細胞蝕斑快速測定狂犬病病毒毒價的方法
2023-06-07 03:26:31 4
專利名稱：細胞蝕斑快速測定狂犬病病毒毒價的方法
技術領域：
本發明涉及狂犬病病毒毒價的測定方法，尤其是涉及一種細胞蝕斑測定狂犬病病 毒毒價的方法。
背景技術：
目前，狂犬病病毒毒價的測定方法普遍採用小鼠半數致死量(LD50)。LD50測定方 法需要用活體動物，活體動物的個體差異將會給檢測結果帶來很大的影響；而且LD50測定 周期長，14日後才能判定結果，這樣勢必會延長疫苗生產中半成品檢驗周期。另外，細胞蝕斑法也是狂犬病病毒毒價測定的一種有效方法。病毒感染細胞後，通 過半固體或固體介質的限制，釋放的病毒只能由最初感染的細胞向周邊擴展。經過幾個增 殖周期，便形成一個局限性病變區域，即病毒蝕斑。從理論上講，一個蝕斑就是由最初感染 細胞的一個病毒顆粒形成，因而可通過病毒顆粒計數測定毒價。通過用甲基纖維素或瓊脂 等介質防止釋放的病毒顆粒在介質中流動，以便將蝕斑控制在適當的範圍內。為便於肉眼 觀察，常用結晶紫等染料染色，活細胞層染成深紫色，由於病變細胞不吸收染料，細胞板內 圓形不著色的透明區域即為一個蝕斑單位。病毒懸液的滴度可以用每毫升蝕斑形成單位 (PFU/ml)來表示。在實際操作中，需要配置合適的介質，有效地控制接種條件和反應條件才 能獲得可靠的測定結果。國內外已報導狂犬病病毒蝕斑實驗周期為5 10日，蝕斑形成的時間依然較長。 此外，蝕斑測定法存在對實驗條件要求嚴格、操作步驟複雜、蝕斑不易形成或不能形成、再 現性差等缺點，到目前仍未形成標準的檢測方法。
發明內容
有鑑於此，本發明的主要目的在於提供細胞蝕斑快速測定狂犬病病毒毒價的方 法，包括以下步驟1)將甲基纖維素與細胞維持液按照1 99 2 98的質量比混合，使甲基纖維 素充分溶解，得到質量百分比濃度為 2%的甲基纖維素覆蓋培養基；2)消化處於對數生長期的細胞後，用細胞生長液稀釋，得到細胞密度為 lX105cells/ml 5X 105cells/ml 的細胞懸液；3)用細胞維持液以10倍系列稀釋待測定的狂犬病病毒液，得到IO4 IO8倍系列 稀釋梯度濃度狂犬病病毒液；4)將步驟2)所述細胞懸液與步驟3)所述狂犬病病毒液，以體積比9 1的比例加 入到細胞培養板的細胞培養孔中，同時取步驟2)所述的細胞懸液與步驟1)所述的細胞維 持液，以體積比9 1的比例加入到細胞培養板的細胞培養孔中作為陰性對照，置於36°C 38CO2培養箱中培養6 12h，細胞貼壁後形成細胞層，棄去所述細胞培養板中的上清 液，用磷酸鹽緩衝液衝洗細胞；5)在細胞培養孔中加入步驟1)所述甲基纖維素覆蓋培養基Iml 2ml，作為覆蓋層，置於33°C 36°C，CO2培養箱中繼續培養72 96h後，加入染色液染色，觀察細胞培養 板的各培養孔的蝕斑數，以蝕斑數計算待測定的狂犬病病毒液的毒價。優選地，本發明所述甲基纖維素覆蓋培養基中含有50 80mmol/L的HEPES。優選地，本發明所述細胞維持液為含有50 100 μ g/ml DEAE-Dextran和3% (ν/ ν)的牛血清的MEM。優選地，本發明所述細胞生長液為含50 100 μ g/ml DEAE-Dextran和6% (ν/ν) 的牛血清的MEM。優選地，本發明所述CO2培養箱中CO2體積含量為2% 10%。優選地，本發明所 述染色液為0. 5% 1. 5% (w/v)的結晶紫、0.01% 0. (w/v)中性紅或0.5% 5% (w/v)碘液中任一種。技術效果本發明的細胞蝕斑快速測定狂犬病病毒的方法，採用單層細胞培養，具有對病毒 蝕斑反應所特有的敏感性、重複性和特異性。其次，本發明採用的細胞維持液、細胞生長液能夠促進病毒與細胞吸附。而且在病 毒蝕斑的細胞生長液與維持液中，均添加了 DEAE-Dextran，甲基纖維素培養基溶液中還添 加了 50 80mmol/L的HEPES，因此能夠大大加快蝕斑的形成，縮短了狂犬病毒檢測的周期。最後，甲基纖維素覆蓋培養基配製方法是將滅菌甲基纖維素粉末直接溶於維持液 中，製備方法簡單。綜上所述，甲基纖維素培養基溶液中含有50 80mmol/L的HEPES，能夠加快蝕斑 的形成；此方法持續周期短，3 4日即可用肉眼判定結果，並且特異、敏感，重複性好，操作 簡便，經濟，易於推廣；解決了狂犬病病毒因無明顯細胞病變而不易測定的問題，具有一定 應用價值；既可用於病毒克隆，還可用於病毒的測定和中和抗體的檢測，給狂犬病病毒的研 究帶來了較大的方便。
圖1為蝕斑的肉眼觀察圖；
圖2為蝕斑的顯微鏡照片。
具體實施例方式本發明試驗了甲基纖維素與細胞維持液的比例採用1 99 2 98的質量比， 優選地，使用1 99的質量比，得到質量百分比濃度為的甲基纖維素覆蓋培養基。本發明試驗了在細胞培養孔中加入細胞懸液與狂犬病病毒液，CO2培養箱中培養 6 12h，細胞貼壁後形成細胞層，優選地，在細胞貼壁形成單層細胞層後，繼續下面的檢測步驟。本發明試驗了甲基纖維素培養基中使用了 50 80mmol/L HEPES,優選地，本發明 實施例中使用了 50mmol/L的HEPES，而且在培養初期在配製的覆蓋層中直接加入50mmol/L 的HEPES，不僅簡化操作步驟，同時還可以使蝕斑形成時間進一步提前。本發明試驗了細胞生長液和細胞維持液中加入50 100 μ g/ml DEAE-Dextran, 也可以促進蝕斑形成，縮短觀察檢測時間。
本發明試驗了 0. 5% 1. 5% (w/v)的結晶紫、0. 01 % 0. 1 % (w/v)中性紅或 0. 5% 5% (w/v)碘液三種不同的染色劑對培養3 4日的細胞進行染色，均能形成清晰 蝕斑，優選0. 5% 1. 5% (w/v)的結晶紫。本發明實施例中，病毒株為Flury-LEP毒株(中國獸醫藥品監察所，菌種號 AV2012)，其他本領域常用的病毒如Flury-HEP毒株、ERA毒株、CTN-I毒株和aG毒株等也可 用於本發明之方法進行病毒含量測定。本發明實施例中，傳代細胞為BHK-21細胞(幼倉鼠腎傳代細胞)，其他本領域常 用的傳代細胞如Vero細胞(非洲綠猴腎細胞)、PK-2A細胞(豬腎細胞)、HamSter Kidney 細胞(地鼠腎細胞)和CEF細胞(雞胚成纖維細胞)等也可用於本發明之方法進行病毒含
量測定。為使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這 些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍，下列實施例中未提及的具體實驗 方法，通常按照常規實驗方法進行。實施例1配製MEM基礎液取9. 6g MEM溶於1000ml水中，然後加入2. 2g NaHCO3，並用Imol/ L的HCl或NaOH調整pH值至7. 2，並加入DEAE-Dextran使其濃度為80 μ g/ml，無菌過濾後 作為IXMEM基礎液，不加血清的MEM培養基作為基礎液。在1 XMEM基礎液中添加3%體積 百分比的牛血清作為細胞維持液；在IXMEM基礎液中添加6%體積百分比的牛血清作為細 胞生長液；取部分維持液加入終濃度為50mmol/L的HEPES備用。該細胞蝕斑快速測定狂犬病病毒的方法，包括以下步驟(1)將已滅菌的甲基纖維素與含有50mmol/L HEPES的維持液按照1 99質量比 混合，4°C放置3日以上，使甲基纖維素充分溶解，得到質量百分比濃度為的甲基纖維素 溶液，作為覆蓋層；臨用時於37°C水浴中預熱；(2)消化處於對數生長期的BHK-21細胞，用生長液稀釋處於對數生長期的BHK-21 細胞，使細胞密度為2. 5X 105cells/ml，得到BHK-21細胞懸液；(3)用維持液以IO1UO2UO3UO4UO5UO^IO7UO8倍系列稀釋待測定的狂犬病病毒 液，得到梯度濃度狂犬病病毒液；(4)將所述細胞懸液按0. 9ml/孔加入到細胞培養板中；(5)將所述梯度濃度狂犬病病毒液按0. Iml/孔加入到步驟(4)中得到的已含有細 胞懸液的細胞培養板中，同時設置陰性對照，置於CO2培養箱中培養，CO2培養箱的CO2體積 含量為5%，溫度為37°C ；(6)6 12h細胞貼壁後，棄去所述細胞培養板中的上清液，用摩爾濃度為 0. Olmol/L、pH值為7. 2的滅菌PBS衝洗一遍，直到死亡細胞完全脫落；然後每孔加入步驟 (1)所配製的質量百分比濃度為1 %的甲基纖維素覆蓋培養基Irnl，作為覆蓋層，置於CO2培 養箱中繼續培養，CO2培養箱的CO2體積含量為5%，溫度為35°C ；(7) 96h後棄去覆蓋層，並用濃度為0. Olmol/L.pH值為7. 2的滅菌PBS衝洗三遍， 直至將甲基纖維素衝洗乾淨；然後每孔加入lml、l%質量百分比的結晶紫溶液，室溫條件 (25°C)下染色20min後，用自來水緩緩衝洗15min，直至染色液衝洗乾淨，晾乾，肉眼觀察細 胞培養板的各培養孔的蝕斑數；
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(8)陰性對照無蝕斑出現的細胞培養板，判為有效板，根據有效板的各培養孔的蝕 斑數、接種的待測定的狂犬病病毒液的用量及稀釋倍數計算出待測定的狂犬病病毒液的毒 價。圖1和圖2中箭頭所示分別為眼觀和顯微鏡下觀察的病毒蝕斑，圖1中Bl B5 對應的稀釋度分別為待測狂犬病毒1X ΙΟ4、1 X 105、1 X 106、1 X IO7,1 X IO8稀釋倍數，每個稀 釋度4個孔重複。B3的4個孔蝕斑數分別是15、16、12、10，4個孔的蝕斑數均在8 30個 範圍之內，因此B3所對應1 X IO6為最適稀釋倍數，如前所述，ν (每孔接種的病毒體積)為 0. lml，根據公式計算A(PFU/ml) = (15+16+12+10)/4 X 106/0· 1 = 1. 33 X IO8 (PFU/ml)本發明所述的測定方法操作簡單、可控性強、批間誤差小，根據實驗結果批間誤差 小於logl0°_2，能夠實現狂犬病病毒毒價的標準化測定，並且縮短了狂犬病疫苗生產中半成 品的檢驗周期。批間誤差的計算方法是將同一待檢狂犬病病毒液，小量分裝，超低溫保存，分10 次試驗來檢測這一待檢毒樣，10次檢測的結果取對數，並計算10個樣本總體的標準偏差後 得到的數值。同一病毒液重複檢驗10次，檢驗結果用對數表示分別為8. 33,8. 42,8. 18,8. 24、 8. 02,8. 15,8. 35,8. 08,8. 33,8. 27，計算總體樣本標準偏差為 0. 12，即為 IoglO012o以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精 神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
權利要求
一種細胞蝕斑快速測定狂犬病病毒毒價的方法，其特徵在於，包括以下步驟1)將甲基纖維素與細胞維持液按照1∶99～2∶98的質量比混合，使甲基纖維素充分溶解，得到質量百分比濃度為1％～2％的甲基纖維素覆蓋培養基；2)消化處於對數生長期的細胞後，用細胞生長液稀釋，得到細胞密度為1×105cells/ml～5×105cells/ml的細胞懸液；3)用細胞維持液以10倍系列稀釋待測定的狂犬病病毒液，得到104～108倍系列稀釋梯度濃度狂犬病病毒液；4)將步驟2)所述細胞懸液與步驟3)所述狂犬病病毒液，以體積比9∶1的比例加入到細胞培養板的細胞培養孔中，同時取步驟2)所述的細胞懸液與步驟1)所述的細胞維持液，以體積比9∶1的比例加入到細胞培養板的細胞培養孔中作為陰性對照，置於CO2培養箱中培養6～12h，細胞貼壁後形成細胞單層，棄去所述細胞培養板中的上清液，用磷酸鹽緩衝液衝洗細胞；5)在細胞培養孔中加入步驟1)所述甲基纖維素覆蓋培養基1ml～2ml，作為覆蓋層，置於CO2培養箱中繼續培養72～96h後，加入染色液染色，觀察細胞培養板的各培養孔的蝕斑數，以蝕斑數計算待測定狂犬病病毒液的毒價。
2.根據權利要求1所述的細胞蝕斑快速測定狂犬病病毒的方法，其特徵在於，步驟1) 中所述甲基纖維素覆蓋培養基中含有50 80mmol/L的HEPES。
3.根據權利要求1所述的細胞蝕斑快速測定狂犬病病毒的方法，其特徵在於，步驟2) 中所述的細胞為BHK-21細胞、Vero細胞、PK-2A細胞、Hamster Kidney細胞和CEF細胞。
4.根據權利要求1所述的細胞蝕斑快速測定狂犬病病毒的方法，其特徵是步驟1)、3) 中所述的細胞維持液為含有50 100 μ g/mlDEAE-Dextran和3%體積百分比的牛血清的 MEM0
5.根據權利要求1所述的細胞蝕斑快速測定狂犬病病毒的方法，其特徵在於，步驟2) 所述的細胞生長液為含50 100 μ g/ml DEAE-Dextran和6%體積百分比的牛血清的MEM。
6.根據權利要求1所述的細胞蝕斑快速測定狂犬病病毒的方法，其特徵在於，步驟4) 中細胞培養孔中細胞貼壁後形成單層細胞。
7.根據權利要求1所述的細胞蝕斑快速測定狂犬病病毒的方法，其特徵在於，步驟4)、 5)中的所述CO2培養箱中CO2體積含量為2% 10%。
8.根據權利要求1所述的細胞蝕斑快速測定狂犬病病毒的方法，其特徵在於，步驟4) 中所述培養溫度為36°C 38°C。
9.根據權利要求1所述的細胞蝕斑快速測定狂犬病病毒的方法，其特徵在於，步驟5) 中所述培養溫度為33°C 36°C。
10.根據權利要求1所述的細胞蝕斑快速測定狂犬病病毒的方法，其特徵在於，步驟5) 中的染色劑為0. 5% 1. 5% w/v的結晶紫、0. 01% 0. 1% w/v中性紅或0. 5% 5% w/v 碘液。
全文摘要
本發明提供一種細胞蝕斑快速測定狂犬病病毒毒價的方法，其包括以下步驟(1)配製甲基纖維素覆蓋培養基；(2)製得細胞懸液；(3)稀釋待測定的狂犬病病毒液，得到梯度濃度狂犬病病毒液；(4)將所述細胞懸液與狂犬病病毒液，以體積比9∶1的比例加入到細胞培養板的細胞培養孔中，置於CO2培養箱中培養；(5)棄去細胞培養板中的上清液，將甲基纖維素覆蓋培養基加至培養孔中，置於CO2培養箱繼續培養；(6)結晶紫染色，觀察細胞培養板的各培養孔的蝕斑數，以蝕斑數計算待測定狂犬病病毒液的毒價。該測定方法操作簡單，快速準確，可控性強、批間誤差小，縮短了狂犬病病毒毒價的檢驗周期。
文檔編號C12Q1/70GK101921877SQ20101027319
公開日2010年12月22日 申請日期2010年9月2日 優先權日2010年5月31日
發明者喬榮岑, 孫進忠, 張許科 申請人:洛陽普萊柯生物工程有限公司