抗旱或抗鹽脅迫轉基因穀類植物的生產的製作方法

2023-06-07 05:46:31 3

專利名稱：：抗旱或抗鹽脅迫轉基因穀類植物的生產的製作方法本申請要求美國臨時專利申請60／005，223號(1995年10月12日遞交)的優先權。發明領域本發明一般涉及轉基因穀類植物，更具體說涉及含有編碼一種可使轉基因穀類植物形成水或鹽脅迫抗性的晚期胚胎發生豐富蛋白的核苷酸的轉基因穀類植物。發明背景本申請全篇引用了各種參考文獻，許多在圓括號內註明。將這些文獻的完整引述提供於本詳述之後。這些文獻所公開的全部內容在本申請中引作參考。環境脅迫，例如乾旱，增高的土壤鹽分，以及極端溫度，是限制植物生長和產量的主要因素。估計全世界三種主要穀類作物，水稻、玉米和小麥每年由於水(乾旱)脅迫造成的減產已超過一百億美元。培育抗逆作物是解決這一難題的希望(Epstein等，1980)。但是，傳統育種方法對於產生各種抗逆性增強的作物變種來說過程緩慢。有限的抗逆種質資源以及遠源植物物種間的雜交不相容性是傳統育種所面臨的另外的問題。最近在植物遺傳轉化和從各種資源鑑定的具有潛在有用基因的可用性方面取得的進展使得用轉基因的方法產生抗逆作物成為可能(Tarczynski等，1993；Pilon-Smits等，1995)。鑑定和克隆抗逆基因面臨著挑戰。遺傳學研究表明一些對乾旱和鹽度具有抗性的作物變種主要是基於額外的基因功效(Akbar等，1986a，1986b)。但是，關於所述抗性的分子學機制還未闡明。已在多種植物中進行了對高濃度離子或非離子溶質及降低水潛能的生理和生化反應的研究。在累積的實驗觀察和理論分析基礎上，揭示出植物對於滲透脅迫的適應或抗性機理可能在於一些相容的，低分子量滲透質(osmolytes)如糖醇，特殊胺基酸，和甘氨酸甜菜鹼(glycinebetaine)的積累(Greenway和Munns，1980；Yancey等，1982)。最近，一項轉基因研究表明在轉基因菸草中累積的糖醇甘露糖醇對於鹽脅迫可形成保護(Tarczynski等，1993)。兩項近期運用轉基因方法的研究表明甘氨酸甜菜鹼生物合成途徑的代謝工程不僅有可能而且最終導致產生抗逆植物(Holmstrom等，1994；Rathinasabapathi等，1994)。除了代謝變化和低分子量化合物的累積外，一大組基因被轉錄激活，因此導致在滲透脅迫條件下植物營養組織中新蛋白質的積累(Skriver和Mundy，1990；Chandler和Robertson，1994)。據報導一些基因的表達水平與同一種屬植物不同變種的抗脫水，鹽，或寒冷性有關。一般假定脅迫誘導的蛋白在抗性方面起重要作用，但仍缺乏直接證據，並且許多脅迫反應基因的功能還未知。闡明這些脅迫反應基因的功能不僅提高我們對於植物環境脅迫的適應和拮抗的理解，而且可為設計作物品質提高的新策略提供重要信息(Chandler和Robertson，1994)。首先在棉花中鑑定晚期胚胎發生豐富蛋白(LEAproteins)是一組在種子發育後期高度累積於胚胎中的蛋白質(Dure等，1981)。之後，從不同種植物中鑑定了許多LEA蛋白或其基因(Dure整理，1992)。基於它們擁有共同的胺基酸序列域(domains)，將LEA蛋白劃分為三大組(Baker等，1988；Dure等，1989)。第2組LEA蛋白及其cDNA已從水稻中鑑定出來(Mundy和Chua，1988)。第2組LEA基因家族的四個成員串聯排列在同一位點，並且在對ABA，乾旱，和鹽脅迫產生反應時在各種水稻組織中協同表達(Yamaguchi-Shinozaki等，1989)。但是，這些LEA蛋白的功能是未知的。最近，已將第2組和第3組LEA蛋白由印度水稻(Indicarice)變種中鑑定出來並且這些LEA蛋白在對鹽脅迫反應中的累積與各品種對鹽脅迫的抗性有關(Moons等，1995)。在許多植物(單子葉和雙子葉植物)中可檢測到含有的廣泛的共有序列的第2組LEA蛋白(dehydrins)(Close等，1993)。最近的一項研究表明第2組LEA基因存在於許多植物物種中但在脅迫敏感和脅迫抗性物種中這些基因的表達受不同的調控(Danyluk等，1994)。早已從大麥糊粉中鑑定了大麥的第3組LEA蛋白，HVA1。在種子發育後期在糊粉層和胚中特異性表達HVA1基因，與種子脫水乾燥期有關(Hong等，1988)。在幼苗中ABA和幾種脅迫條件包括脫水，鹽和極端溫度等快速誘導HVA1基因表達(Hong等，1992)。HVA1蛋白屬於第3組LEA蛋白，它包括其它一些成員如小麥pMA2005(Curry等，1991；Curry和Walker-Simmons，1993)，棉花D-7(Baker等，1988)，胡蘿蔔Dc3(Seffens等，1990)，以及油菜pLEA76(Harada等，1989)。這些蛋白以具有11個串聯重複的胺基酸域，它可以形成一個具有疏水區親水表面的雙親和性的α-螺旋結構為特徵(Baker等，1988；Dure等，1988；Dure，1993)。大麥的HVA1基因和小麥的pMA2005基因(Curry等，1991；Curry和Walker-Simmons，1993)在核苷酸水平和所預示的胺基酸水平高度相似。這兩種單子葉植物基因與棉花的D-7基因(Baker等，1988)和胡蘿蔔的Dc3基因(Seffens等，1990)緊密相關，它們有著相同的結構基因組成(Straub等，1994)。在許多情況下，LEAmRNA和蛋白的積累時間與種子脫水過程有關並和體內脫落酸(ABA)水平的升高有關。LEA基因也可以在分離的幼胚中由ABA，以及在營養性組織中由ABA和多種環境脅迫，如乾旱，鹽，和極端溫度所誘導表達(Skriver和Mundy，1990；Chandler和Robertson，1994)。因此，在許多植物中LEA基因表達或LEA蛋白積累與抗脅迫有關。例如，在嚴重脫水的小麥幼苗中，高水平第3組LEA蛋白的積累與組織抗脫水有關(Ried和Walker-Simmons，1993)。關於印度水稻變種的研究表明耐鹽變種根中的第2組LEA蛋白(亦稱作dehydrins)和第3組LEA蛋白水平明顯較敏感的變種中的高(Moon等，1995)。另一方面，其它LEA蛋白的存在並非總與脅迫抗性有關。例如，對於野生(水)稻和脫粒未碾的稻子的比較研究表明在低溫下野生稻種子對脫水的不耐受性並不能歸咎於缺乏或不能夠合成第2組LEA／dehydrin蛋白，ABA，或可溶性碳水化合物(Bradford和Chandler，1992；Still等，1994)。從菸草復活植株Craterostigma中產生的過量第2組LEA蛋白並未對滲透脅迫形成抗性(Iturriaga等，1992)。已發現在大豆種子中LEA蛋白不足以對脫水形成抗性，而是LEA蛋白和可溶性蔗糖共同有助於抗性(Blackman等，1991，1992)。在這些有關抗旱或抗鹽性提高的報導中，在受脅迫植物中激活了一大組基因(Skriver和Mundy，1990；Chandler和Robertson，1994)。LEA蛋白僅是這些基因產物中的一種，還有其它許多蛋白與抗旱或抗鹽性的提高有關(即受到水或鹽脅迫時這些其它蛋白的水平也相應增高)。因此，雖然LEA蛋白與增強的水或鹽脅迫抗性有關，然而並無任何特異激活的基因(包括LEA基因)能夠對植物形成水或鹽脅迫抗性的證據。因此，還沒有獲得到用於植物遺傳工程以增強其對水或鹽脅迫的抗性的合適基因。因此，有必要鑑定一種用於轉化基因植物後可編碼使植物形成水或鹽脅迫抗性的蛋白基因。這樣的水或鹽脅迫抗性植物可以有許多用途，尤其是在農業上並具體在為主要農作物的穀類植物中。發明概述因此，本發明提供生產穀類植物細胞或原生質體的方法，通過轉化經編碼晚期胚胎發生豐富蛋白的核酸的穀類植物細胞或原生質體可用於再生為抗旱或抗鹽穀類植物。另外本發明提供用編碼晚期胚胎發生豐富蛋白(當由穀類植物細胞或原生質體在穀類植物上再生時可形成抗旱或抗鹽性)核酸轉化的穀類植物細胞或原生質體，以及用編碼晚期胚胎發生豐富蛋白核酸轉化穀類植物，所述蛋白使植物成為抗水或抗鹽脅迫植物。本發明還提供據此發明產生的轉基因穀類植物的種子，當其萌發時便產生此發明的轉基因穀類植物。本發明另外提供提高穀類植物對水或鹽脅迫條件抗性方法。所述方法包括提高穀類植類植物中晚期胚胎發生豐富蛋白的水平。這可通過轉化穀類植物方法將啟動子和編碼晚期胚胎豐富蛋白(LEA)核酸導入的途徑來實現。更具體地說，將LEA蛋白基因(來自大麥(HordeumvulgareL．)的HVA1)轉進水稻(OryzasativaL．)。得到的轉基因水稻植株在其葉片和根中持續性積累HVA1蛋白。轉基因水稻植株表現出明顯增強的抗旱和抗鹽性。這種增強的抗性可以通過在脅迫引致的受損性狀延遲發生以及撤除脅迫條件後可較好恢復得到反應。抗性提高的程度與轉基因水稻植株中HVA1蛋白積累的水平有關。因此，可將LEA基因用作通過形成脅迫抗性而改良作物的分子工具。聯繫所附圖譜進行閱讀時，本發明的各種特點和優勢將會從以下的優選實施例的詳述中得到明顯體現。圖1．表明在轉基因水稻中表達HVA1的質粒pBY520之結構。只標明了普遍的限制性內切酶位點並用實方框代表那些用於DNA印跡雜交的位點。也標明了在DNA印跡雜交中用作探針的DNA片段。詳細描述本發明提供了一個通過用編碼晚期胚胎發生豐富蛋白的核酸轉化用於再生為抗水或鹽脅迫穀類植物的穀類植物細胞或原生質體的產生方法。一旦發生轉化，所述穀類細胞或原生質體能夠再生為轉基因穀類植物。本發明還涉及到提高穀類植物對水或鹽脅迫條件抗性的方法。此方法包括提高穀類植物中晚期胚胎發生豐富蛋白的水平。這可通過在穀類植物中用一個強啟動子調控異源晚期胚胎發生豐富蛋白基因的表達來完成。可據此發明進行轉化的穀類有木本科(Gramineae)(亦知為Poaceae)家族，並包括水稻(Oryza屬)，小麥，玉米，大麥，燕麥，高粱和粟米。優選此穀類為水稻，小麥或玉米，最優選水稻。可轉化許多種屬的穀類，並且在同一種中可轉化許多亞種和變種。例如，水稻種中的亞種印度水稻(Oryzasativassp．Indica)，它包括變種IR36，IR64，IR72，Pokkali，NonaBokra，KDML105，Suponburi60，Suponburi90，Basmati385和PusaBasmati1。另一個水稻亞種是Japonica，它包括Nipponbere，Kenfeng和Tainung67。合適的玉米變種的例子包括A188，B73，VA22，L6，L9，K1，509，5922，482，HNP和IGES。合適的小麥變種的例子包括Pavon，Anza，Chris，Coker983，FLA301，FLA302，Fremont和Hunter。鑑定了目標穀類植物，適合作轉化的植物細胞包括未成熟胚，愈傷組織，懸浮細胞和原生質體。特別優選使用懸浮細胞和未成熟胚。這些穀類植物細胞用核酸進行轉化，核酸可以是RNA或DNA及更優選cDNA，核酸編碼晚期胚胎發生豐富蛋白(LEA蛋白)。核酸可用生物方法分離或合成。在以下實施例中，由大麥的HVA1基因編碼LEA蛋白，該蛋白具有如Straub等(1994)所公開的核苷酸和胺基酸相同序列。但是，也可利用其它LEA基因，尤其是其它屬於第3組的LEA基因。這些第3組的其它LEA基因包括棉花D-7和D-29(Baker等，1988；Dure等，1981)，BrassicapLEA76(Harada等，1989)，胡蘿蔔Dc8和Dc3(Franz等，1989；Seffens等，1990)，大豆pmGM2(Hsing等，1992)，及小麥pMA2005和pMA1949(Curry等，1991；Curry和Walker-Simmons，1991)。在此引入這些LEA蛋白已公開的核苷酸和胺基酸序列作參考。根據本發明可用每個公開的核苷酸和胺基酸序列編碼LEA蛋白的核酸以轉化適合的穀類植物。亦可應用其它的第2組或第1組LEA基因。Dure(1992)公開了各種LEA基因。可通過質粒來完成對植物細胞的轉化。可以用質粒將編碼LEA蛋白的核酸引入植物細胞。因此，質粒優選包括插入特定限制性酶切位點的編碼LEA蛋白的DNA。異源DNA，如在此所用，是指在質粒所轉化的特定宿主細胞中正常並不存在的DNA。DNA用本領域所熟知的標準克隆方法插入載體。這通常包括使用限制性酶和DNA連接酶，如Sambrook等在MolecularCloingALaboratoryManual，2dedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork(1989)中所述。用所得到的含有編碼LEA蛋白的核酸質粒轉化宿主細胞，如農桿菌(Agrobacterium)和／或植物細胞(參看PlantMolecularBiologyManual，2ndEdition，Gelvin，S．B．和Schilperoort，R．A．，Eds．，KluwerAcademicpress，Dordrecht，Netherlands(1994))。對於植物轉化而言，優選質粒也包括一個植物轉化的篩選標記。一般使用的植物篩選標記包括潮黴素磷酸轉移酶(hpt)基因，草丁膦乙醯轉移酶基因(bar)，5-烯醇丙酮醯草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)，新黴素-3』-O-磷酸轉移酸酶(nptⅡ)或乙醯乳酸鹽合成酶(ALS)。優選質粒也包括用於編碼LEA蛋白核酸和標記基因表達的合適啟動子。常用花椰菜花葉病毒的35s啟動子以及水稻肌動蛋白1基因啟動子進行植物轉化。在以下實施例所使用的質粒pBY520中，編碼LEA蛋白的核酸由水稻的組成型啟動子肌動蛋白1基因調控同時篩選標記基因(bar)由花椰菜花葉病毒的35s啟動子調控。以LEA基因轉化植物的其它有用啟動子包括那些編碼泛肽和蛋白酶抑制劑Ⅱ(PINⅡ)的基因，以及脅迫誘導啟動子(如大麥的HVA1基因啟動子)。被命名為pBY520的質粒已於1995年10月12日依據和滿足《國際承認用於專利程序的微生物保藏布達佩斯條約》的要求，在美國典型培養物保藏中心(ATCC，12301ParklawnDrive，Rockville，Maryland20852)以保藏號ATCCNO．69930，保藏於大腸桿菌菌株pBY520／DH5α中。對於植物轉化，優選質粒也包含有比如從編碼蛋白酶抑制劑、肌動蛋白、或胭脂鹼合酶(nos)基因的3』非編碼區得到的編碼3』端終止子的核酸分子。可以構建其它適合用於本發明的質粒。例如，與大麥的HVA1基因不同LEA基因可在用限制性酶去掉HVA1基因之後連接到質粒pBY520中。可以用其它啟動子替代pBY520中的啟動子肌動蛋白Ⅰ基因。作為選擇，其它通常含有適合啟動子調控下的LEA基因及合適的篩選標記的質粒，可運用本領域熟知的技術輕易得以構建。鑑定質粒之後，一種用編碼LEA蛋白基因轉化穀類植物細胞的方法是將植物細胞與經過含編碼LEA蛋白基因的質粒轉化的細菌接種物共接觸。通常，此方法包括將植物細胞和轉化的細菌懸浮液在一起接種並在不含抗生素的再生培養基上於25-28℃將細胞培養48到72小時。可用土壤農桿菌屬的細菌轉化植物細胞。適合的種類包括根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)和髮根農桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)。根癌農桿菌(如菌株LBA4404或EHA105)因其功能已知尤其適用於轉化植物。按此發明方法接種穀類植物細胞與農桿菌時，所述菌必須經含有編碼LEA蛋白基因的載體轉化。適合摻入農桿菌中並具有編碼LEA蛋白基因的質粒，含有在大腸桿菌中進行複製的複製原點，即在根癌農桿菌中進行複製的複製原點；將基因轉入植物的T-DNA右邊界序列，以及對轉化的植物細胞進行篩選的標記基因。特別優選載體pBI121，它含有低拷貝RK2複製原點，新黴素磷酸轉移酶(nptⅡ)標記基因以及胭脂鹼合成酶(NOS)啟動子和一個NOS3』加多聚腺苷酸化信號。T-DNA質粒載體pBI121得自於ClonetechLaboratories，Inc．，4030FabianWay，PaloAlto，California94303。編碼LEA蛋白的一個基因插入載體取代了β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因。一般而言用質粒轉化農桿菌(Agrobacteriumspp．)可通過化學和熱處理後直接吸取質粒DNA如Holsters等(1978)所述；通過電穿孔法直接吸取質粒DNA，如S．Wen-jun和B．Forde(1989)所述；通過如Ditta等(1981)所述由鏈黴素抗性(Trat)輔助菌株介導通過三親交配將大腸桿菌中的質粒轉入農桿菌；或如Simon等(1982)所述通過直接接合由大腸桿菌轉入農桿菌。將含有編碼LEA蛋白核酸的質粒轉入植物細胞的另一種方法是通過轉化植物細胞核，如用粒子轟擊法。像本申請中所運用，對於宿主細胞的粒子轟擊(又稱為生物發射轉化)可由幾種途徑之一來完成。第一種包括推動惰性或生物活性的細胞粒子。這種技術在Sanforal等人的美國專利4，945，050號，5，036，006號，和5，100，792號中被公開，在此引作參考。通常，這個過程包括在可有效穿透細胞外表面並可摻入細胞內部的條件下推動惰性或生物活性的細胞粒子。當使用惰性粒子時，可將含異源DNA的質粒包裹在粒子上使質粒導入細胞。或者，使質粒包圍靶細胞這樣一旦粒子被激活便可將質粒載入細胞。也可推動生物活性的粒子(如含有質粒和異源DNA的細菌幹細胞)進入植物細胞。將質粒導入植物細胞的另外的方法是轉化植物細胞原生質體(穩定的或瞬間的)。植物原生質體僅包有一層原生質膜因而可吸收像異源DNA樣的大分子。這些工程化原生質體能夠再生完整植株。將異源DNA導入植物細胞原生質體的合適方法包括電穿孔法和聚乙二醇(PEG)轉化法。如本申請中所使用，電穿孔法通常是一種將高濃度質粒DNA(含有異源DNA)加到宿主細胞原生質體懸浮液中，用200到600伏／釐米的電場轟擊其混合液的方法。電穿孔之後，使轉化細胞生長於含篩選劑的適合培養基中而得到鑑定。如本申請所用，轉化包括質粒整合進植物染色體的穩定轉化。在以下實施例中，用生物發射轉化法對水稻進行轉化。也用其它一些轉化方法成功轉化水稻，包括原生質體法(綜述，見Cao等，1992)，和農桿菌法(Hiei等，1994)。也成功用生物發射轉化轉化玉米(綜述，見Mackey等，1993)和小麥(見Vasil等的美國專利5，405，765號)。穀類植物細胞或原生質體一旦按此發明進行轉化，可以再生為轉基因穀類植株。通常，再生是通過將轉化細胞置於含有合適生長調節劑和營養物的培養基上進行培養以促使莖幹分生組織啟動生長來完成。再生培養基中加入合適的抗生素以抑制農桿菌或其它汙染物的生長並對轉化細胞或原生質體的生長進行篩選。莖開始生長後，組培使之繼續生長並篩查標記基因活性。在適合的轉化方法中，穀類植物細胞的轉化可在離體或者活體進行，即穀類細胞可定位於穀類植物上。本發明還提供用此發明方法產生的轉基因穀類植株及轉基因穀類植物產生的種子。本發明進一步提供經編碼晚期胚胎發生豐富蛋白核酸轉化的穀類植物細胞或原生質體或轉基因穀類植株，由此穀類植物細胞或原生質體再生成的轉基因穀類植株中還形成了抗旱或抗鹽性。如前討論，可利用各種穀類植物和LEA基因。優選編碼LEA蛋白的核酸由一個強啟動子所調控以促進LEA蛋白最大程度表達，或有一個脅迫誘導啟動子以促使在脅迫條件下啟動子能夠相當地得到誘導。在一項實施例中，通過提供編碼LEA基因和啟動子DNA的質粒，轉基因穀類植物細胞或原生質體或植株用編碼啟動子的核酸，如水稻肌動蛋白1基因啟動子的核酸，進行轉化。轉基因穀類植物細胞或原生質體或植株亦可用編碼篩選標記如bar基因的核酸進行轉化，用以檢測轉化子，並用編碼花椰菜花葉病毒的35s啟動子來調控bar基因的表達。其它篩選標記包括編碼EPSPS，nptⅡ，或ALS的基因。其它啟動子包括那些來自編碼肌動蛋白1，泛肽和PINⅡ的基因。也可由編碼LEA基因及其啟動子的質粒來提供這些額外的核酸序列。若合適，也可通過以多個質粒進行轉化來提供各種核酸。本發明還涉及從轉基因穀類植物細胞或原生質體得到的再生的轉基因植株，以及從轉基因植株產生的種子。本發明也提供種子，它一旦萌發，可生成轉基因穀類植株。由於此處所指的核苷酸序列編碼一個LEA蛋白，因此對它與以前已知序列LEA蛋白的核苷酸一致性不作要求。本領域的技術人員可明顯看出，可能有許多沉默突變(即經特殊密碼子編碼的胺基酸不改變)的核苷酸作為替代。也可能由使特殊密碼子編碼的胺基酸改變的核苷酸來替代，這裡被替代的胺基酸是指保守序列替代(即保守「同源」胺基酸)。在對所編碼LEA蛋白的特性，二級結構，和疏／親水性僅有微小影響的LEA蛋白核苷酸和／或胺基酸序列中，也可以允許有少許核苷酸和／或胺基酸的增加，缺失，和／或替換。據此發明編碼LEA蛋白的核酸中也包括這些變異體。包括在此發明中的還有用此發明中編碼LEA蛋白的核酸片段進行轉化的轉基因穀類植株。可在適當的限制性位點構建能對穀類植物形成水或鹽抗性的適宜片段。片段是指較LEA編碼全長分子短的一段連續部分。可將非必需核苷酸置於片段(或LEA分子全長)5』和／或3』端而不會影響片段或分子的功能特徵(即對於提高水或鹽抗性)。例如，可將編碼蛋白的核苷酸連接到蛋白N一末端(舉例)的可進行共翻譯或翻譯後引導蛋白轉移的信號(或引導)序列上。也可以改變核苷酸序列以使被編碼的蛋白能夠連接到一個易於蛋白合成，純化，或鑑別的接頭或其它序列上。材料和方法水稻轉化質粒ActⅠ-HVA1的構建從cDNA克隆pHVA1中分離包含生長HVA1cDNA的1．0-kbEcoRⅠ片段(Hong等，1988)，此片段用KlenowDNA聚合酶切成鈍端並亞克隆至來自於質粒表達載體pBY505的SmaⅠ位點，pBY505為pBlescriptⅡKS(+)(Stratagene，CA)的衍生物，產生pBY520。在pBY520上，HVA1結構基因由水稻肌動蛋白1基因(Act1)的啟動子調控(McElroy等，1990；Zhang等，1991)並位於Act1啟動子和番茄蛋白抑制劑Ⅱ基因(Pin2)的3』區域之間(Thomburg等，1987)。質粒pBY520還含有細菌草丁膦乙醯轉移酶(PAT)的結構基因(通常所知的bar基因)(White等，1990)，在水稻轉化中它通過對以磷酸轉移酶為基礎的殺蟲劑形成抗性而被作為篩選標記。所述bar基因由花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子調控並隨後有胭脂鹼合成酶基因(nos)的終止信號。質粒pBY520已經以69930號登記保藏於ATCC。轉基因水稻植株的產生愈傷組織由水稻(OryzasativaLc．v．Nipponbare；得自InternationalRiceResearchInstitute，LosBanos，Philippines)的未成熟胚誘導而成，懸浮培養建立自在液體培養基中亞培養三個月後挑選的胚性再生愈傷組織。將好的懸浮培養細胞用作轉化材料並如Cao等(1992)所述用包裹有pBY520質粒的鎢粒進行轟擊。在含6mg／升glufosinate銨(CrescentChemicalCo．，Hauppauge，NY)作為篩選劑的選擇性培養基上篩選抗性愈傷組織5-7周。將抗性愈傷組織轉移到含3mg／Lammoniumglufosinate的MS(Murashige和Skoog，1962)再生培養基上再生為植株。認為從相同抗性愈傷組織再生的植株是同系的克隆。將再生植株轉移至土壤並在溫室生長(白天32℃／晚上22℃，並補加10小時光照周期)。轉基因水稻植株的抗殺蟲劑測試首先通過植株對殺蟲劑的抗性表現再生水稻植株中的轉化基因存在。在殺蟲劑抗性試驗中，將含0．5％(V／V)商品殺蟲劑BASTATM(含有162g／Lglufosinateammonium，Hoechst-RousselAgri-VetCompany，Somerville，NJ)和0．1％(V／V)Tween-20的水溶液塗在葉片的兩側。一周後，記錄對抗性／敏感表現型。經處理的非轉化(NT)植株損傷嚴重或死亡，而經處理的轉化植株的葉片未受影響或僅在試驗部位有輕度損傷。轉基因水稻植株的DNA印跡雜交分析用以HVA1編碼區作為探針的DNA印跡雜交分析證實轉化基因(包括HVA1)在第一代(R0)轉基因水稻植株基因組中的整合。按Zhao等(1989)所述方法進行分離基因組DNA。在DNA印跡雜交分析中，用限制性內切酶HindⅢ，或EcoRⅠ和BamHⅠ共同對每個樣品的10到15μgDNA進行消化，在1．0％瓊脂糖凝膠上分離，轉至尼龍膜上，與如圖1所示與經32p標記的HVA1探針進行雜交。質粒上有單一HindⅢ位點，因此用HindⅢ消化基因組DNA釋放出含有HVA1序列的融合片段以及水稻基因組序列。用EcoRⅠ和BamHⅠ消化釋放出含有HVA1cDNA的1．0kb片段。轉基因水稻植株中HVA1蛋白產生的免疫印跡分析在液氮中研磨植物組織並在含有50mM磷酸鈉(pH7．0)，10mMEDTA，0．1％(V／V)TritonX-100，0．1％(W／V)Sarkosyl，10mMβ-巰基乙醇，和25mg／ml苯甲基磺醯氟的抽提液中進行勻漿製備蛋白提取物。將成熟種子切成兩半，將含有胚的那一半種子直接研磨成粉末並在相同抽提液中勻漿化。所述勻漿在室溫5，000xg離心5分鐘。上清液進一步於4℃12，000xg離心15min純化。據Bradford法(1976)用BioRad，(Hercules，CA)染色濃縮物測定蛋白濃度。在SDS-PAGE微凝膠上分離蛋白，用MiniTrans-BlotCell(BioRad)電轉移至PVDF膜上，在含0．05％(V／V)TritonX-100的TBS中用3％(W／V)BSA封閉，與兔抗-HVA1抗體共培育，之後與山羊抗-兔IgG鹼性磷酸酶偶聯劑(BioRad)共培育。二抗用BioRad公司提供的鹼性磷酸酶免疫試劑盒中的4-氮藍四唑氯化物(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸酯(BCIP)進行檢測。印跡濾膜上的免疫反應信號用光密度計(HelenaLaboratoried，Beaumont，TX)進行掃描以定量測定HVA1蛋白的相對含量。用部分純化的HVA1蛋白作估算轉基因水稻組織中HVA1蛋白水平的標準。乾旱和鹽脅迫條件下轉基因植物生長行為的分析用第二代(R1)轉化植株對乾旱和鹽脅迫條件下植株的生長行為進行評價。這些R1植株代表包括同源和異源轉基因植株以及分離的非轉化植株在內的群體。可將野生型水稻植株或者經轉化程序得到的非轉化植株(NT)作為對照材料。在本說明書中它們均特指非轉化的對照植株。培養基中的種子萌發和幼苗生長將30粒分別來自三個轉基因水稻系和兩個非轉化對照植株的R1種子經表面消毒後在25℃黑暗條件下置於三種瓊脂培養基上進行萌發MS，MS+100mMNaCl，和MS+200mM甘露醇。MS培養基僅含礦質鹽，使種子在MS+100mMNaCl或MS+200mM甘露醇培養基上萌發5天隨後轉至MS培養基。為測試幼苗對脅迫條件的反應，使種子在MS培養基上萌發5天。然後將5天齡的幼苗分開，轉至深平皿中的雙層Whatman紙上並分別加入液體MS，MS+100mMNaCl，和MS+200mM甘露醇。幼苗置25℃光照生長並監控它們對脅迫條件的反應5天。土壤中植株生長和脅迫處理用補充有肥料的精細並滅菌的田間土壤來使水稻植株在溫室中生長(白天32℃／夜間22℃，補充光照周期10小時)。常規用這樣的生長條件支持多種水稻變種的正常生長。使種子在MS培養基萌發7天，接著將7天齡幼苗轉至底部開洞的小盆土壤中(8cm×8cm，每盆一株)。小盆置於盛水的扁平託盤中。幼苗接受脅迫處理前要再生長兩周。在此階段，多數3周齡的幼苗長有三片葉子，一些幼苗正長出第四片葉。用來自相同R0轉基因系的不同套R1植株進行了兩次脅迫試驗。在每次試驗中，每次處理採用10株轉基因植株和至少10株非轉化對照植株。(ⅰ)無脅迫不斷從託盤給植物供水。當測量脅迫處理的植株時也測量未處理植株。在此條件下，整個試驗期間轉基因植株和非轉化對照植株均生長良好且未顯示顯著差異。(ⅱ)水脅迫為開始乾旱脅迫，從託盤撤走水。土壤中逐漸而迅速減少的水含量造成一種乾旱狀態。經過5天乾旱脅迫，向植物提供2天水以便萎蔫植株恢復。接著，進行第二輪水脅迫。(ⅲ)鹽脅迫將小盆轉至盛有200mMNaCl溶液的託盤中10天以造成短期嚴重的鹽脅迫。接著，將小盆重又轉回含水龍頭託盤10天以使植株恢復。最初兩天通過從小盆頂端澆水並多次更換託盤中的水使鹽濃度迅速降低。恢復10天之後開始進行供給植物50mMNaCl溶液30天的第二輪鹽脅迫。生長行為的數據收集和統計學分析在開始脅迫處理之前，對每株非轉化對照植株和轉基因植株的起始高度，葉片數目和長度進行測量。在脅迫處理期間和之後，對每株也進行測量。為進行統計分析，每項處理中計算10株被測植株的平均值用以比較轉基因植株和非轉化對照植株。實施例1轉基因水稻植株的產生和分子分析質粒pBY520的結構如圖1所示。大麥LEA基因的eDNA，HVA1，位於水稻肌動胚1基因(AGI)啟動子的下遊。細菌草丁膦乙醯轉移酶基因(bar)的編碼區位於花椰菜花葉病毒(CaMV)35s啟動子下遊。用包裹有pBY520質粒DNA的鎢粒進行轟擊水稻懸浮細胞，它們由濾紙支持並在固體培養基上預培養。三次轉化實驗的結果總結於表Ⅰ。在這些實驗中轟擊33板懸浮細胞。篩選出200個ammoniumglufosinate抗性愈傷組織並將其轉至再生培養基。使63個獨立系植株(120株)再生並生長於溫室。如表Ⅰ所示，85％以上轉基因植株可育，產生了各種數目的種子。一些轉基因系的不育性似與外源基因的存在無關，因為相同比例的不育植株也出現於以不含質粒DNA或以幾種其它基因結構進行轟擊的懸浮細胞所作的平行試驗中。bar基因編碼的草甘膦乙醯轉移酶能夠解毒以草甘膦為基礎的殺蟲劑。首先測試29系植株的殺蟲劑抗性。當塗有0．5％商業殺蟲劑BASTATM時，轉基因植株的葉片表現出完全抗性，而非轉化植株的葉片變黃並死亡。在測殺蟲劑抗性的29系植株中，90％有抗性。用以HVA1cDNA片段作探針的DNA印跡雜交對相同的29系進一步分析，80％顯示預期的雜交帶型。消化轉基因水稻植株中質粒pBY520或基因組DNA產生含HVA1編碼區的1．0kb片段。在分析的29系中，23系含有預期的1．0kb的雜交帶。除預期的1．0-kb雜交帶外所有轉基因植株的雜交帶型獨一無二，說明這些轉基因系來自獨立的轉化。DNA印跡雜交的結果與那些殺蟲劑抗性測試的結果相一致，因此將在同一質粒上的篩選標記基因和HVA1基因均有效地共聚合進了水稻基因組。採用同時含篩選標記基因和HVA1基因的質粒並配合嚴密的篩選程序有助於高頻率再生轉基因植株。實施例2R0轉基因水稻植株中HVA1蛋白的累積分析在DNA印跡雜交數據的基礎上挑選一些第一代再生(R0)轉基因系，分析其中HVA1蛋白的累積。從葉片和根組織製備蛋白提取物。用抗純化的大麥HVA1蛋白的多克隆抗體檢測HVA1蛋白。在不同轉基因系的葉片組織中，檢測到SDS-PAGE凝膠上對應於HVA1蛋白的27KD的單條帶。也在根中輕易檢測到HVA1蛋白的累積，雖然較之葉片組織水平相對要低。在不同轉基因系中根中HVA1蛋白累積的相對水平與葉片組織中的相對應。非轉化植株的蛋白提取物未顯示27-KD蛋白條帶，從轉基因植株或從非轉化植株的蛋白提取物中也未檢測到另外的其它大小的條帶。用部分純化的HVA1蛋白備份作標準，估測累積於不同轉基因系葉片和根組織中的HVA1蛋白水平在可溶性總蛋白量的0．3％～2．5％之間(表Ⅱ)。為檢測成熟轉基因水稻種子中，尤其是胚中HVA1蛋白的累積，從含胚的那一半種子製備蛋白提取物並用免疫印跡法分析。在成熟轉基因種子的蛋白提純物中未檢測到相應於HVA1蛋白的27-KD條帶。但是，分別檢測到兩條低分子量條帶，20KD和13KD。因為早在先前的研究中從成熟水稻種子中檢測到一個與大麥HVA1基因高度同源的高水平mRNA轉錄物(Hong等，1992)，這兩種蛋白可能代表在種子晚期發育階段累積的內源水稻LEA或似-LEA蛋白。在成熟水稻種子中由於缺乏HVA1蛋白的累積可能由於種子開始脫水後Act1啟動子的活性變低(或缺乏)。實施例3轉基因水稻植株對乾旱和鹽脅迫抗性增強以上敘述結果顯示由水稻Act1強啟動子調控的大麥HVA1基因導致轉基因水稻植株營養性組織中HVA1蛋白的高水平累積。大多數首代轉基因水稻植株較之通過轉化程序得到的非轉化植株或野生型植株形態發生正常。如前所述，大多數植株可育。這些結果相加顯示HVA1蛋白的累積對於水稻植株的生長和發育未千萬不利影響。為了解HVA1蛋白的高水平累積是否會對脅迫條件下轉基因水稻植株的生長行為有任何益處，用第二代植株(R1)對處於水和鹽脅迫條件下的生長行為作了評估。用野生型水稻植株的種子或通過轉化程序得到的非轉化植株的種子作為對照。滲透和鹽脅迫條件下培養基中的種子萌發及幼苗生長在MS培養基中，轉基因和對照株的種子均萌發良好，也未見它們的幼苗生長有差異。在MS+100mMNaCl或MS+200mM甘露醇中，轉基因種子和對照種子均緩慢萌發(根和莖的發生延遲2天)，但未觀察到轉基因和對照種子間有差異。在兩種脅迫培養基中5天後，將萌發的種子(有0．2-0．5cm長的莖)轉至MS培養基。轉基因和對照幼苗均恢復並繼續正常生長。但是，在此恢復階段，轉基因幼苗生長較快，一星期後轉基因幼苗的莖也較那些對照幼苗的明顯要長。轉基因幼苗也較對照幼苗多生出1到3條根。當種子在MS培養基萌發並持續生長時未觀察到非轉化對照株與轉基因株有明顯差異(表Ⅲ)。用在MS培養基中種子萌發的5天齡幼苗測試它們對鹽脅迫的反應。轉基因和對照幼苗均對鹽脅迫非常敏感。在MS+100mMNaCl中，幼苗漸漸在一周內萎蔫。但是，較之對照幼苗轉基因幼苗延遲萎蔫。在MS+100mMNaCl中的最初三天，一半以上的對照幼苗變萎蔫，而僅有極少部分轉基因幼苗變萎蔫。水(乾旱)脅迫條件下土壤中轉基因植株的生長行為以上實驗表明轉基因植株和對照植株對脅迫條件處理的反應不同。用在土壤中生長的3周齡植株做廣泛的脅迫試驗。土壤中持續無脅迫時，在整個試驗期間未觀察到轉基因株和對照株生長行為之間有明顯差異。一旦從託盤撤除水，土壤中逐漸但迅速的水減少造成一個乾旱狀態。轉基因株和對照株對此乾旱條件的反應明顯不同。處於相同發育階段的轉基因株的葉片較之對照株萎蔫發生晚1到2天。乾旱脅迫4到5天後，對照和轉基因株的葉片均已萎蔫，但轉基因株的萎蔫程度輕得多。轉基因和對照株之間對於水饋乏反應的不同也反應在乾旱脅迫的頭3天中它們幼葉的生長率(葉片長度的增加)。像轉基因株一樣，乾旱脅迫抑制對照株幼葉的生長。但是，轉基因株較之對照株維持較高的生長率(表Ⅳ)。將乾旱脅迫植株重加水後，轉基因株較之對照株表現也較好的恢復並繼續較快生長。轉基因株受到乾旱脅迫較少傷害並且看起來更健康，而非轉化株(NT)的舊葉片和幼葉頂端表現出恢復不好並逐漸死亡。表Ⅳ中的數據表明受脅迫植株經過四個乾旱脅迫5天接著用水恢復2天的循環後平均的株高和根鮮重。總之，轉基因株較之對照株在乾旱脅迫條件下它們的生長行為顯示了明顯的優勢。生長優勢尤其明顯地表現在根的生長上。鹽脅迫條件下土壤中轉基因植株的生長行為嚴重的鹽脅迫(200mMNaCl)明顯抑制轉基因和對照植株的生長，雖然植株不象乾旱條件下萎蔫得那樣快。但是，在鹽脅迫早期(第0天到第5天)轉化株較對照株維持高得多的生長率(表Ⅳ)。鹽脅迫傷害的早期症狀，如萎蔫，曬白和葉尖死亡，首先在老葉出現。植株底部的葉片首先萎蔫可死亡。在後期，幼葉發展為壞死症狀並從葉尖開始萎蔫和變幹。這些症狀在轉化株中又一次較在對照株中出現和發展得較慢。當大多數對照株底部的兩片葉變萎蔫時，大多數轉化株底部的第一片葉僅表現輕微萎蔫。轉化株幼葉的萎蔫總是較對照株的輕度。撤走鹽脅迫時，轉化株較非轉化對照株表現更好的恢復。表Ⅴ中數據也表明了開始鹽脅迫處理後30天受脅迫植株的平均莖高和根鮮重。轉化株再次顯示在擴展的脅迫條件下較對照株有明顯較好的行為。在持續嚴重的鹽脅迫下，大多數非轉化株漸漸死亡，而大多數轉化株可存活更長時間。實施例4R1轉基因水稻植株中HVA1蛋白的累積分析在脅迫試驗最後對來自兩個R0轉基因系的R1植株進行HVA1蛋白累積分析。分析每個R0轉基因系中的8株。在每一系中，8株R1中有2株的HVA1蛋白未檢出，這要歸於轉化基因在這些第二代植株中的分離。脅迫處理嚴重抑制和傷害那些缺乏HVA1蛋白累積的R1植株。這些植株表現為第一階段鹽脅迫後恢復不好並在持續的脅迫條件下漸漸死亡。在表現脅迫抗性的所有存活R1轉基因植株中均檢測到HVA1蛋白的累積。雖然已在此詳細描述優選的實施例，但是很顯然對相關領域的技術人士而言進行各種修飾，添加，取代等並不背離本發明宗旨，因而認為這些是在以下權利要求書中限定的本發明範疇之內。參考文獻AkbarM，etal．，Breedingforsoilstress．InProgressinRainfedLowlandRice．InternationalRiceResearchInstitute，Manila，Philippines，pp263-272(1986a)．AkbarM，eta1．，Geneticsofsalttoleranceinrice．InRiceGenetics．InternationalRiceResearchInstitute，Manila，Philippines，pp399-409(1986b)．BakerJ，etal．，Sequenceandcharacterizationof6LEAproteinsandtheirgenesfromcotton．PlantMolBiol11277-291(1988)．BlackmanSA，etal．，Maturationproteinsassociatedwithdesiccationtoleranceinsoybean．PlantPhysiol96868-874(1991)．BlackmanSA，etal．，Maturationproteinsandsugarsindesiccationtoleranceofdevelopingsoybeanseeds．PlantPhysiol100225-230(1992)．BradfordKJandChandlerPM，Expressionof「dehydrin-like」proteinsinembryosandseedlingsofZiaaniapalustrisandOryzasativeduringdehydration．PlantPhysiol99488-494(1992)．BradfordM，Arapidandsensitivemethodforquantitationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dyebinding．AnalBiochem72248-254(1976)．CaoJ，etal．，Regenerationofherbicideresistanttransgenicriceplantsfollowingmicroprojectile-mediatedtransformationofsuspensionculturecells．PlantCellRep11586-591(1992)．CaoJ，etal．，Assessmentofricegenetictransformationtechniques．InRiceBiotechnology(KhushGSandToenniessen，GHeds．)．C．A．B．International，InternationalRiceResearchInstitute，Manila，Philippines，pp．175-198(DATE)．ChandlerPMandRobertsonM，Geneexpressionregulatedbyabscisicacidanditsrelationtostresstolerance．AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol45113-141(1994)．CloseTJ，etal．，Aviewofplantdehydrinsusingantibodiesspecifictothecarboxyterminalpeptide．PlantMolBiol23279-286(1993)．CurryJ，etal．，SequenceanalysisofacDNAencodingagroup3LEAmRNAinduciblebyABAordehydrationstressinwheat．PlantMolBiol161073-1076(1991)．CurryJandWalker-SimmonsMK，Unusualsequenceofgroup3LEA(Ⅱ)mRNAinduciblebydehydrationstressinwheat．PlantMolBiol21907-912(1993)．DanylukJ，et．al．，Differentialexpressionofageneencodinganacidicdehydrininchillingsensitiveandfreezingtolerantgramineaespecies．FEBSLett34420-24(1994)．DittaG，etal．，BroadHostRangeDNACloningSystemforGram-negativeBacteriaConstructionofaGeneBankofRhizobiummeliloti．ProcNatlAcadSciUSA777347-7351(1981)．DureLⅢ，TheLEAproteinsofhigherplants．InDPSVerma，ed，ControlofPlantGeneExpression．CRCPress，BocaRaton，Florida，pp325-335(1992)．DureLⅢ，Arepeating11-meraminoacidmotifandplantdesiccation．PlantJ3363-369(1993)．DureLⅢ，etal．，CommonaminoacidsequencedomainsamongtheLEAproteinsofhigherplants．PlantMolBiol12475-486(1989)．DureLⅢ，DevelopmentalbiochemistryofcottonseedembryogenesisandgerminationChangingmRNApopulationsasshowninvitroandinvivoproteinsynthesis．Biochemistry204162-4168(1981)．EpsteinE，etal．，Salinecultureofcropsageneticapproach．Science210399-404(1980)．FranzG，etal．，Molecularandgeneticanalysisofanembryonicgene，DC8，fromDacuscarota[L．]．MolGenGenet218143-151(1989)．GreenwayHandMunnsR，Mechanismsofsalttoleranceinnonhalophytes．AnnuRevPlantPhysiol31149-190(1980)．HaradaJ，etal．，Unusualsequenceofaabscisicacid-induciblemRNAwhichaccumulateslateinBrassicanapusdevelopment．PlantMolBiol12395-401(1989)．HieiY，etal．，Efficienttransformationofrice(OryzasativaL．)mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA．ThePlantJournal6271-282(1994)．HolmstromK-O，etal．，ProductionoftheEscherichiacolibetaine-aldehydedehydrogenase，anenzymerequiredforthesynthesisoftheosmoprotectantglycinebetaine，intransgenicplants．PlantJ6749-758(1994)．HolstersM，etal．，TransfectionandTransformationofAgrobacteriumtumefaciens．MolGenGenet163181-187(1978)．HongB，RegulationofsynthesisandpotentialfunctionofanABA-andstress-inducedproteininbarley．PhDthesis，WashingtonUniversity，StLouis，Missouri(1991)．HongB，etal．，Developmentalandorgan-specificexpressionofanABA-andstress-inducedproteininbarley．PlantMolBiol18663-674(1992)．HongB，etal．，CloningandcharacterizationofacDNAencodingamRNArapidlyinducedbyABAinbarleyaleuronelayers．PlantMolBiol11495-506(1988)．HsingYC，etal．，NucleotidesequencesofasoybeancomplementaryDNAencodinga50-kilodaltonlateembryogenesisabundantprotein．PlantPhysiol99353-355(1992)．IturriagaG，etal．，Expressionofdesiccation-relatedproteinsfromtheresurrectionplantCraterostigmaplantagineumintransgenictobacco．PlantMolBiol20555-558(1992)．MackeyC．J．etal．，TransgenicmaizeinTransgenicPlants(KungSDandWuR．eds)，vol．2，pp．21-33(1993)．McElroyD，etal．，Isolationofanefficientactinpromoterforuseinricetransformation．ThePlantCell2163-171(1990)．MoonsA，etal．，Molecularandphysiologicalresponsestoabscisicacidandsaltsinrootsofsalt-sensitiveandsalt-tolerantIndicaricevarieties．PlantPhysiol107177-186(1995)．MundyJandChuaN-H，Abscisicacidandwaterstressinducetheexpressionofnovelricegene．EMBOJ72279-2286(1988)．MurashigeTandSkoogF，Arevisedmediumforrapidgrowthandbioassayswithtobaccotissuecultures．PhysiolPlant15473-497(1962)．Pilon-SmitsEAH，etal．，Improvedperformanceoftransgenicfructan-accumulatingtobaccounderdroughtstress．PlantPhysiol107125-130(1995)．RathinasabapathiB，etal．，Metabolicengineeringofglycinebetainesynthesisplantbetainealdehydedehydrogenaseslackingtypicaltransitpeptidesaretargetedtotobaccochloroplastswheretheyconferbetainealdehyderesistance．Planta193155-162(1994)．RiedJLandWalker-SimmonsMK，Group3lateembryogenesisabundantproteinsindesiccation-tolerantseedlingsofwheat(TriticumaestivumL．)．PlantPhysiol102125-131(1993)．RobertsJK，etal．，Cellularconcentrationsanduniformityofcell-typeaccumulationoftwoLeaproteinsincottonembryos．PlantCell5769-780(1993)．SeffensWS，etal．，Molecularanalysisofaphylogeneticallyconservedcarrotgenedevelopmentalandenvironmentalregulation．DevelGenet1165-76(1990)．ShenWandFordeBG，EfficientTransformationofAgrobacteriumspp．byHighVoltageElectroporation．NucleicAcidsRes178385(1989)．SimonR，etal．，ABroadHostRangeMobilizationSystemforinvivoGeneticEngineeringTransposonMutagenesisinGram-negativeBacteria．Biotechnology1784-791(1982)．SkriverKandMundyJ，Geneexpressioninresponsetoabscisicacidandosmoticstress．PlantCell2503-512(1990)．StillDW，etal．，Developmentofdesiccationtoleranceduringembryogenesisinrice(Oryzasativa)andwildrice(Zizaniapalustris)．Dehydrinexpression，abscisicacidcontent，andsucroseaccumulation．PlantPhysiol104431-438(1994)．StraubPF，etal．，StructureandpromoteranalysisofanABA-andstress-regulatedbarleygene，HVA1．PlantMolBiol26617-630(1994)．TarczynskiMC，etal．，Stressprotectionoftransgenictobaccobyproductionoftheosolytemannitol．Science259508-510(1993)．ThornburgRW，etal．，Wound-inducibleexpressionofapotatoinhibitorⅡ-chloramphenicolacetyltransferasegenefusionintransgenictobaccoplants．ProcNatlAcadSciUSA84744-748(1987)．WhiteJetal．，AcassettecontainingthebargeneofStreptomyceshygroscopicasaselectablemarkerforplanttransformation．NucleicAcidsRes181062(1990)．YanceyPH，etal．，Livingwithwaterstressevolutionofosmolytesystem．Science2171214-1222(1982)．Yamaguchi-ShinozakiK，etal．，Fourtightly-linkedrabgenesaredifferentiallyexpressedinrice．PlantMolBiol1429-39(1989)．zhangWG，etal．，AnalysisofriceActl5＇regionactivityintransgenicriceplants．ThePlantCell31155-1165(1991)．zhaoX，etal．，Genomic-specificrepetitivesequencesinthegenusOryza．TheorApplGenet78201-209(1989)．權利要求1．用於再生抗水或抗鹽脅迫穀類植物的穀類植物細胞或原生質體的產生方法，它包括用編碼晚期胚胎發生豐富蛋白的核酸轉化穀類植物細胞或原生質體。2．權利要求1的方法，其中所述穀類植物細胞或原生質體源於水稻。3．權利要求1的方法，其中所述晚期胚胎發生豐富蛋白是第3組晚期胚胎發生豐富蛋白。4．權利要求1的方法，其中所述編碼晚期胚胎發生豐富蛋白的核酸是大麥的HVA1基因。5．權利要求1的方法，其中所述轉化包括在有利於粒子穿過細胞內部的條件下向所述穀類植物細胞發射粒子；且將含有編碼晚期胚胎發生豐富蛋白的核酸的質粒導入細胞內部。6．權利要求5的方法，其中所述質粒與粒子相結合，由此將質粒與粒子一起轉入細胞或原生質體內部。7．權利要求5的方法，其中所述質粒被命名為pBY520。8．權利要求1的方法，它進一步包括將轉化的穀類植物細胞或原生質體再生為轉基因穀類植物。9．用權利要求8的方法生產的轉基因穀類植物。10．權利要求9中的轉基因穀類植物產生的種子。11．增強穀類植物對水或鹽脅迫條件抗性的方法，所述方法包括提高所述穀類植物中晚期胚胎發生豐富蛋白的水平。12．經編碼晚期胚胎發生豐富蛋白核酸轉化的穀類植物細胞或原生質體，其中所述蛋白在由所述穀類植物細胞或原生質體再生的穀類植物上可形成對水或鹽脅迫的抗性。13．權利要求12的穀類植物細胞，其中所述穀類植物細胞或原生質體來自水稻。14．權利要求12的穀類植物細胞或原生質體，其中所述晚期胚胎發生豐富蛋白是第3組晚期胚胎發生豐富蛋白。15．權利要求12的穀類植物細胞或原生質體，其中所述編碼晚期胚胎發生豐富蛋白的核酸是大麥的HVA1基因。16．權利要求12的穀類植物細胞或原生質體，其中所述穀類植物細胞或原生質體包括編碼啟動子的核酸，編碼所述晚期胚胎發生豐富蛋白的所述核酸的表達由所述啟動子調控。17．權利要求16的穀類植物細胞或原生質體，其中所述啟動子是水稻肌動蛋白1基因啟動子。18．權利要求12的穀類植物細胞或原生質體，其中所述穀類植物細胞或原生質體包括編碼篩選標記的核酸。19．權利要求18的穀類植物細胞或原生質體，其中所述編碼篩選標記的核酸是bar基因。20．權利要求19的穀類植物細胞或原生質體，其中所述穀類植物細胞或原生質體包括編碼花椰菜花葉病毒35S啟動子的核酸，其中所述bar基因的表達由花椰菜花葉病毒35S啟動子調控。21．權利要求12的穀類植物細胞或原生質體再生的轉基因穀類植物。22．權利要求21的轉基因穀類植物產生的種子。23．經編碼晚期胚胎發生豐富蛋白的核酸轉化的轉基因穀類植物，其中所述蛋白可形成植物對水或鹽脅迫的抗性。24．權利要求23的轉基因穀類植物，其中穀類植物指水稻。25．權利要求23的轉基因穀類植物，其中所述晚期胚胎發生豐富蛋白是第3組晚期胚胎發生豐富蛋白。26．權利要求23的轉基因穀類植物，其中所述編碼晚期胚胎發生豐富蛋白的核酸是大麥的HVA1基因。27．權利要求23的轉基因穀類植物，其中所述轉基因穀類植物包括編碼啟動子的核酸，其中所述編碼晚期胚胎發生豐富蛋白的核酸的表達由所述啟動子調控。28．權利要求27的轉基因穀類植物，其中所述啟動子是水稻肌動蛋白1基因啟動子。29．權利要求23的轉基因穀類植物，其中所述轉基因穀類植物包括編碼篩選標記的核酸。30．權利要求29的轉基因穀類植物，其中所述編碼篩選標記的核酸是bar基因。31．權利要求30的轉基因穀類植物，其中所述轉基因穀類植物包括編碼花椰菜花葉病毒35S啟動子的核酸，其中所述bar基因的表達由花椰菜花葉病毒35S啟動子調控。32．權利要求23的轉基因穀類植物產生的種子。33．一種種子，它萌發後可產生權利要求23的轉基因穀類植物。34．用使穀類植物產生對水或鹽脅迫抗性的質粒轉化的轉基因穀類植物，所述載體包括編碼晚期胚胎發生豐富蛋白的第一核酸；編碼啟動子的第二核酸，所述第二核酸位於第一核酸的5』端並且所述第二核酸調控所述第一核酸的表達；編碼終止信號的第三核酸，所述第三核酸位於所述第一核酸的3』端；編碼篩選標記的第四核酸，所述第四核酸位於所述第三核酸的3』端；編碼啟動子的第五核酸，所述第五核酸位於所述第四核酸的5』端和所述第三核酸的3』端，所述第五核酸調控所述第四核酸的表達；以及編碼終止信號的第六核酸，所述第六核酸位於所述第四核酸的3』端。35．權利要求34的轉基因穀類植物，其中所述質粒被命名為pBY520。全文摘要本發明涉及經編碼晚期胚胎發生豐富蛋白核酸轉化用於再生對水脅迫或鹽脅迫具有抗性的穀類植物的穀類植物細胞或原生質體的生產方法。也提供編碼晚期胚胎發生豐富蛋白核酸轉化的轉基因穀類植物或穀類植物細胞或原生質體。將大麥的LEA蛋白基因HVA1(HordeumvulgareL.)轉入水稻(OryzasativaL.)植物。所得轉基因水稻植物的葉片和根中累積HVA1蛋白。轉基因水稻表現出明顯增強的對水脅迫(乾旱)和鹽脅迫的抗性。文檔編號C12N15/29GK1204364SQ96198890公開日1999年1月6日申請日期1996年10月9日優先權日1995年10月12日發明者R·J·吳,T·H·D·霍申請人:康乃爾研究基金會有限公司,華盛頓大學