAACCAGCGCCATTCTGATCACCCCCGAAGGGGACGACAAGCCTGGCGCAGTAGGCAAGGTGGTGCCCTTCTTCGAGGCTAAGGTGGTGGACTTGGACACCGGTAAGACACTGGGTGTGAACCAGCGCGGCGAGCTGTGCGTCCGTGGCCCCATGATCATGAGCGGCTACGTTAACAACCCCGAGGCTACAAACGCTCTCATCGACAAGGACGGCTGGCTGCACAGCGGCGACATCGCCTACTGGGACGAGGACGAGCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGAGCCTGATCAAATACAAGGGCTACCAGGTAGCCCCAGCCGAACTGGAGAGCATCCTGCTGCAACACCCCAACATCTTCGACGCCGGGGTCGCCGGCCTGCCCGACGACGATGCCGGCGAGCTGCCCGCCGCAGTCGTCGTGCTGGAACACGGTAAAACCATGACCGAGAAGGAGATCGTGGACTATGTGGCCAGCCAGGTTACAACCGCCAAGAAGCTGCGCGGTGGTGTTGTGTTCGTGGACGAGGTGCCTAAAGGACTGACCGGCAAGTTGGACGCCCGCAAGATCCGCGAGATTCTCATTAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGATCGCCGTGTAA)(見圖 I)，然後大規模抽提質粒，測定濃度後置_80°C備用。步驟2.螢光素酶慢病毒載體的包裝與病毒滴度測定大腸桿菌擴增螢光素酶慢病毒載體和慢病毒包裝質粒，並純化測定濃度。螢光素酶慢病毒載體用MV40轉染試劑轉染HEK293T細胞製備獲得。將Luciferase-PRRL-CMV質粒與慢病毒包裝質粒分別按1: 3、1: 6、1:9轉染293T細胞，在轉染48和72小時後收集293T細胞培養上清，離心去除細胞碎片後置_80°C備用。用GFP-PRRL-CMV質粒載體作為陽性對照。HIV p24ELISA法確定慢病毒顆粒的滴度。步驟3.螢光素酶慢病毒上清感染肺腺癌細胞系將人H1650肺腺癌細胞在含10wt%小牛血清和lwt%雙抗的高糖DMEM中傳代培養。取指數生長期腫瘤細胞，O. 25被％胰蛋白酶(含EDTA)消化，精確計數後按2 X IO5個細胞/孔種植於六孔板，待細胞融合度達7(Γ80%時，稀釋polybrene至培養基，使其終濃度為8μ g/ml，然後用螢光素酶慢病毒上清以最佳滴度感染H1650肺腺癌細胞，同時用GFP慢病毒上清做陽性對照，分別在感染後48h、72h和96h用倒置螢光顯微鏡檢測細胞內GFP表達情況，正常傳代培養後用螢光測定儀和活細胞成像儀檢測細胞內螢光素酶表達情況。以GFP為陽性對照，慢病毒上清感染H1650細胞後72h可觀察到幾乎全部細胞呈GFP陽性表達，用該條件進行Luciferase-PRRL-CMV質粒轉染得到的細胞可用於高表達螢光素酶的穩轉細胞株的篩選(見圖2)。 步驟4.穩定表達螢光素酶的肺腺癌細胞系的篩選和建立用有限稀釋法先在IOcm培養皿種植不同濃度的螢光素酶慢病毒感染後H1650肺腺癌細胞，培養至單細胞克隆形成後，鏡下挑取48個單克隆細胞至96孔板繼續克隆培養(每個單克隆細胞設復孔)，用螢光測定儀和活細胞成像儀分別檢測48個單克隆細胞內螢光素酶的表達，選取螢光素酶表達強、細胞生長情況良好的細胞克隆進行擴大培養，用於腫瘤模型的製作。步驟5.穩定表達螢光素酶的肺腺癌細胞腫瘤模型的建立將穩定表達螢光素酶的H1650肺腺癌細胞(Luc-H1650)培養於含10wt%小牛血清和lwt%雙抗的高糖DMEM中，37°C、5vol%C02培養條件下傳代擴增。取指數生長期腫瘤細胞，
O.25被％胰蛋白酶(含EDTA)消化，醫用O. 9被％氯化鈉溶液重懸，離心洗滌，精確計數後調整細胞懸液濃度備用。選取6 8周齡雌性Balb/c裸鼠皮下接種LUC-H1650細胞(5X 106個/200 μ I).於SPF條件下正常飼養並定期觀察體內成瘤情況。在接種後的第10、20、30、40、50天用遊標卡尺測量腫瘤的長軸(a)和短軸(b )，按公式V=O. 5 X ab2，計算腫瘤體積(mm3);分別在接種後的第7、14、21天用小動物活體成像儀(德國BERTHOLD，NightOWL II LB983)檢測體內腫瘤的發光強度(photon/sec/cm2/steridian),用O. 4%戍巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉裸鼠，再按15mg/kg體重腹腔注射D-突光素鉀鹽(D-Luciferin Potassium Salt)工作液，10-15分鐘後，將裸鼠仰臥於小動物活體成像儀載物臺上進行圖像採集和分析，可·以觀察到構建的表達Luciferase的H1650細胞的Balb/c裸鼠體內腫瘤的發光強度隨生長天數逐漸增強，且腫瘤生長曲線顯示腫瘤發光強度與腫瘤體積曲線正相關(見圖3)。步驟6.按上述方法製作Luc_H1650Balb/c裸鼠腫瘤模型,待腫瘤體積達IOOmm3左右將動物隨機分組用於藥物治療。分組治療如下(I)生理鹽水對照組；(2)Erlotinib組(商品名特羅凱)(腹腔注射，20mg/kg裸鼠，每三天注射一次)。各組持續治療3周，分別在治療的第3、6、9、12、15天測量腫瘤體積，並在第12天用活體成像儀檢測腫瘤的發光強度，以此確定腫瘤的生長和藥物治療效果。活體成像定量分析結果顯示，對照組和治療組間腫瘤的發光強度不同，且與治療後不同天數腫瘤生長曲線正相關，說明H1650細胞螢光素酶腫瘤模型能夠用來反映抗腫瘤藥物的治療效果(見圖4)。
權利要求
1.一種整體可視化人肺腺癌H1650裸鼠模型，其特徵在於所述裸鼠模型通過採用基因重組技術和慢病毒感染將螢火蟲螢光素酶基因引入人肺腺癌H1650細胞株中,通過亞克隆篩選獲得穩定表達螢光素酶的腫瘤克隆細胞株，然後採用重組的H1650細胞接種於免疫缺陷裸鼠構建而成。
2.—種整體可視化人肺腺癌H1650裸鼠模型的建立方法，包括 (1)設計螢火蟲螢光素酶基因特異性引物；使用該特異性引物PCR擴增螢火蟲螢光素酶基因並克隆至PCR-Blunt克隆載體中並轉化大腸桿菌感受態細胞，質粒抽提後運用基因重組方法將螢光素酶目的基因片段插入慢病毒真核表達載體PRRL-CMV空質粒中並轉化大腸桿菌感受態細胞，質粒抽提後進行雙酶切和測序證實構建的表達載體的正確性； (2)大腸桿菌擴增螢光素酶慢病毒載體和慢病毒包裝質粒，並純化測定濃度；將螢光素酶慢病毒表達載體與慢病毒包裝質粒混合後，用轉染試劑共轉染293T細胞，以產生含有螢火蟲螢光素酶慢病毒顆粒的上清，確定慢病毒顆粒的滴度；以人肺腺癌H1650為母細胞，用上述病毒上清進行感染；進行細胞亞克隆篩選，檢測單克隆細胞內的螢光表達情況，篩選出穩定表達螢光素酶報告基因的重組細胞株並進行擴大培養； (3)將得到的重組人肺腺癌細胞經消化後重懸於氯化鈉溶液中，在裸鼠皮下接種該重組人肺腺癌細胞，監測細胞皮下增殖情況，即得到整體可視化人肺腺癌H1650裸鼠模型。
3.根據權利要求2所述的一種整體可視化人肺腺癌H1650裸鼠模型的建立方法，其特徵在於所述步驟(I)中的特異性引物為 上遊引物CCTTCTAGAATGGAAGATGCCAAAAACATTAAG ； 下遊引物CCTGTCGACTTACACGGCGATCTTGCCGCCCTTC ； 基因重組方法為酶切和連接；其中，酶切具體為採用Xba I和Sal I雙酶切。
4.根據權利要求2所述的一種整體可視化人肺腺癌H1650裸鼠模型的建立方法，其特徵在於所述步驟(2)中的螢光素酶慢病毒表達載體與慢病毒包裝質粒的質量比為1:3、1:6 或 1:9。
5.根據權利要求2或4所述的一種整體可視化人肺腺癌H1650裸鼠模型的建立方法，其特徵在於所述慢病毒包裝質粒包括第三代慢病毒複製所需要的三個基因gag、pol和revo
6.根據權利要求2所述的一種整體可視化人肺腺癌H1650裸鼠模型的建立方法，其特徵在於所述步驟(2)中的轉染試劑為MV40轉染試劑。
7.根據權利要求2所述的一種整體可視化人肺腺癌H1650裸鼠模型的建立方法，其特徵在於所述步驟(2)中通過ELISA法確定慢病毒顆粒的滴度；通過細胞有限稀釋法進行細胞亞克隆篩選；通過螢光測定儀或活細胞成像儀檢測單克隆細胞內的螢光表達情況。
8.根據權利要求2所述的一種整體可視化人肺腺癌H1650裸鼠模型的建立方法，其特徵在於所述步驟(3)中的氯化鈉溶液質量百分比濃度為O. 9%。
9.根據權利要求2所述的一種整體可視化人肺腺癌H1650裸鼠模型的建立方法，其特徵在於所述步驟(3)中通過遊標卡尺測量和活體成像儀監測細胞皮下增殖情況。
10.一種如權利要求I所述的整體可視化人肺腺癌H1650裸鼠模型的應用，其特徵在於所述裸鼠模型應用於觀察腫瘤的生長情況和抗腫瘤藥物的治療效果。
全文摘要
本發明涉及一種整體可視化人肺腺癌H1650裸鼠模型及其建立與應用，所述裸鼠模型通過採用基因重組技術和慢病毒感染將螢火蟲螢光素酶基因引入人肺腺癌H1650細胞株中，通過亞克隆篩選獲得穩定表達螢光素酶的腫瘤克隆細胞株，然後採用重組的H1650細胞接種於免疫缺陷裸鼠構建而成。本發明與傳統的腫瘤模型藥物效果檢測方法相比，觀察更加直觀方便，並且可進行活體觀察而不損傷動物，結果更加可靠，具有良好的應用前景。
文檔編號C12N15/867GK102939934SQ201210445078
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月8日 優先權日2012年11月8日
發明者房健民, 周爽, 楊洋, 李棟 申請人:同濟大學