一種鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗的製作方法

2023-06-18 10:47:56

專利名稱：一種鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗。
背景技術：
鴨病毒性肝炎簡稱鴨肝炎，是由鴨病毒性肝炎病毒引起的一種以肝臟呈現出血性炎症為特徵的急性烈性傳染病。病鴨和帶毒鴨是主要傳染源，主要通過消化道和呼吸道感染。飼養管理不良，缺乏維生素和礦物質，鴨舍潮溼、擁擠，均可促使鴨病毒性肝炎發生。鴨病毒性肝炎一旦發生，在鴨群中傳播很快，發病率可達100%。鴨病毒性肝炎潛伏期I 4天，突然發病，病程短促。病初精神萎靡，不食，行動呆滯，縮頸，翅下垂，眼半閉呈昏迷狀態，有的出現腹瀉。不久，病鴨出現神經症狀，不安，運動失調，身體倒向一側，兩腳發生痙攣，數小時後死亡。死前頭向後彎，呈角弓反張姿勢。剖析 可見特徵性病變在肝臟。肝腫大，呈黃紅色或花斑狀，表面有出血點和出血斑，膽囊腫大，充滿膽汁。脾臟有時腫大，外觀也類似肝臟的花斑。多數腎臟充血、腫脹。心肌如煮熟狀。有些病例有心包炎、氣囊中有微黃色滲出液和纖維素絮片。在我國同時流行由I型鴨肝炎病毒和新型鴨肝炎病毒引起的雛鴨病毒性肝炎。現有的鴨病毒性肝炎疫苗為I型鴨病毒性肝炎弱毒活疫苗，主要通過如下方法製備將鴨肝炎病毒弱毒株接種雞胚，收集胚液，加入保護劑後凍幹。使用時，用生理鹽水稀釋，採用肌肉注射成鴨或雛鴨。弱毒活疫苗存在如下問題(I)保存和運輸需-20°C低溫條件，不方便；(2)免疫鴨後，疫苗病毒在體內存活時間長、易排毒，且病毒對環境抵抗力強、易毒力返強；(3)疫苗的免疫效果不穩定，易受母源抗體幹擾，造成免疫失敗。

發明內容
本發明的目的是提供一種鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗。本發明提供了一種用於製備鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗的滅活病毒液混合液，由滅活的鴨肝炎病毒YB3株病毒液和滅活的鴨肝炎病毒GD株病毒液組成。製備所述滅活病毒液混合液時，所述鴨肝炎病毒YB3株和所述鴨肝炎病毒GD株的
病毒劑量相等。每O. 2mL鴨肝炎病毒YB3株病毒液的病毒含量> 106· 5DELD5(i。每O. 2mL鴨肝炎病毒⑶株病毒液的病毒含量> IO6' 5DELD50O所述滅活的鴨肝炎病毒YB3株病毒液和所述滅活的鴨肝炎病毒GD株病毒液具體可等體積混合。所述滅活的鴨肝炎病毒YB3株病毒液的製備方法如下在鴨肝炎病毒YB3株病毒液中加入甲醛溶液，孵育後得到滅活的鴨肝炎病毒YB3株病毒液。所述孵育的具體條件可為37°C、24小時。所述滅活的鴨肝炎病毒YB3株病毒液的製備方法具體如下在IOOml鴨肝炎病毒YB3株病毒液中加入O. 2ml甲醛水溶液(甲醛水溶液中甲醛的體積百分含量為37-40%)，37°C孵育24小時，得到滅活的鴨肝炎病毒YB3株病毒液。
所述滅活的鴨肝炎病毒GD株病毒液的製備方法如下在鴨肝炎病毒GD株病毒液中加入甲醛溶液，孵育後得到滅活的鴨肝炎病毒GD株病毒液。所述孵育的具體條件可為37°C、24小時。所述滅活的鴨肝炎病毒GD株病毒液的製備方法具體如下在IOOml鴨肝炎病毒GD株病毒液中加入O. 2ml甲醛水溶液(甲醛水溶液中甲醛的體積百分含量為37-40%)，37°C孵育24小時，得到滅活的鴨肝炎病毒GD株病毒液。本發明還保護一種鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗，由抗原和礦物油佐劑組成；所述抗原由以上任一所述的滅活病毒液混合液和吐溫-80組成；所述礦物油佐劑由白油、硬脂酸鋁和司本-80組成。製備所述鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗時，所述抗原與所述礦物油佐劑的體積比具體可為I: I. 5。 所述抗原中，所述滅活病毒液混合液和吐溫-80的體積比具體可為96:4。所述礦物油佐劑的製備方法具體包括如下步驟在92. 5ml白油中加入I. 5g硬脂酸招，加熱使之完全溶解，然後加入6ml司本-80。本發明還保護鴨肝炎病毒YB3株和鴨肝炎病毒GD株在製備鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗中的應用。本發明還保護以上任一所述的滅活病毒液混合液在製備鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗中的應用。本發明提供的鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗具有如下優點(1)同時對I型鴨肝炎病毒和新型鴨肝炎病毒具有預防作用；(2)使用滅活病毒製成，安全性好；(3)保存、運輸(2-8°C條件)和使用方便(不需稀釋)；(3)免疫效果穩定。
具體實施例方式以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，結果取平均值。如無特殊說明，所用鴨品種均為金定麻鴨購自廣東省陽西縣綠環生態養殖場。鴨肝炎病毒YB3株(屬於I型鴨肝炎病毒)公眾可從中國獸醫藥品監察所或廣東永順生物製藥股份有限公司獲得；參考文獻袁率珍，範書才，李虹，等.鴨肝炎病毒分子流行病學分析[J]·中國預防獸醫學報，2010，32(11):849-853.。鴨肝炎病毒GD株(屬於新型鴨肝炎病毒):公眾可從中國獸醫藥品監察所或廣東永順生物製藥股份有限公司獲得；參考文獻範書才，李虹，袁率珍，等.新型鴨肝炎病毒的分離鑑定[J].中國預防獸醫學報，2009，31 (10) :770-775.。鴨肝炎病毒PLK株(屬於I型鴨肝炎病毒)公眾可從中國獸醫藥品監察所或廣東永順生物製藥股份有限公司獲得；參考文獻範書才，李虹，袁率珍，等.新型鴨肝炎病毒的分離鑑定[J]·中國預防獸醫學報，2009，31 (10) :770-775.。實施例I、鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗的製備一、抗原的製備I、製備病毒液
將鴨肝炎病毒YB3株經尿囊腔接種13日齡易感鴨胚，每胚O. 2mL, 37°C孵育96小時，然後無菌收集胚液和胎兒，高速勻漿(14000r/min)，然後用60目滅菌銅網過濾，收集濾液，-40°C凍融一次，得到YB3株病毒液，每O. 2mL YB3株病毒液的病毒含量=106_ 5DELD5tl (鴨胚半數致死劑量)。實際應用中每O. 2mL病毒液的病毒含量> IO6 5DELD5tl均可。將鴨肝炎病毒⑶株經尿囊腔接種13日齡易感鴨胚，每胚O. 2mL，37°C孵育96小時，然後無菌收集胚液和胎兒，高速勻漿(14000r/min)，然後用60目滅菌銅網過濾，收集濾液，-40°C凍融一次，得到⑶株病毒 液。每O. 2mL⑶株病毒液的病毒含量=106_ 5DELD5tl (鴨胚半數致死劑量)。實際應用中每O. 2mL病毒液的病毒含量> IO6 5DELD5tl均可。2、滅活在IOOml步驟I得到的YB3株病毒液中加入O. 2ml甲醛溶液(商售的甲醛溶液中甲醛的體積百分含量為37-40%)，37°C孵育24小時，得到滅活後的YB3株病毒液。在IOOml步驟I得到的⑶株病毒液中加入O. 2ml甲醛溶液(商售的甲醛溶液中甲醛的體積百分含量為37-40%)，37°C孵育24小時，得到滅活後的⑶株病毒液。3、抗原的製備將步驟2得到的滅活後的YB3株病毒液和滅活後的GD株病毒液等體積混合，得到混合病毒液。在96mL混合病毒液中加入4ml滅菌後的吐溫-80，充分溶解，得到抗原。二、礦物油佐劑的製備在92. 5ml白油中加入I. 5g硬脂酸鋁，加熱使之完全溶解，然後加入6ml司本-80，121°C高壓滅菌30分鐘，得到礦物油佐劑。三、鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗的製備將I體積份步驟一得到的抗原和I. 5體積份步驟二得到的礦物油佐劑採用乳化剪切機乳化，得到鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗(油包水型油乳劑滅活疫苗)。每次製備的鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗即為一個批次。實施例2、鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗的安全性取3個批次的鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗，分別對10日齡、3月齡、6月齡和12月齡的麻鴨進行單次使用劑量注射(每隻注射I. 0ml)。取3個批次的鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗，分別對10日齡、3月齡、6月齡和12月齡的麻鴨進行單次超劑量注射(每隻注射2. 0ml)。取3個批次的鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗，分別對10日齡、3月齡、6月齡和12月齡的麻鴨進行單劑量重複注射(第一次注射21天後進行第二次注射，每次每隻注射I. Oml )。結果均安全，無明顯的局部和全身反應。實施例3、鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗的效力一、抗體效價取3個批次的鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗，每一批次疫苗對5隻3月齡金定麻鴨進行單次免疫(每隻注射I. Oml), 21天後檢測血清中和抗體效價，對鴨肝炎病毒YB3株(病毒滴度為200 DELD5(l/0. 2ml)的中和抗體效價均彡1:24，對鴨肝炎病毒⑶株(病毒滴度為200 DELD50/0. 2ml)的中和抗體效價均彡1:24。取3個批次的鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗，每一批次疫苗對5隻6月齡金定麻鴨進行單次免疫(每隻注射I. Oml), 21天後檢測血清中和抗體效價，對鴨肝炎病毒YB3株(病毒滴度為200 DELD5(l/0. 2ml)的中和抗體效價均彡1:24，對鴨肝炎病毒⑶株(病毒滴度為200 DELD50/0. 2ml)的中和抗體效價均彡1:24。取3個批次的鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗，每一批次疫苗對5隻12月齡金定麻鴨進行單次免疫(每隻注射I. Oml), 21天後檢測血清中和抗體效價，對鴨肝炎病毒YB3株(病毒滴度為200 DELD5(l/0. 2ml)的中和抗體效價均彡1:24，對鴨肝炎病毒⑶株(病毒滴度為200 DELD50/0. 2ml)的中和抗體效價均彡1:24。取3個批次的鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗，每一批次疫苗對5隻3月齡金定麻鴨進行免疫(第一次免疫21天後進行第二次免疫,每次每隻注射I. Oml),第二次免疫14天後檢測血清中和抗體效價，對鴨肝炎病毒YB3株(病毒滴度為200 DELD50/0. 2ml)的中和抗體效價均彡I 152，對鴨肝炎病毒⑶株(病毒滴度為200 DELD5tlA). 2ml)的中和抗體效價均^ 1:152。取3個批次的鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗，每一批次疫苗對5隻6月齡金定麻鴨 進行免疫(第一次免疫21天後進行第二次免疫,每次每隻注射I. Oml),第二次免疫14天後檢測血清中和抗體效價，對鴨肝炎病毒YB3株(病毒滴度為200 DELD50/0. 2ml)的中和抗體效價均彡I 152，對鴨肝炎病毒⑶株(病毒滴度為200 DELD5tlA). 2ml)的中和抗體效價均^ 1:152。取3個批次的鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗，每一批次疫苗對5隻12月齡金定麻鴨進行免疫(第一次免疫21天後進行第二次免疫,每次每隻注射I. Oml),第二次免疫14天後檢測血清中和抗體效價，對鴨肝炎病毒YB3株(病毒滴度為200 DELD50/0. 2ml)的中和抗體效價均彡I 152，對鴨肝炎病毒⑶株(病毒滴度為200 DELD5tlA). 2ml)的中和抗體效價均^ 1:152。二、攻毒試驗(後代雛鴨被動保護)將4月齡金定麻鴨(產蛋種)分為2組，每組40隻，分別進行如下處理第一組皮下注射實施例I製備的鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗，第一次免疫21天後進行第二次免疫，每次每隻注射I. Oml ；第二組(對照組):皮下注射生理鹽水，第一次免疫21天後進行第二次免疫，每次每隻注射1.0ml。第二次免疫後第21至28天收集各組鴨所產鴨蛋(每組隨機選取100個)，進行孵育。分別於雛鴨出殼4天後、9天後、16天後和21天後各隨機取20隻雛鴨，其中10隻肌肉注射鴨肝炎病毒PLK株、另10隻注射鴨肝炎病毒GD株，每隻攻毒劑量均為IOOLD5tlt5每天觀察，攻毒後第14天統計攻毒保護率(即未死亡的只數佔總只數的百分率)。結果表明，雛鴨的被動保護期為21天，用實施例I製備的疫苗免疫種鴨後，雛鴨出殼第4至21天的攻毒保護率均為80%以上。用生理鹽水免疫種鴨後，雛鴨在各個時期的攻毒保護率均為0%。三、種鴨免疫持續期試驗將4月齡金定麻鴨(產蛋種)分為2組，每組120隻，分別進行如下處理第一組皮下注射實施例I製備的鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗，第一次免疫21天後進行第二次免疫，每次每隻注射I. Oml ；第二組(對照組):皮下注射生理鹽水，第一次免疫21天後進行第二次免疫，每次每隻注射1.0ml。分別於第二次免疫後I個月、2個月、3個月、4個月、5個月和6個月，隨機取第一組的10隻只鴨、第二組的5隻鴨，採血、分離血清並分別測定血清中的I型和新型鴨肝炎病毒中和抗體效價。用實施例I製備的疫苗第二次免疫種鴨後1-5個月，第一組所有待檢鴨血清對 鴨肝炎病毒YB3株的中和抗體效價均> 1:152，對鴨肝炎病毒GD株的中和抗體效價均^ 1:152,疫苗對種鴨的免疫持續期為5個月。第二組所有待檢鴨血清對鴨肝炎病毒YB3株(病毒滴度為200 DELD50/0. 2ml)的中和抗體效價均< 1:4，對鴨肝炎病毒⑶株(病毒滴度為200 DELD50/0. 2ml)的中和抗體效價均< 1:4。
權利要求
1.用於製備鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗的滅活病毒液混合液，由滅活的鴨肝炎病毒YB3株病毒液和滅活的鴨肝炎病毒GD株病毒液組成。
2.如權利要求I所述的方法，其特徵在於製備所述滅活病毒液混合液時，所述鴨肝炎病毒YB3株和所述鴨肝炎病毒GD株的病毒劑量相等。
3.如權利要求I或2所述的方法，其特徵在於 所述滅活的鴨肝炎病毒YB3株病毒液的製備方法如下在鴨肝炎病毒YB3株病毒液中加入甲醛溶液，孵育後得到滅活的鴨肝炎病毒YB3株病毒液； 所述滅活的鴨肝炎病毒GD株病毒液的製備方法如下在鴨肝炎病毒GD株病毒液中加入甲醛溶液，孵育後得到滅活的鴨肝炎病毒GD株病毒液。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於所述滅活的鴨肝炎病毒YB3株病毒液的製備方法中，所述孵育的條件為37°C、24小時；所述滅活的鴨肝炎病毒GD株病毒液的製備方法中，所述孵育的條件為37°C、24小時。
5.—種鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗，由抗原和礦物油佐劑組成；所述抗原由權利要求I至4中任一所述的滅活病毒液混合液和吐溫-80組成；所述礦物油佐劑由白油、硬脂酸鋁和司本-80組成。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於製備所述鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗時，所述抗原與所述礦物油佐劑的體積比為1:1.5。
7.如權利要求5或6所述的方法，其特徵在於所述抗原中，所述滅活病毒液混合液和吐溫-80的體積比為96:4。
8.如權利要求5至7中任一所述的方法，其特徵在於所述礦物油佐劑的製備方法包括如下步驟在92. 5ml白油中加入I. 5g硬脂酸鋁，加熱使之完全溶解，然後加入6ml司本-80。
9.鴨肝炎病毒YB3株和鴨肝炎病毒GD株在製備鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗中的應用。
10.權利要求I至4中任一所述的滅活病毒液混合液在製備鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗。本發明提供了用於製備鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗的滅活病毒液混合液，由滅活的鴨肝炎病毒YB3株病毒液和滅活的鴨肝炎病毒GD株病毒液組成。本發明提供的鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗，由抗原和礦物油佐劑組成；所述抗原由所述滅活病毒液混合液和吐溫-80組成；所述礦物油佐劑由白油、硬脂酸鋁和司本-80組成。本發明提供的鴨病毒性肝炎二價滅活疫苗具有如下優點(1)同時對1型鴨肝炎病毒和新型鴨肝炎病毒具有預防作用；(2)使用滅活病毒製成，安全性好；(3)保存、運輸(2-8℃條件)和使用方便(不需稀釋)；(4)免疫效果穩定。
文檔編號A61K39/295GK102895660SQ20121041401
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月25日 優先權日2012年10月25日
發明者範書才, 李虹, 嚴悌昆, 袁率珍, 謝秉超, 張兵, 張毓金, 馮忠澤, 林旭埜 申請人:中國獸醫藥品監察所, 廣東永順生物製藥股份有限公司