黃瓜雌性相關基因CsPAP‑fib及編碼蛋白和應用的製作方法

2023-06-18 13:39:31

本發明涉及一種黃瓜雌性相關基因及編碼蛋白和應用。

背景技術：

黃瓜(cucumissativus)是屬於葫蘆科(cucurbitaceae)中的一種主要蔬菜作物，其性別類型複雜多樣。因此在二十世紀五十年代末就將黃瓜確定為性型分化研究的模式植物，黃瓜如此多樣的性別分化不僅受控於基因和內源激素，還受環境的影響，其作用機制十分複雜，目前黃瓜性型分化的研究已經成為植物研究者的關注焦點。對新發現的與低夜溫影響黃瓜雌性形成有關的假定蛋白的研究不僅可以揭示該蛋白在黃瓜雌性分化中的作用機制，更為黃瓜高產育種提供了應用價值。曹宗異等(1957)研究了環境影響下黃瓜雌雄花比例的變化，認為外界環境的影響改變了植物新陳代謝的類型，這樣必然會定向地改變植物的性別。江俏梅等(1995)的研究表明，影響瓜類作物性別表現的因素主要有品種本身的遺傳性、環境條件(溫度光照等)及化學調控等。溫度對黃瓜性型表現的影響大於光強度和光周期，低夜溫是影響黃瓜雌性形成的主導因素，光周期影響不明顯。厲建梅(2011)發現了雌花分化受季節影響顯著的黃瓜種質資源『c09-123』，程國輝(2012)通過研究其雌性形成的光溫條件及黃瓜雌性形成具體的溫度反應閥值，確定『c09-123』為溫敏型雌性試驗材料，其性別轉換溫度閾值為12℃～24℃。劉欣童(2016)對不同夜溫條件下『c09-123』相關生理生化指標進行比較分析，通過蛋白質組學研究篩選出與低夜溫誘導黃瓜雌性形成密切相關的蛋白，該蛋白在12℃低夜溫處理樣品中上調表達，因此，推測它很可能參與了低溫誘導的黃瓜雌花分化。因此研究黃瓜性別相關基因，並分析其功能對於黃瓜新品種培育方面具有重要的理論和實際意義。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種黃瓜雌性相關基因cspap-fib及編碼蛋白和應用。

本發明黃瓜雌性相關基因cspap-fib的cdna的核苷酸序列如序列表中seqidno：1所示。

本發明黃瓜雌性相關基因cspap-fib編碼蛋白的胺基酸序列如序列表中seqidno：2所示。

本發明黃瓜雌性相關基因cspap-fib在提高黃瓜雌花節率中的應用。

所述cspap-fib基因導入植物細胞、組織或器官，再將被轉化的植物細胞、組織或器官培育成植株，使所述cspap-fib基因在植物中表達，得到雌花節率高的轉基因植物。所述植物為黃瓜。

本發明的有益效果：

本發明首次在黃瓜中報導與黃瓜雌性相關基因cspap-fib，並通過pcr技術克隆出黃瓜cspap-fibcdna全長。本發明發現對於黃瓜中cspap-fib基因cdna全長為870bp，編碼289個胺基酸，其編碼的蛋白屬於葉綠體中一個不穩定的疏水蛋白，無明顯信號肽，無跨膜結構，並且含有一個pap-fibrillin結構域，預示其可能參與花葯內源激素調節、蛋白質轉運、蛋白互作、活性氧積累及花葯的發育。

將cspap-fib導入黃瓜中，使其過表達，得到轉基因後代黃瓜。cspap-fib過表達轉基因植株雌花節率明顯高於對照植株，促使轉基因黃瓜植株具有更高的產量。進而為培育強雌性黃瓜新品種，提供一種新的解決途徑。

附圖說明

圖1為提取的rna的電泳圖；

圖2為菌液pcr檢測結果；

圖3為轉cspap-fib基因抗性植株的pcr檢測；

圖4為cspap-fib亞細胞定位結果。

具體實施方式

本發明技術方案不局限於以下所列舉具體實施方式，還包括各具體實施方式間的任意組合。

具體實施方式一：本實施方式黃瓜雌性相關基因cspap-fib的cdna的核苷酸序列如序列表中seqidno：1所示。

具體實施方式二：本實施方式黃瓜雌性相關基因cspap-fib編碼蛋白的胺基酸序列如序列表中seqidno：2所示。

以下實施例中如無特別說明均為常規方法。

實施例1.trizol法提取黃瓜溫敏型材料『c09-123』的rna

(1)採用trizol法提取黃瓜葉片總rna：取100mg新鮮黃瓜葉片組織，加入液氮充分研磨，將粉末轉入1.5ml無菌離心管中；加入1mltrizol，充分震蕩，15～30℃靜置5min；加入300μl氯仿，劇烈搖蕩15s，12000rpm4℃離心15min；取上清移入新的無菌離心管中，加入等體積預冷的異丙醇，-20℃放置20min，12000rpm4℃下離心15min；棄上清，加入1ml75％depc-乙醇，渦旋洗滌10s，7500rpm4℃離心5min(重複操作2次)；棄乙醇，將離心管導致於乾淨濾紙上晾乾；用30μl1‰depc水溶解，-80℃保存備用。

(2)rna電泳檢測：取1μlrna，使用sma3000紫外分光光度計檢測提取的rna質量與濃度，將檢測合格的rna樣品(rna量≥6μg，濃度≥300ng/μl，2.1≥od260/280≥1.8，od260/230≥1.8)。表明黃瓜『c09-123』的rna提取成功。提取的rna的電泳圖如圖1所示。

實施例2.兩步法反轉錄(toyobo反轉錄試劑盒)

(1)反轉錄體系為：總rna1ml，5×rtbuffer2μl，rtenzymemix0.5μl，primermix0.5μl，nuclease-freewater6μl，total10μl。

(2)反應程序為：37℃溫浴15min，然後98℃加熱5min，冰上放置5min終止反應，即獲得相應的反轉錄產物cdna。

實施例3.熱啟動pcr擴增cspap-fib基因

根據cspap-fib基因中內含子的分布情況，利用引物設計軟體primerpremier5.0設計克隆全長的特異性引物(cspap-fib-f，cspap-fib-r)。引物序列如下：

cspap-fib-f：5′-atggaaattatggaacacaacag-3′

cspap-fib-r：5′-tcaagagatgaaatctagagagtca-3′

(1)pcr克隆反應體系為：10×pcrbuffer2μl(含20mmol·l-1mg2+)，dntps(10mmol·l-1)2μl，上遊引物(20μmol·l-1)0.5μl，下遊引物(20μmol·l-1)0.5μl，taq酶(2u)0.2μl，加ddh2o至20μl。

(2)pcr反應程序為：94℃預變性3min；94℃變性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，35個循環；72℃延伸10min；4℃保存。

擴增後的產物在含有0.5mg/l溴化乙錠(ethidiumbromide)的1％瓊脂糖凝膠上電泳。cspap-fibcdna全長為870bp，其核苷酸序列如序列表中seqidno：1所示。其編碼289個胺基酸，編碼蛋白的胺基酸序列如序列表中seqidno：2所示。

實施例4.pcr擴增產物的回收

使用1％瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下快速切下目的條帶，回收cspap-fib基因的目的片段，具體方法參照北京全式金膠回收試劑盒說明書進行。步驟如下：

切取凝膠：用刀片切取瓊脂糖凝膠中的目的基因條帶，放入已知重量的離心管中，再次稱重，二者之差為切取的凝膠重量，100mg凝膠，視為100μl；溶解凝膠：加入3倍體積gsb，55℃水浴10min，2-3min震蕩1次，至凝膠全部溶解；降至室溫後，轉移到離心柱內，靜置1min後，10000g離心1min，棄掉流出液；清洗dna：加入650μlwb，12000g離心1min，棄掉流出液；再離心2min；洗脫dna：將離心柱置於一個乾淨離心管中，開蓋靜置1min，加入40μl預先預熱(65℃)的eb，靜止1min後10000g離心1min，將洗脫的dna於-20℃保存備用。

實施例5.pcr擴增片段的純化

首先進行瓊脂糖凝膠電泳，分離要純化的片段；用乾淨的無菌手術刀切下目的dna條帶放入預稱重的1.5mleppendorf管；每0.1g瓊脂糖凝膠需加入200μls1溶液；50℃溫育，直至瓊脂糖完全融解；每5μl(不足5μl，以5μl計)dna需加入5μldna結合液(玻璃粉懸液)，輕輕顛倒混勻，冰上放置10min；室溫6000rpm離心20s；棄上清，加700μl乙醇洗液，輕輕抽吸，使玻璃粉懸浮，冰上放置5min；重複上述步驟6000rpm，離心20s；棄上清，小心去除全部殘液；加30-50μlte，輕輕吹打懸浮玻璃粉，50℃溫育10min；室溫6000rpm離心20s，吸上清至新的eppendorf管，於4℃或–20℃保存備用。

實施例6.連接peasy-t3載體與陽性克隆篩選

將cspap-fib基因回收產物與peasy-t3克隆載體進行連接。反應程序16℃16h。

(1)連接反應體系為：回收產物4μl，-t3zerocloningvector1μl，將5μl連接產物全部加入至剛剛解凍的50μltrans1-t1感受態細胞中，冰浴30min；42℃熱激30s，立即置於冰上2min；加1ml液體lb後，200rpm、37℃培養60min；200μl菌液均勻塗板，37℃過夜培養。

(2)酶切反應體系為：buffer1μl，ecori1μl，質粒3μl，ddh2o6μl，總體系10μl。

用槍頭挑取白色單個菌落至液體lb(含有amp)的離心管中，200rpm/min、37℃震蕩培養6h，進行pcr檢驗及ecori酶切驗證。pcr反應體系同cspap-fib基因克隆反應體系，將模板更換為菌液。質粒提取方法參照質粒小量提取試劑盒(em101)說明書(北京全式金生物技術有限公司)進行。將鑑定獲得的cspap-fib基因的陽性菌液，送至蘇州金唯智有限公司進行測序。

實施例7.植物過量表達載體的構建

將上述純化的cspap-fib基因全長序列，分別pcr擴增peasy-t3-cspap-fib質粒，用xcmⅰ單酶切pcxsn-1250載體。t4連接酶連接目的片段與載體，連接產物轉入trans1-t1感受態細胞。通過菌液pcr及測序鑑定出構建成功的pcxsn-cspap-fib過量表達載體。

8.植物表達載體轉化根癌農桿菌lba4404

採用凍融法將pcxsn-cspap-fib質粒轉入到根癌農桿菌lba4404中。

(1)感受態細胞的製備將根癌農桿菌lba4404在yeb培養基(含利福平)上劃線，28℃培養48h；挑取單菌落於yeb液體培養基(含利福平)中，28℃，200r/mim震蕩過夜培養，直至菌液的od600＝0.5；將菌液分裝，冰浴10min；12000rpm離心30s，棄上清，20mm預冷cacl2懸浮，冰浴20min；12000rpm離心30s，棄上清，100μl20mm預冷cacl2重懸，-80℃保存。

(2)表達載體轉化農桿菌eh105：將10μl重組質粒加入到100μl農桿菌感受態細胞中，輕輕混勻後，冰上靜置10min；液氮速凍5min，37℃水浴鍋中熱激2.5min；加入1ml液體yeb培養基，在28℃，200rpm振蕩培養3.5h；6000rpm離心1min，棄上清；重懸菌液，塗在含有50mg/mlkan和50mg/mlrif的yeb固體培養基上，28℃恆溫培養箱中培養36-48h。

(3)陽性克隆的鑑定挑取單菌落並以菌液為模板進行pcr鑑定。將轉化成功的菌液置於-80℃冰箱保存，用於黃瓜遺傳轉化。菌液pcr檢測結果如圖2所示，圖2中m：dnamarker2k；1-2：pcr產物。

實施例9.農桿菌介導的黃瓜遺傳轉化方法

將過量表達載體pcxsn-cspap-fib轉入到溫敏型黃瓜材料『c09-123』中。

(1)種子發芽：將黃瓜種子置於55-65℃水中浸泡1h，去種皮，70％酒精消毒1min，滅菌水清洗1遍，3％的次氯酸鈉消毒10min，滅菌水清洗5遍，平鋪到發芽培養基上，28℃黑暗培養1-2d。

(2)農桿菌的活化：將農桿菌按1:100的比例加入50mlyeb(含rif和kan)液體培養基中，28℃，200rpm震蕩培養36-48h。6000rpm離心10min，棄上清，1/2ms緩衝液重懸，菌液od600＝0.2-0.3。

(3)侵染子葉節：無菌操作臺中，用小刀將黃瓜種子子葉分開，去除全部下胚軸及生長點，置於重懸的菌液中，28℃，200rpm侵染12-15min左右。

(4)子葉節共培養與分化培養：將侵染後的子葉節置於共培養培養基中，28℃黑暗培養1-2d。長出白色斑點時轉入分化培養基中，25℃，光照16h，黑暗8h條件下培養28d左右。

(5)植株生根培養與馴化：在無菌操作臺中，用小刀切下分化芽，移入生根培養基中。5-7d左右進行移栽，注意保溼。置於28/18℃，光照16/8h的光照培養箱中培養。完成馴化後，移栽到溫室中定值。

實施例10.轉基因植株的鑑定

採用ctab法和trizol法分別提取黃瓜葉片dna和rna，進行pcr和qrt-pcr鑑定。轉cspap-fib基因抗性植株的pcr檢測如圖3所示。圖3中m：dna2000mark；y：質粒陽性對照；c：未轉基因對照；w：水對照；1-3：轉正義基因植株檢測；4-6：轉反義基因植株檢測。

實施例11.轉基因黃瓜雌花節率的調查分析

黃瓜雌花節率調查方法：黃瓜植株主蔓上第1朵雌花出現的節位即第1雌花節位雌花率為主蔓上著生雌花節位數佔有花節位數的比例，計算公式為：

雌花節率＝主蔓上有雌花節位總數/主蔓上有花節位數×100％。

表1低夜溫(26℃/12℃晝/夜)條件下雌花節率

表2正常夜溫(26℃/18℃晝/夜)條件下雌花節率

以上結果表明cspap-fib過表達轉基因植株雌花節率明顯高於對照植株，促使轉基因黃瓜植株具有更高的產量。從而提供了一種獲得黃瓜強雌性植株品系的方法。

實施例12.cspap-fib的亞細胞定位

1、擬南芥原生質體提取步驟：

(1)將擬南芥種子播種於ms培養基上，4℃黑暗春化兩天後轉移到光照培養室(22℃，16/8(l/d光強130μlmol.m-2s-1))中培養，7d後，將萌發的擬南芥幼苗移栽到基質土(蛭石：土＝1：2)中生長。當植株長至8～10個葉片時，取材葉片製備原生質體；

(2)剪取中部生長良好的葉片用刀片切成0.5-1mm寬的葉條；

(3)將切好葉條置於預先配置好的纖維素酶解液中，並用鑷子幫助使葉子完全浸入酶解液，25℃，低於8rpm，黑暗條件下酶解至少3個小時；

(4)用w5溶液潤溼35-75um的尼龍膜或60-100目篩子，然後用它過濾含有原生質體的酶解液；將過濾完的原生質細胞轉移至50ml離心管中，100×g離心3min；

(5)棄上清，緩慢加入10ml預冷的w5溶液，重懸原生質細胞；

(6)重複步驟(5)，冰上靜至原生質體30分鐘，期間可以取少量原生質細胞在顯微鏡下觀察，以檢驗細胞的完整性擬南芥葉肉體大小大約30-50μm。

2、質粒轉化擬南芥原生質

(1)將上步檢驗好的擬南芥原生質細胞100×g離心3min，棄上清，儘量去除w5溶液，加入2mlmmg溶液，重懸原生質體，使之最終濃度在2×105個/ml；

(2)cspap-fib-pcambia1302質粒的製備：

cspap-fib質粒製備：

將帶有handiii和bamhi酶切位點的cspap-fib基因片段連接到克隆載體t3(購自北京全式金生物技術有限公司)，得到的連接產物轉化到t1感受態細胞(購自北京全式金生物技術有限公司)，挑斑測序，對完全正確的菌液利用質粒提取試劑盒(easypurehipureplasmidmaxiprepkit購自北京全式金生物技術有限公司)提取得到cspap-fib質粒。

cspap-fib-pcambia1302質粒製備：

分別用handiii和bamhi內切酶(購自neb公司)對cspap-fib質粒和pcambia1302載體質粒(購自北京華越洋生物公司)進行雙酶切。酶切條件為37℃，2h；酶切體系為buffer2μl、handiii1μl、bamhi1μl、質粒16μl。然後跑電泳，分別回收cspap-fib和pcambia1302目的條帶，將兩個回收產物利用t4dna連接酶(購自neb公司)連接，連接條件為16℃，16h；連接體系為buffer1μl、cspap-fib產物4μl、pcambia1302產物4μl、t4連接酶1μl。將連接產物轉化轉化到t1感受態細胞(購自北京全式金生物技術有限公司)，挑斑pcr驗證，對正確的菌樣再次使用質粒提取試劑盒(easypurehipureplasmidmaxiprepkit購自北京全式金生物技術有限公司)提取得到cspap-fib-pcambia1302質粒。

(3)取乾淨的2ml離心管，加入20μl(約30μg)cspap-fib-pcambia1302質粒dna和200μl原生質細胞，輕柔混勻，25℃靜止5min；

(4)加入220μl(等體積)的40％peg4000溶液，輕柔混勻，25℃靜止5min；

(5)加入1ml預冷的w5溶液，輕柔混勻；

(6)重複步驟(5)，加入加入1ml預冷的w5溶液，1％bsa，輕柔混勻，25℃光照培養16h。

(7)雷射共聚焦顯微鏡下觀察融合蛋白表達情況。

cspap-fib亞細胞定位結果如圖4所示，其中bright為明場，gfp為綠色螢光，chlorophy為葉綠素自發螢光，merged為疊加結果，圖中標尺為10μm。由圖4可知cspap-fib基因在葉綠體中表達。

序列表

東北農業大學

黃瓜雌性相關基因cspap-fib及編碼蛋白和應用

4

1

870

cdna

黃瓜（cucumissativusl.）

黃瓜雌性相關基因cspap-fib

1

atggctgctctagccagctctcttcttcagtcttcactccagatccgtacttccgattct60

tcttttgggtctctttttccatctacaatacatcggattgcacccagtttcaacctcaag120

tgttcccgcctccactctctgttttccctcgacggcggacccagaagaattttatctttg180

aaatcggtttcagtcaatgtttacgcggaccctgcgtcggcctctccctctgttgttgac240

gaataccaggccaagtctgagctccttgcatccttgaaggtcaagctactgactgcggtt300

tcagggttaaacagaggtcttgctgctgatgaggatgatttacagaaggcagacgaggct360

gccaaggagattgaagctgttggggggcctgtggacctctcagttgatcttgacaaattg420

caaggaagatggaaattgatatacagcagtgcattctcatctcgtactttaggcggtagt480

agaccaggacctcccacgggaaggctacttcctattactcttggtcaggtgtttcagcga540

atcgacatcatcagtaaagattttgataacattgtagaactcgaactaggtgctccttgg600

cctctacctcctgctgaagtcactgctacattggctcacaagtttgaaatcatagggtct660

gctaagattaaaattatttttgagaaaacgaccgtgaaaacaactgggaacttgtcacag720

cttccaccattagaggtacctcggattccagatgccttgaggcctccgtccaacactgga780

agtggtgaatttgaagtcacttaccttgacaacgatattcgaatcaccagaggagataga840

ggagaactcagggtgtttgttatctcataa870

2

289

prt

黃瓜（cucumissativusl.）

黃瓜雌性相關基因cspap-fib編碼蛋白

2

metalaalaleualaserserleuleuglnserserleuglnile

51015

argthrseraspserserpheglyserleupheproserthrile

202530

hisargilealaproserpheasnleulyscysserargleuhis

354045

serleupheserleuaspglyglyproargargileleuserleu

505560

lysservalservalasnvaltyralaaspproalaseralaser

657075

proservalvalaspglutyrglnalalyssergluleuleuala

808590

serleulysvallysleuleuthralavalserglyleuasnarg

95100105

glyleualaalaaspgluaspaspleuglnlysalaaspgluala

110115120

alalysgluileglualavalglyglyprovalaspleuserval

125130135

aspleuasplysleuglnglyargtrplysleuiletyrserser

140145150

alapheserserargthrleuglyglyserargproglypropro

155160165

thrglyargleuleuproilethrleuglyglnvalpheglnarg

170175180

ileaspileileserlysasppheaspasnilevalgluleuglu

185190195

leuglyalaprotrpproleuproproalagluvalthralathr

200205210

leualahislysphegluileileglyseralalysilelysile

215220225

ilepheglulysthrthrvallysthrthrglyasnleusergln

230235240

leuproproleugluvalproargileproaspalaleuargpro

245250255

proserasnthrglyserglygluphegluvalthrtyrleuasp

260265270

asnaspileargilethrargglyaspargglygluleuargval

275280285

phevalileser

289

3

23

dna

人工序列

引物cspap-fib-f

3

atggaaattatggaacacaacag23

4

25

dna

人工序列

引物cspap-fib-r

4

tcaagagatgaaatctagagagtca25