分枝桿菌乾燥培養基及其生產方法

2023-06-18 23:51:11

專利名稱：分枝桿菌乾燥培養基及其生產方法
技術領域：
本發明分枝桿菌乾燥培養基及其生產方法，涉及微生物存在測定的選擇性培養基。
結核病是一種存在於世界範圍發病率很高的傳染性疾病之一，雖是一種病因明確，治有辦法，防有措施的病種，但關鍵的問題仍是要早期發現，及時治療，才能無虞。因此，儘早鑑別和診斷是控制該病的首要步驟。
在傳統的X放射線放射診斷、OT試驗和細菌培養三大診斷結核病技術中，尤以細菌培養發現結核菌生長最為直接。而細菌培養檢測技術本身，需要解決的是優質、價廉的分枝桿菌生長培養基的供應問題。目前，已有的培養基多數由於「原料來源困難」、「難以獲得純菌液」、「操作繁瑣」、「觀察不便」、「檢出陽性率低」等原因得不到推廣。以羅氏雞蛋基培養基和瓊脂培養基為代表的固體培養基，雖是當前分枝桿菌分離培養和藥敏檢測最主要的手段，但均有局限性。羅氏培養基、改良羅氏培養基、酸羅氏培養基、丙酮酸鈉培養基、小川氏培養基均為傳統以雞蛋為賦形劑和營養成分的培養基，配製過程繁瑣，只能小量製備，質量差異大，易發生藥物加熱失效和蛋白質吸附消耗等缺陷，難以保證檢測的準確性，且需用血清凝固器等，不利於基層及非專科醫院推廣應用;米氏培養基是以瓊脂為賦形劑的培養基，由於需牛血清白蛋白第Ⅴ部分(Fv)和過氧化物酶，價格昂貴，且需二氧化碳培養箱及特殊濾菌設備，僅能在發達國家使用，廣大第三世界無法推廣。近年來，由於吡嗪醯胺(PZA)在短程化療中的重要作用已引起學者們的日益重視，鑑於上述傳統培養基對PZA藥敏試驗存在困難，因此，尋找一種簡便、可靠的方法來檢測藥敏已迫在眉睫，鑑於PZA最佳殺菌酸度要求在pH5.6，這一特性給研製一種菌株生長良好、結果準確的培養基增加了難度。
本發明的目的在於要提供一種具有操作簡便，檢測快速，陽性檢出率高，價格低廉，便於運輸和保藏的分枝桿菌乾燥培養基。
本發明是這樣實現的，培養基以瓊脂和澱粉為賦形劑，加入分枝桿菌生長所需的碳源、氮源、磷酸鹽、硫酸鹽和以及微量刺激生長因子組合群及其他輔劑構成，其各主要組分的重量配比為磷酸二氫鉀68-88、磷酸氫二鈉10-15，檸檬酸三銨10.5-14，檸檬酸三鈉9-11，檸檬酸鐵銨0.5-1.1，L-穀氨酸或天門冬氨酸10.5-14.5，葡萄糖酸鈉或葡萄糖酸鉀10.5-14.5，葡萄糖45-48，硫酸鎂或氯化鎂1.2-2.5，丙酮酸鈉10.5-14.5，尿嘧啶或/和胸腺嘧啶0.8-1.0，-磷酸腺苷(AMP)或鳥嘌呤核苷酸(GMP)0.4-0.6，硫酸鋅或氯化鋅0.2-0.68，偏重亞硫酸鈉2-3，硒酸鈉0.05-0.16，泛酸鈣0.04-0.05，孔雀綠0.05-0.16，DNA0.10-0.50，琥珀酸鈣3-4.5，酵母粉4.6-10.0，澱粉150-270，瓊脂487-664。
其製備方法為按上述重量比分別稱取本發明各組分原料，以下列步驟配製本發明培養基1，磷酸鹽、硫酸鹽等無機鹽分別置烤箱內在100℃下烘烤，脫去結晶水;
2，將孔雀綠吸附於上述磷酸鹽，研磨均勻，以10-50份澱粉收底;
3，將上述檸檬酸鹽，L-穀氨酸，葡萄糖酸鹽，葡萄糖，鎂鹽，丙酮酸鈉，置粉碎器內磨勻，在烤箱內80-90℃烘1-2小時，加入澱粉10-50份混合;
4，DNA，用最少量蒸餾水加熱溶解，以最少量瓊脂吸附，置烤箱中80-90℃下烘24小時，加入與瓊脂量相同的牛肉膏，蛋白腖以及酵母粉適量球磨，300轉/分，混勻2小時;
5，將上述嘧啶，核苷酸，鋅鹽，偏重亞硫酸鈉，硒酸鈉，泛酸鈣和琥珀酸鈣研磨均勻，置37℃溫箱過夜;
6，取上述處理後的各成分，補足瓊脂和澱粉，酵母粉所需量後，置球磨機混勻，300轉/分×1小時，仃半小時，再球磨，反覆4次，取出置80℃烘箱烘1小時，即得淡黃色粉末狀的本發明乾燥培養基。產品用鋁塑封口袋包裝，暫不包裝則置塑料瓶密封，放置避光乾燥處保存。
使用本培養基時，只需加入適量的甘油和蒸餾水，混勻，在高溫高壓下滅菌15-20分鐘，冷卻後再加入小牛血清，不需用血清凝固器等專用設備，接著參照中國防癆協會細菌學標準操作規程，即可進行分枝桿菌的分離培養、鑑定的工作。由於使用了磷酸鹽緩衝液，使培養基的pH穩定在5.6±0.10內，為PZA藥敏檢測提供了最佳酸度，且可以大規模生產，消除了質量差異，從而為檢測結果的準確性提供了可靠的保證。經用於分枝桿菌的分離培養證明，菌株生長迅速，六周可出報告，用於PZA藥敏試驗，大多數菌株三周內即可報告，而用酸羅氏培養基則需10周，本發明還可反應菌株對藥物的真實耐藥性。故本發明培養基，及其生產方法，具有操作簡便，檢測快速，陽性檢出率高，價格低廉，易於標準化生產，便於運輸和保藏的優點，對於指導常規用藥以及PZA臨床用藥具有重大意義。
以下實施例將對本發明的技術特徵作進一步描述。
實施例1，將磷酸二氫鉀68克，磷酸二氫鈉10克於烤箱內100℃烘烤4小時，脫去結晶水;將孔雀綠0.05克吸附於上述磷酸鹽，研磨均勻，以50克澱粉收底;稱取檸檬酸三銨10.5克，檸檬酸三鈉9克，檸檬酸鐵銨0.5克，L-穀氨酸10.5克，葡萄糖酸鈉10.5克，葡萄糖45克，硫酸鎂1.2克，丙酮酸鈉10.5克，置粉碎器內磨勻，烤箱內80-90℃烘1小時，加入澱粉50克混合;稱取DNA0.10克，以最少量蒸餾水加熱溶解，吸附於最少量瓊脂，80-90℃烤箱烘24小時，加入與瓊脂等量的牛肉膏，蛋白腖以及1-2克酵母粉，球磨，300轉/分，混勻2小時;稱取尿嘧啶0.8克，一磷酸腺苷0.4克，硫酸鋅0.2克，偏重亞硫酸鈉2克，硒酸鈉0.05克，泛酸鈣0.04克和琥珀酸鈣3克研磨均勻，置37℃溫箱過夜;取上述處理後的成分，補足一瓊脂和澱粉所需量，置球磨機混勻，300轉/分×1小時，隔半小時，反覆4次，取出置80℃烘箱烘1小時，用鋁塑封口袋包裝，暫不包裝則置500克塑料瓶密封，放置避光乾燥處保存。
實施例2，將磷酸二氫鉀68克，磷酸二氫鈉10克於烤箱內100℃烘烤4小時，脫去結晶水;將孔雀綠0.05克吸附於上述磷酸鹽，研磨均勻，以50克澱粉收底;稱取檸檬酸三銨10.5克，檸檬酸三鈉9克，檸檬酸鐵銨0.5克，天門冬氨酸10.5克，葡萄糖酸鉀10.5克，葡萄糖45克，氯化鎂1.2克，丙酮酸鈉10.5克，置粉碎器內磨勻，烤箱內80-90℃烘1小時，加入澱粉50克混合;稱取DNA0.10克，以最少量蒸餾水加熱溶解，吸附於最少量瓊脂，80-90℃烤箱烘24小時，加入與瓊脂等量的牛肉膏，蛋白腖以及1-2克酵母粉，球磨，300轉/分，混勻2小時;稱取胸腺嘧啶0.8克，鳥嘌呤核苷酸0.4克，氯化鋅0.2克，偏重亞硫酸鈉2克，硒酸鈉0.05克，泛酸鈣0.04克和琥珀酸鈣3克研磨均勻，置37℃溫箱過夜;取上述處理後的成分，補足瓊脂和澱粉至全量，置球磨機混勻，300轉/分×1小時，隔半小時，反覆4次，取出置80℃烘箱烘1小時，用鋁塑封口袋包裝，暫不包裝則置500克塑料瓶密封，放置避光乾燥處保存。
實施例3-15，操作工藝同實施例1，培養基各組分的含量為

實施例13，本發明用於分枝桿菌分離培養，一，菌株來源牛型、鳥結核分枝桿菌標準菌株來源於美國。其餘由日本清瀨市結核病研究室提供。臨床標本來源於上海市及全國各大醫院收治患者。
二，培養基製備及使用1，稱取10克包裝乾燥培養基粉劑，加入甘油3～4毫升，蒸餾水250毫升，搖勻，115℃高壓滅菌10分鐘;
2，待冷卻至60-65℃，加10毫升小牛血清，混勻無菌分裝，放置斜面，凝固後37℃增菌過夜待用。室溫或4℃箱保存，4周內用畢;
3，以2%NaOH處理標本，振蕩消化痰液至透明或半透明，半小時內接種畢，每支0.1毫升37℃溫箱培養，每周觀察一次，第6周報告結果;
三，菌落形態保持人形結核桿菌基本特徵，與傳統羅氏培養基比較菌落稍細小，溼潤，光滑，呈表面生長。
四，結果1，標準菌株在乾燥培養基的生長試驗人型分枝桿菌(H37Rv)牛型菌株及9株非典型標準菌株在乾燥培養基與羅氏培養基比較，無論大接種量(10-3mg/ml)和小接種量(10-5mg/ml)生長速度和最終菌量均無差異
2，臨床標本分離培養試驗用2%NaOH前處理，與酸性羅氏對照，統計1133例臨床標本，乾燥培養基陽性為121例，酸羅氏為103例，統計學分析P0.05，無顯著性差異 乾燥培養基，經6家醫院共計2068例標本，比較5種培養基生長試驗結果，證明其陽性率均高於羅氏及小川氏，僅略低於丙酮酸鈉培養基
從上列三種培養基生長曲線比較圖表明，乾燥培養基的生長速度，快於雞蛋基培養基，6周可出報告，3周生長達到高峰。而酸羅氏、丙酮酸鈉培養基生長曲線相似，8周後仍有少量陽性，4周後才達到高峰。乾燥培養基可提前二周出報告實施例14，本發明乾燥培養基用於分枝桿菌吡嗪醯胺(PZA)藥敏試驗1，菌株來源標準株中牛型、鳥結核分枝桿菌來源於美國。其餘由日本清瀨市結核病研究室提供。臨床初、復治菌株來源於上海市各大醫院。
2，培養基製備基礎液A取10克包裝乾燥培養基粉劑，加入甘油3毫升，蒸餾水250毫升，加熱溶解，10磅滅菌15分鐘;基礎液B新鮮小牛釁血清10ml。
待A液冷卻至50-65℃，將B液倒入混勻，分別加入PZA藥粉，得最終濃度0，25，50，250μg/ml四組，趁熱分裝，放置斜面。凝固後置37℃溫箱增菌過夜，室溫保存，4周內用完。
3，操作方法參照中國防癆協會細菌學標準操作規程，做分枝桿菌各群標準菌株生長試驗和臨床初復治菌間接藥敏試驗，藥敏試驗最終接種量為10-3mg/ml。
4，結果觀察於接種後2、3周各觀察一次，第4周出報告。原則上以空白管生長至「+」以上，即可報告藥敏結果。
按上述操作所得158株臨床分離菌PZA藥敏試驗結果為 結果顯示初治菌絕大多數敏感，復治菌株耐藥產生快，三個月內即可達48%，用藥1年者90%耐藥。
118株初治菌各濃度管生長情況
權利要求
1.分枝桿菌乾燥培養基，其特徵在於，培養基包括磷酸二氫鉀68-88(重量份)，磷酸氫二鈉10-15(重量份)，檸檬酸三銨10.5-14(重量份)，檸檬酸三鈉9-11(重量份)，檸檬酸鐵銨0.5-1.1(重量份)，L-穀氨酸10.5-14.5(重量份)，葡萄糖酸鈉10.5-14.5(重量份)，葡萄糖45-48(重量份)，硫酸鎂1.2-2.5(重量份)，丙酮酸鈉10.5-14.5(重量份)，尿嘧啶0.8-1.0(重量份)，一磷酸腺苷0.4-0.6(重量份)，硫酸鋅0.2-0.28(重量份)，偏重亞硫酸鈉2-3(重量份)，硒酸鈉0.05-0.16(重量份)，泛酸鈣0.04-0.05(重量份)，孔雀綠0.05-0.16(重量份)，DNA0.10-0.27(重量份)，琥珀酸鈣3-4.5(重量份)，酵母粉4.6-10.0(重量份)，澱粉150-270(重量份)，瓊脂487-664(重量份)。
2.如權利要求2所述的分枝桿菌乾燥培養基的生產方法其特徵在於按培養基組分配比要求，分別稱取原料，通過以下步驟配製本發明培養基(1)，磷酸鹽、硫酸鹽等無機鹽分別置烤箱內在100℃下烘烤，脫去結晶水和表面吸附水;(2)，將孔雀綠吸附於上述磷酸鹽，研磨均勻，以適量澱粉收底;(3)，將檸檬酸鹽，胺基酸，葡萄糖酸鹽，葡萄糖，鎂鹽，丙酮酸鈉，置粉碎器內磨勻，在烤箱內80-90℃烘1-2小時，加入適量澱粉混合;(4)，DNA，以最少量蒸餾水加熱溶解，用最少量瓊脂吸附，置烤箱中80-90℃下烘24小時，加入與瓊脂量相同的牛肉膏，蛋白腖以及酵母粉適量球磨，300轉/分，混勻2小時;(5)，將嘧啶，核苷酸，鋅鹽，偏重亞硫酸鈉，硒酸鈉，泛酸鈣和琥珀酸鈣研磨均勻，置37℃溫箱過夜;(6)，取上述處理後的各成分，補足瓊脂、澱粉、酵母至全量後，混合置球磨機混勻，300轉/分×1小時，仃半小時，再球磨，反覆4次，取出置80℃烘箱烘1小時，即得本發明培養產品;(7)將上述培養基產品密封置避光乾燥處保存。
全文摘要
本發明分枝桿菌乾燥培養基，涉及微生物存在測定的選擇性培養基，主要由磷酸鹽，檸檬酸鹽，胺基酸，葡萄糖酸鹽，葡萄糖，鎂鹽，丙酮酸鈉，嘧啶，鋅鹽，硒酸鈉，泛酸鈣，孔雀綠，DNA，琥珀酸鈣，酵母粉，澱粉和瓊脂，通過大規模乾燥培養生產技術，經脫水、吸附、乾燥、球磨等工藝配製而成，具有操作簡便，檢測快速，陽性檢出率高，價格低廉，易於標準化生產，便於運輸和保藏的優越性。
文檔編號C12Q1/04GK1103893SQ9311262
公開日1995年6月21日 申請日期1993年12月14日 優先權日1993年12月14日
發明者徐建新 申請人:中國科學院上海植物生理研究所