一種從細莖石斛中鹼提的水溶性中性多糖及其製備方法與流程
2023-06-18 21:21:01 1
本發明涉及中藥材加工技術領域，尤其涉及一種從細莖石斛中鹼提的水溶性多糖及其製備方法。
背景技術：
石斛為傳統名貴中草藥，其化學成分和藥理活性引人矚目。目前，石斛屬植物化學成分的研究主要以低極性的小分子為主，石斛多糖由於組成複雜、結構相似，其分離純化和結構鑑定較為困難，研究起步較晚，研究成果也少。近年來，由於現代分析技術的發展，石斛多糖的研究由於其獨特的藥理特性，逐漸引起人們的重視。細莖石斛是傳統藥用石斛的主要來源植物，具有抗腫瘤、降血脂的功效。多糖在石斛中的含量較高，一般含量為10～20wt％，但是含有的多糖種類非常多，據報導，石斛中多糖種類超過二十種以上，且酸性多糖含量較多。石斛中多糖的抗腫瘤、降血脂功效究竟是由哪一種多糖，還是多種多糖共同作用的結果，還一直是目前研究的前沿課題。因此，提取純化得到一種多糖，闡述其結構及其功效，對石斛多糖應用於醫藥保健領域非常重要。
目前國內外文獻中對細莖石斛多糖的研究僅限於熱水提取的多糖，對其他石斛多糖的研究也主要限於石斛多糖混合物的提取及總多糖功效的研究，對石斛中某一純多糖的提取純化、結構及其功效的則很少涉及。
技術實現要素：
有鑑於此，本發明的目的在於克服現有技術的不足，提供一種具有高效降血糖作用的高純度細莖石斛水溶性中性多糖以及該多糖的製備方法。
為了解決上述技術問題，本發明採用如下方案實現：
一種從細莖石斛中鹼提的水溶性中性多糖，所述水溶性多糖的重均分子量為0.9～1.2萬，由葡萄糖殘基、半乳糖殘基、木糖殘基、甘露糖殘基和阿拉伯糖殘基連結組成；其主鏈由β-(1→3)-d-、β-(1→4)-d-葡萄糖殘基和β-(1→3)-d-、β-(1→4)-d-半乳糖殘基組成，支鏈由甘露糖殘基和阿拉伯糖殘基組成，高度支化，且含有10～20wt％末端木糖殘基。
所述水溶性中性多糖的重複結構單元結構如下：
上述水溶性多糖的製備方法如下：
s1：將乾燥的細莖石斛粉碎並脫脂；
s2：將脫脂後的細莖石斛粉碎物置於生理鹽水中高溫浸泡，後分離出殘渣；
s3：將步驟s2得到的殘渣置於鹼液中處理，後離心收集上清液；
s4：將上清液中和至中性，並依次經過脫色、脫蛋白、透析和濃縮得粗多糖水溶液；
s5：將粗多糖水溶液進行離子交換處理，收集蒸餾水級份，依次經過濃縮、冷凍乾燥得水溶性中性多糖。
步驟s1中，乾燥的細莖石斛粉碎後，採用有機溶劑通過索氏提取去除脂肪。優選的，所述有機溶劑為乙酸乙酯和丙酮，乾燥的細莖石斛粉碎後，依次用乙酸乙酯、丙酮通過索氏提取去除脂肪。
步驟s2中，脫脂後的細莖石斛粉碎物置於111～131℃的生理鹽水中高溫浸泡15～45min。分離出的殘渣置於生理鹽水中高溫浸泡並分離，重複操作3～5次。
步驟s3中，所述鹼液為1～2m的naoh水溶液，所述naoh水溶液中含有0.4～0.7wt％的nabh4。殘渣置於鹼液中於室溫條件下攪拌2～4h。
步驟s4中，所述上清液用醋酸中和至中性。
步驟s5中，所述的離子交換處理為將粗多糖水溶液過deae纖維素離子交換柱。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：本申請提供了一種能製備出高純度的水溶性中性多糖的方法。該多糖的主鏈由β-(1→3)-d-、β-(1→4)-d-葡萄糖殘基和β-(1→3)-d-、β-(1→4)-d-半乳糖殘基組成，支鏈由甘露糖殘基和阿拉伯糖殘基組成，高度支化，且含有10～20wt％末端木糖殘基，具有顯著的降血糖作用。
附圖說明
圖1為實施例1多糖dmp-1的紅外光譜圖；
圖2為實施例1多糖dmp-1單糖組分的氣相色譜圖。
具體實施方式
為了讓本領域的技術人員更好地理解本發明的技術方案，下面結合附圖對本發明作進一步闡述。
實施例1
一種從細莖石斛中鹼提的水溶性中性多糖的製備方法，包括如下步驟：
s1：購買滇產細莖石斛，曬乾粉碎後以依次用乙酸乙酯和丙酮通過索氏提取回流4h脫脂；
s2：將脫脂後的細莖石斛粉碎物乾燥後浸泡在0.9％的nacl水溶液中，在121℃高溫條件下浸泡30min，分離出殘渣，該殘渣繼續浸泡在0.9％的nacl水溶液中，在121℃高溫條件下浸泡30min，重複操作三次；
s3：將步驟s2得到的殘渣置於1mnaoh的水溶液(含0.5wt％nabh4)中，室溫攪拌2h，後離心收集上清液；
s4：上清液使用醋酸中和至中性；用30wt％h2o2脫色至淺黃色，離心得到淺黃色澄清溶液；該溶液用sevag法除去游離的蛋白質，將氯仿和正丁醇混合液(體積比為5:1)與多糖溶液混合，劇烈攪拌30min，用分液漏鬥靜置分層除去變性蛋白質，反覆進行5次；然後分別用自來水、蒸餾水經再生纖維素膜透析袋(mwcut-off3500,usa)透析4天和3天，然後45℃真空旋轉蒸發濃縮，得到粗多糖水溶液；此粗多糖水溶液包含各種酸性多糖和所需的中性多糖；
s5：將粗多糖水溶液離心過濾得到澄清溶液後，加入deae纖維素離子交換柱中，通過在deae纖維素陰離子樹脂上的吸附差別，用蒸餾水作為流動相，收集蒸餾水級份，其中含所需的中性多糖，最後濃縮、冷凍乾燥得到水溶性中性多糖純品dmp-1。
通過尺寸排除色譜(sec)、元素分析、紅外光譜(ir)、單糖組成氣相色譜(gc)、甲基化分析表明，該細莖石斛多糖dmp-1是一種多糖純品，純度高於96％，具有高度分支結構的雜多糖，由葡萄糖殘基、半乳糖殘基、木糖殘基、甘露糖殘基和阿拉伯糖殘基連結組成，該多糖的主鏈由β-(1→3)-d-、β-(1→4)-d-葡萄糖殘基和β-(1→3)-d-、β-(1→4)-d-半乳糖殘基組成，支鏈由甘露糖殘基和阿拉伯糖殘基組成，高度支化，且含有12.5wt％末端木糖殘基。該細莖石斛多糖dmp-1可溶解於水和二甲基亞碸(dmso)，不溶解於甲醇、乙醇和丙酮。
該水溶性中性多糖的重複結構單元結構如下：
圖1示出細莖石斛多糖dmp-1紅外光譜(ir)，在1700cm-1處無吸收峰，說明dmp-1中不含糖醛酸，為一種中性多糖。該多糖dmp-1的元素分析結果見附表1，c：h：o約等於1：2：1，未含n元素，表明該多糖dmp-1未含蛋白質，其元素含量與多糖結構一致。將dmp-1強酸水解為單糖後，再乙醯化，然後進行氣相色譜分析(見圖2)，可得到該多糖的單糖組成，多糖dmp-1由葡萄糖殘基、半乳糖殘基、木糖殘基、甘露糖殘基和阿拉伯糖殘基連結組成，其摩爾比為0.474：0.296：0.146：0.068：0.016。將dmp-1完全甲基化後，再乙醯化，然後進行氣相色譜-質譜聯用(gc-ms)分析(見附表2)，可得到dmp-1的單糖鍵接方式。dmp-1的gc-ms結果表明該多糖dmp-1為一種高度支化的多糖，其主鏈主要由β-(1→3)-d-、β-(1→4)-d-葡萄糖殘基和β-(1→3)-d-、β-(1→4)-d-半乳糖殘基組成，支鏈由甘露糖殘基和阿拉伯糖殘基組成，含有12.5wt％末端木糖殘基。該多糖dmp-1通過雷射光散射-尺寸排除色譜(lls-sec)測試結果表明，其重均分子量為1.01萬。
附表1.細莖石斛多糖dmp-1元素分析結果
附表2.細莖石斛多糖dmp-1單糖組成及鍵接方式結果
細莖石斛多糖dmp-1的降血糖作用：將caco-2細胞接種於96孔板，3天後，換成含100μg/ml多糖dmp-1樣品、5mm葡萄糖的pbs溶液，4h後取pbs上清液，測定pbs中剩餘的葡萄糖濃度。結果顯示：空白對照組未被吸收的葡萄糖光密度為0.052，多糖dmp-1組未被吸收的葡萄糖光密度為0.060，高於空白對照組，說明多糖dmp-1可以減緩caco-2腸道上皮細胞對葡萄糖的吸收。
將細莖石斛多糖dmp-1以50mg/kg劑量口服灌胃給c57bl/6小鼠，1小時後進行口服糖耐量實驗。結果顯示：1小時後，空白對照組中小鼠血液中葡萄糖含量為12mmol/l，多糖dmp-1組中小鼠血液中葡萄糖含量僅為8mmol/l，說明多糖dmp-1可以降低口服糖耐量實驗中的血糖水平，即可以降低餐後血糖。
實施例2
一種從細莖石斛中鹼提的水溶性中性多糖的製備方法，包括如下步驟：
s1：購買滇產細莖石斛，曬乾粉碎後以依次用乙酸乙酯和丙酮通過索氏提取回流4h脫脂；
s2：將脫脂後的細莖石斛粉碎物乾燥後浸泡在0.9％的nacl水溶液中，在111℃高溫條件下浸泡45min，分離出殘渣，該殘渣繼續浸泡在0.9wt％的nacl水溶液中，在111℃高溫條件下浸泡45min，重複操作五次；
s3：將步驟s2得到的殘渣置於1mnaoh的水溶液(含0.4wt％nabh4)中，室溫攪拌4h，後離心收集上清液；
s4：上清液使用醋酸中和至中性；用30wt％h2o2脫色至淺黃色，離心得到淺黃色澄清溶液；該溶液用sevag法除去游離的蛋白質，將氯仿和正丁醇混合液(體積比為5:1)與多糖溶液混合，劇烈攪拌60min，用分液漏鬥靜置分層除去變性蛋白質，反覆進行5次；然後分別用自來水、蒸餾水經再生纖維素膜透析袋(mwcut-off3500,usa)透析4天和3天，然後45℃真空旋轉蒸發濃縮，得到粗多糖水溶液；此粗多糖水溶液包含各種酸性多糖和所需的中性多糖；
s5：將粗多糖水溶液離心過濾得到澄清溶液後，加入deae纖維素離子交換柱中，通過在deae纖維素陰離子樹脂上的吸附差別，用蒸餾水作為流動相，收集蒸餾水級份，其中含所需的中性多糖，最後濃縮、冷凍乾燥得到水溶性中性多糖純品dmp-2。
通過尺寸排除色譜(sec)、元素分析、紅外光譜(ir)、單糖組成氣相色譜(gc)、甲基化分析表明，該細莖石斛多糖dmp-2是一種多糖純品，純度高於95％，具有高度分支結構的雜多糖，由葡萄糖殘基、半乳糖殘基、木糖殘基、甘露糖殘基和阿拉伯糖殘基連結組成，該多糖的主鏈由β-(1→3)-d-、β-(1→4)-d-葡萄糖殘基和β-(1→3)-d-、β-(1→4)-d-半乳糖殘基組成，支鏈由甘露糖殘基和阿拉伯糖殘基組成，高度支化，且含有13.0wt％末端木糖殘基。該細莖石斛多糖dmp-2可溶解於水和二甲基亞碸(dmso)，不溶解於甲醇、乙醇和丙酮。
該水溶性中性多糖的重複結構單元結構如下：
多糖dmp-2的元素分析結果見附表3，結果表明c：h：o約等於1：2：1，未含n元素，表明該多糖dmp-2未含蛋白質，其元素含量與多糖結構一致。將多糖dmp-2完全甲基化後，再乙醯化，然後進行氣相色譜-質譜聯用(gc-ms)分析(見附表4)，可得到dmp-2的單糖鍵接方式。dmp-2的gc-ms結果表明，該多糖dmp-2為一種高度支化的多糖，其主鏈主要由β-(1→3)-d-、β-(1→4)-d-葡萄糖殘基和β-(1→3)-d-、β-(1→4)-d-半乳糖殘基組成，支鏈由甘露糖殘基和阿拉伯糖殘基組成，含有13.0wt％末端木糖殘基。該多糖dmp-2通過雷射光散射-尺寸排除色譜(lls-sec)測試結果表明，其重均分子量為1.12萬。
附表3.細莖石斛多糖dmp-2元素分析結果
附表4.細莖石斛多糖dmp-2單糖組成及鍵接方式結果
細莖石斛多糖dmp-2的降血糖作用：將caco-2細胞接種於96孔板，3天後，換成含200μg/ml多糖dmp-2樣品、5mm葡萄糖的pbs溶液，4h後取pbs上清液，測定pbs中剩餘的葡萄糖濃度。結果顯示：空白對照組未被吸收的葡萄糖光密度為0.052，多糖dmp-2組未被吸收的葡萄糖光密度為0.065，高於空白對照組，說明多糖dmp-2可以減緩caco-2腸道上皮細胞對葡萄糖的吸收。
將細莖石斛多糖dmp-2以100mg/kg劑量口服灌胃給c57bl/6小鼠，1小時後進行口服糖耐量實驗。結果顯示：1小時後，空白對照組中小鼠血液中葡萄糖含量為12mmol/l，多糖dmp-2組中小鼠血液中葡萄糖含量僅為6mmol/l，說明多糖dmp-2可以降低口服糖耐量實驗中的血糖水平，即可以降低餐後血糖。
實施例3
一種從細莖石斛中鹼提的水溶性中性多糖的製備方法，包括如下步驟：
s1：購買滇產細莖石斛，曬乾粉碎後以依次用乙酸乙酯和丙酮通過索氏提取回流4h脫脂；
s2：將脫脂後的細莖石斛粉碎物乾燥後浸泡在0.9wt％的nacl水溶液中，在131℃高溫條件下浸泡15min，分離出殘渣，該殘渣繼續浸泡在0.9wt％的nacl水溶液中，在131℃高溫條件下浸泡15min，重複操作三次；
s3：將步驟s2得到的殘渣置於2mnaoh的水溶液(含0.7wt％nabh4)中，室溫攪拌2h，後離心收集上清液；
s4：上清液使用醋酸中和至中性；用30wt％h2o2脫色至淺黃色，離心得到淺黃色澄清溶液；該溶液用sevag法除去游離的蛋白質，將氯仿和正丁醇混合液(體積比為5:1)與多糖溶液混合，劇烈攪拌60min，用分液漏鬥靜置分層除去變性蛋白質，反覆進行5次；然後分別用自來水、蒸餾水經再生纖維素膜透析袋(mwcut-off3500,usa)透析4天和3天，然後45℃真空旋轉蒸發濃縮，得到粗多糖水溶液；此粗多糖水溶液包含各種酸性多糖和所需的中性多糖；
s5：將粗多糖水溶液離心過濾得到澄清溶液後，加入deae纖維素離子交換柱中，通過在deae纖維素陰離子樹脂上的吸附差別，用蒸餾水作為流動相，收集蒸餾水級份，其中含所需的中性多糖，最後濃縮、冷凍乾燥得到水溶性中性多糖純品dmp-3。
通過尺寸排除色譜(sec)、元素分析、紅外光譜(ir)、單糖組成氣相色譜(gc)、甲基化分析表明，該細莖石斛多糖dmp-3是一種多糖純品，純度高於96％，具有高度分支結構的雜多糖，由葡萄糖殘基、半乳糖殘基、木糖殘基、甘露糖殘基和阿拉伯糖殘基連結組成，該多糖的主鏈由β-(1→3)-d-、β-(1→4)-d-葡萄糖殘基和β-(1→3)-d-、β-(1→4)-d-半乳糖殘基組成，支鏈由甘露糖殘基和阿拉伯糖殘基組成，高度支化，且含有13.8wt％末端木糖殘基。該細莖石斛多糖dmp-3可溶解於水和二甲基亞碸(dmso)，不溶解於甲醇、乙醇和丙酮。
該水溶性中性多糖的重複結構單元結構如下：
多糖dmp-3的元素分析結果見附表5，結果表明c：h：o約等於1：2：1，未含n元素，表明該多糖dmp-3未含蛋白質，其元素含量與多糖結構一致。將多糖dmp-3完全甲基化後，再乙醯化，然後進行氣相色譜-質譜聯用(gc-ms)分析(見附表6)，可得到dmp-3的單糖鍵接方式。dmp-3的gc-ms結果表明，該多糖dmp-3為一種高度支化的多糖，其主鏈主要由β-(1→3)-d-、β-(1→4)-d-葡萄糖殘基和β-(1→3)-d-、β-(1→4)-d-半乳糖殘基組成，支鏈由甘露糖殘基和阿拉伯糖殘基組成，含有13.8wt％末端木糖殘基。該多糖dmp-3通過雷射光散射-尺寸排除色譜(lls-sec)測試結果表明，其重均分子量為0.92萬。
附表5.細莖石斛多糖dmp-3元素分析結果
附表6.細莖石斛多糖dmp-3單糖組成及鍵接方式結果
細莖石斛多糖dmp-3的降血糖作用：將caco-2細胞接種於96孔板，3天後，換成含150μg/ml多糖dmp-3樣品、5mm葡萄糖的pbs溶液，4h後取pbs上清液，測定pbs中剩餘的葡萄糖濃度。結果顯示：空白對照組未被吸收的葡萄糖光密度為0.052，多糖dmp-3組未被吸收的葡萄糖光密度為0.062，高於空白對照組，說明多糖dmp-3可以減緩caco-2腸道上皮細胞對葡萄糖的吸收。
將細莖石斛多糖dmp-3以80mg/kg劑量口服灌胃給c57bl/6小鼠，1小時後進行口服糖耐量實驗。結果顯示：1小時後，空白對照組中小鼠血液中葡萄糖含量為12mmol/l，多糖dmp-3組中小鼠血液中葡萄糖含量僅為7mmol/l，說明多糖dmp-3可以降低口服糖耐量實驗中的血糖水平，即可以降低餐後血糖。
對比例1
一種細莖石斛多糖的製備方法，包括如下步驟：
s1：購買滇產細莖石斛，曬乾粉碎後以依次用乙酸乙酯和丙酮通過索氏提取回流4h脫脂；
s2：將脫脂後的細莖石斛粉碎物乾燥後置於1mnaoh的水溶液(含0.5wt％nabh4)中，室溫攪拌2h，後離心收集上清液；
s3：上清液使用醋酸中和至中性；用30wt％h2o2脫色至淺黃色，離心得到淺黃色澄清溶液；該溶液用sevag法除去游離的蛋白質，將氯仿和正丁醇混合液(體積比為氯仿：正丁醇＝5:1)與多糖溶液混合，劇烈攪拌30min，用分液漏鬥靜置分層除去變性蛋白質，反覆進行5次；然後分別用自來水、蒸餾水經再生纖維素膜透析袋(mwcut-off3500,usa)透析4天和3天，然後45℃真空旋轉蒸發濃縮，得到粗多糖水溶液；
s4：將粗多糖水溶液離心過濾得到澄清溶液後，加入deae纖維素離子交換柱中，通過在deae纖維素陰離子樹脂上的吸附差別，用蒸餾水作為流動相，收集蒸餾水級份，最後濃縮、冷凍乾燥得到多糖dmp-4。
通過尺寸排除色譜(sec)對多糖dmp-4進行純度分析，結果表明多糖dmp-4為一種多糖混合物，由多種多糖組成，其平均分子量為5.2萬。由於該多糖dmp-4為多種多糖的混合物，無法分析其結構，無法確定哪一種多糖有降血糖作用。
對比例2
本對比例與實施例1類似，區別在於，鹼液中不含nabh4，製備的多糖為dmp-5。
通過尺寸排除色譜(sec)、元素分析、紅外光譜(ir)、單糖組成氣相色譜(gc)、甲基化分析表明，該多糖dmp-5結構與降血糖作用與多糖dmp-1基本相同，但此法得到的多糖dmp-5產率只有實施例1中多糖dmp-1產率的60％，表明鹼液中不含nabh4會氧化中性多糖，降低產率。
上述實施例僅為本發明的其中具體實現方式，其描述較為具體和詳細，但並不能因此而理解為對本發明專利範圍的限制。應當指出的是，對於本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些顯而易見的替換形式均屬於本發明的保護範圍。