基於雙重定量PCR的奶牛早期妊娠診斷引物對、探針及方法與流程
2023-06-06 23:03:21 2
本發明涉及分子生物學和核酸檢測
技術領域：
，具體涉及一種基於雙重定量PCR的奶牛早期妊娠診斷引物對、探針及方法。
背景技術：
：妊娠診斷是奶牛繁殖工作中至關重要的一部分，快速、準確並且簡捷地對奶牛進行早期妊娠診斷可以提前排查空懷牛，減少空懷導致的飼料、能源、人力等方面的消耗，同時也可以對妊娠牛實施精準飼養，減少早期流產事件的發生。利用分子生物學技術對奶牛進行妊娠診斷，由於該技術具有採樣方便、經濟可靠、可批量化操作等諸多優越性而被生產者接納並逐步廣泛使用，其中比較成熟的商業化試劑盒是妊娠相關糖蛋白(PAG)ELISA檢測試劑盒。但是，該方法最早在奶牛人工授精後28天才能準確判斷奶牛是否受孕，而實際生產中，部分奶牛在人工授精後如果沒有成功受配，一個情期(即21天)之後會出現返情，因此，如何利用分子生物學的技術在奶牛人工授精後21天之前進行妊娠診斷逐漸成為廣大奶牛養殖者以及科研工作者關注的重點。目前，定量PCR技術由於其反應時間短、靈敏性高等特點越來越受到人們的青睞。專利號為2014106572061的發明專利提供了奶牛早期妊娠的螢光定量PCR檢測試劑盒及檢測方法，該發明通過螢光定量PCR技術檢測奶牛人工授精後18天外周血白細胞中基因的表達水平來進行妊娠診斷，實現在奶牛人工授精後一個情期內判別妊娠牛和空懷牛。但是，該發明局限於單重螢光定量PCR技術，即單管擴增一次只能檢測一種基因：目的基因或者內參基因，同一個血液樣本至少需要分兩次檢測兩個基因的表達量，這無疑增加了工作量，而且需要提供的樣本量也會增加，檢測的成本也會加大。技術實現要素：針對現有技術中存在的缺陷，本發明的目的在於提供一種基於雙重定量PCR的奶牛早期妊娠診斷引物對、探針及方法，可降低反應實際成本，節省反應時間。為達到以上目的，本發明採取的技術方案是：一種基於雙重定量PCR的奶牛早期妊娠診斷的引物對，包括牛ISG15基因、牛RSAD2基因和內參基因β-Actin的特異性引物對，其中：所述牛ISG15基因的引物對是SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示序列；所述牛RSAD2基因的引物對是SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示序列；所述內參基因β-Actin的引物對是SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示序列。本發明還公開了一種基於雙重定量PCR的奶牛早期妊娠診斷的探針，包括牛ISG15基因、牛RSAD2基因和內參基因β-Actin的特異性探針，其中：所述牛ISG15基因的探針是SEQIDNO:3所示序列；所述牛RSAD2基因的探針是SEQIDNO:6所示序列；所述內參基因β-Actin的探針是SEQIDNO:9所示序列。本發明還公開了一種基於雙重定量PCR的奶牛早期妊娠診斷方法，採用TaqMan探針法對兩種目的基因和內參基因進行雙重螢光定量PCR檢測，在單個PCR管內同時進行一種目的基因與內參基因的PCR反應，並在同一塊PCR反應板中同時進行兩種目的基因的PCR反應，根據兩種目的基因的表達差異判斷奶牛早期妊娠。在上述技術方案的基礎上，其中一種所述目的基因為牛ISG15基因，另一種所述目的基因為牛RSAD2基因，所述內參基因為β-Actin。在上述技術方案的基礎上，包括以下步驟：S1，收集血液樣本，採集奶牛發情後人工授精後0天和人工授精後18天的血液樣本1.5-2mL，抗凝，低溫冷藏；S2，提取血液樣本RNA，血液樣本採集後2小時內，用血液總RNA提取試劑盒提取血液樣本中總RNA，並分析RNA樣本濃度與純度，同時檢測RNA完整性，通過質檢的樣本分裝後，低溫保存備用；S3，逆轉錄反應成cDNA，採用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應將從血液樣本中提取的RNA逆轉錄成cDNA；S4，設計與合成引物對和探針，所述牛ISG15基因的引物對是SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示序列；所述牛RSAD2基因的引物對是SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示序列；所述內參基因β-Actin的引物對是SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示序列；所述牛ISG15基因的探針是SEQIDNO:3所示序列；所述牛RSAD2基因的探針是SEQIDNO:6所示序列；所述內參基因β-Actin的探針是SEQIDNO:9所示序列；S5，進行雙重螢光定量PCR檢測血液樣本中牛ISG15基因、牛RSAD2基因和內參基因β-Actin，在單個PCR管內同時檢測牛ISG15基因和內參基因β-Actin，並同時在同一塊PCR反應板中同時檢測牛RSAD2基因和內參基因β-Actin；S6：雙重螢光定量PCR完成後，根據各基因的循環閾值(Ct)計算出基因ISG15和基因RSAD2的相對表達量，並根據相對表達量進行奶牛早期妊娠診斷。在上述技術方案的基礎上，步驟S5中基因ISG15和基因β-Actin的反應體系：2×PremixExTaqMix10μL，各基因採用濃度為10μmol/L的上遊引物和下遊引物各0.2uL，各基因採用濃度為10μmol/L的探針各0.4uL，cDNA模板0.6μL，ddH2O7.8μL，反應體系共20μL；基因RSAD2和基因β-Actin的反應體系：2×PremixExTaqMix10μL，各基因採用濃度為10μmol/L的上遊引物和下遊引物各0.2uL，各基因採用濃度為10μmol/L的探針的各0.4uL，cDNA模板0.6μL，ddH2O7.8μl，反應體系共20μl。在上述技術方案的基礎上，步驟S5中的反應條件為：95℃預變性30秒；95℃變性15秒，61℃退火併延伸30秒，40個循環，在每個循環的61℃退火併延伸階段收集螢光信號。在上述技術方案的基礎上，步驟S6的具體步驟為：S601：計算出檢測血液樣本中目的基因Ct均值與內參基因Ct均值的差值ΔCt；S602：計算出血液樣本中目的基因的相對表達量2-△ΔCt，其中代表人工授精後0天或者18天血液樣本目的基因的Ct均值，代表該血液樣本對應的內參基因的Ct均值；S603：將奶牛人工授精後0天各基因的相對表達量校正為1，人工授精後18天的相對表達量校正為人工授精後0天時相對表達量的倍數；計算出人工授精後18天奶牛血液樣本中牛ISG15基因的相對表達量為X1，牛RSAD2基因的相對表達量為X2；S604：將X1和X2帶入公式P＝1/[1+e-(-6.53+2.830X1+0.866X2)]中，如果P值大於0.680時，即為妊娠。與現有技術相比，本發明的優點在於：1、本發明採用的牛ISG15基因的引物對如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示，探針如SEQIDNO:3所示；牛RSAD2基因的引物對如SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示，探針如SEQIDNO:6所示；內參基因β-Actin的引物對如SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示，探針如SEQIDNO:9所示；採用上述引物對與探針進行雙重螢光定量PCR反應時，目的基因牛ISG15基因或牛RSAD2基因與內參基因β-Actin在同一個PCR管內反應時相互幹擾性極小，並且反應條件一致，從而使得目的基因和內參基因得以在同一個PCR管內反應並同時進行兩種目的基因的PCR反應。2、本發明在同一個PCR管內檢測目的基因與內參基因，減少了模板的使用量，節約模板製作的成本，在一定程度上還可以減輕採樣對奶牛造成的損傷。同時，由於反應管的縮減，反應試劑的成本也會隨之降低。3、本發明可以在同一塊PCR反應板中同時檢測目的基因ISG15和RSAD2的表達，縮短了反應時間；同時，由於雙重定量PCR技術的檢測時間為傳統的SYBOGreen單重螢光定量PCR技術的反應時間的二分之一，提高了檢測的效率。附圖說明圖1為本發明實施例中基於雙重定量PCR的奶牛早期妊娠診斷方法的流程示意圖；圖2為本發明實施例中引物瓊脂糖凝膠檢測電泳結果圖，其中M：DNA相對分子質量標準DL2000；泳道1-2:內參基因β-Actin的PCR擴增產物；泳道3-4：牛ISG15基因的PCR擴增產物；泳道5-6：牛RSAD2基因的PCR擴增產物；圖3為本發明實施例中雙重螢光定量PCR與單重螢光定量PCR反應擴增曲線對比圖；圖4為本發明實施例中妊娠牛雙重螢光定量PCR擴增曲線；圖5為本發明實施例中空懷牛雙重螢光定量PCR擴增曲線。具體實施方式以下結合附圖及實施例對本發明作進一步詳細說明。本發明公開了一種基於雙重定量PCR的奶牛早期妊娠診斷的引物對：包括牛ISG15基因、牛RSAD2基因和內參基因β-Actin的特異性引物對，其中：所述牛ISG15基因的引物對是SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示序列；所述牛RSAD2基因的引物對是SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示序列；所述內參基因β-Actin的引物對是SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示序列。本發明還公開了一種基於雙重定量PCR的奶牛早期妊娠診斷的探針：包括牛ISG15基因、牛RSAD2基因和內參基因β-Actin的特異性探針，其中：所述牛ISG15基因的探針是SEQIDNO:3所示序列；所述牛RSAD2基因的探針是SEQIDNO:6所示序列；所述內參基因β-Actin的探針是SEQIDNO:9所示序列。採用上述引物對與探針進行雙重螢光定量PCR反應時，目的基因牛ISG15基因或牛RSAD2基因與內參基因β-Actin在同一個PCR管內反應時相互幹擾性極小，並且反應條件一致，從而使得目的基因和內參基因得以在同一個PCR管內反應並在同一塊PCR反應板中同時進行兩種目的基因的PCR反應。本發明還公開了一種基於雙重定量PCR的奶牛早期妊娠診斷方法：採用TaqMan探針法對兩種目的基因和內參基因進行雙重螢光定量PCR檢測，在單個PCR管內同時進行一種目的基因與內參基因的PCR反應，並在同一塊PCR反應板中同時進行兩種目的基因的PCR反應，根據兩種目的基因的表達差異判斷奶牛早期妊娠。其中一種所述目的基因為牛ISG15基因，另一種所述目的基因為牛RSAD2基因，所述內參基因為β-Actin。【實施例1】基於雙重定量PCR的奶牛早期妊娠診斷方法參見圖1所示，包括以下步驟：S1，收集血液樣本，採集奶牛發情後人工授精後0天和人工授精後18天的血液樣本1.5-2mL，抗凝，低溫冷藏；S2，提取血液樣本RNA，血液樣本採集後2小時內，用血液總RNA提取試劑盒提取血液樣本中總RNA，並分析RNA樣本濃度與純度，同時檢測RNA完整性，通過質檢的樣本分裝後，低溫保存備用；S3，逆轉錄反應成cDNA，採用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應將從血液樣本中提取的RNA逆轉錄成cDNA；S4，設計與合成引物對和探針，所述牛ISG15基因的引物對是SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示序列；所述牛RSAD2基因的引物對是SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示序列；所述內參基因β-Actin的引物對是SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示序列；所述牛ISG15基因的探針是SEQIDNO:3所示序列；所述牛RSAD2基因的探針是SEQIDNO:6所示序列；所述內參基因β-Actin的探針是SEQIDNO:9所示序列；S5，進行雙重螢光定量PCR檢測血液樣本中牛ISG15基因、牛RSAD2基因和內參基因β-Actin，在單個PCR管內同時檢測牛ISG15基因和內參基因β-Actin，並同時在同一塊PCR反應板中同時檢測牛RSAD2基因和內參基因β-Actin；S6：雙重螢光定量PCR完成後，根據各基因的循環閾值(Ct)計算出基因ISG15和基因RSAD2的相對表達量，並根據相對表達量進行奶牛早期妊娠診斷。步驟S5中基因ISG15和基因β-Actin的反應體系：2×PremixExTaqMix10μL，各基因採用濃度為10μmol/L的上遊引物和下遊引物各0.2uL，各基因採用濃度為10μmol/L的探針各0.4uL，cDNA模板0.6μL，ddH2O7.8μL，反應體系共20μL；基因RSAD2和基因β-Actin的反應體系：2×PremixExTaqMix10μL，各基因採用濃度為10μmol/L的上遊引物和下遊引物各0.2uL，各基因採用濃度為10μmol/L的探針的各0.4uL，cDNA模板0.6μL，ddH2O7.8μL，反應體系共20μL。步驟S5中的反應條件為：95℃預變性30秒；95℃變性15秒，61℃退火併延伸30秒，40個循環，在每個循環的61℃退火併延伸階段收集螢光信號。步驟S6的具體步驟為：S601：計算出檢測血液樣本中目的基因Ct均值與內參基因Ct均值的差值ΔCt；S602：計算出血液樣本中目的基因的相對表達量2-△ΔCt，其中代表人工授精後0天或者18天血液樣本中目的基因的Ct均值，代表該血液樣本對應的內參基因的Ct均值；S603：將奶牛人工授精後0天各基因的相對表達量校正為1，人工授精後18天的相對表達量校正為人工授精後0天時相對表達量的倍數；計算出人工授精後18天奶牛血液樣本中牛ISG15基因的相對表達量為X1，牛RSAD2基因的相對表達量為X2；S604：將X1和X2帶入公式P＝1/[1+e-(-6.53+2.830X1+0.866X2)]中，如果P值大於0.680時，即為妊娠。本發明在同一個PCR管內檢測目的基因與內參基因，減少了模板的使用量，節約模板製作的成本，在一定程度上還可以減輕採樣對奶牛造成的損傷。同時，由於反應管的縮減，反應試劑的成本也會隨之降低。本發明可以在同一塊PCR反應板中同時檢測目的基因ISG15和RSAD2的表達，縮短了反應時間；同時，由於雙重螢光定量PCR技術的檢測時間為傳統的SYBOGreen單重螢光定量PCR技術的反應時間的二分之一，提高了檢測的效率。【實施例2】基於雙重定量PCR的奶牛早期妊娠診斷方法的準確性試驗1、引物驗證將冷凍保存的雙重螢光定量PCR的準確性試驗的血液樣本用步驟S4中的引物對和探針進行PCR擴增，其反應體系為：PremixTaqTM10uL,濃度為10μmol/L的上、下遊引物各0.2uL，cDNA模板0.6μL，最後用ddH2O補至20μL。其反應條件為：94℃預變性3分鐘，94℃變性30秒，61℃退火30秒；72℃延伸25秒，共30個循環；最後72℃10分鐘。用瓊脂糖凝膠(1.2％)電泳檢測PCR產物。結論：參見圖2所示，定量PCR擴增的凝膠電泳圖顯示在擴增的過程中無引物二聚體，也沒有雜帶，可以用於下一步的定量PCR檢測。2、雙重螢光定量PCR反應與單重螢光定量PCR反應的準確性比較在同一塊PCR反應板中同時檢測每個血液樣本中牛ISG15基因，牛RSAD2基因，內參基因β-Actin，牛ISG15基因和內參基因β-Actin,牛RSAD2基因和內參基因β-Actin。其中，單重螢光定量PCR反應體系為：2×PremixExTaqMix10μL，濃度為10μmol/L的上下遊引物各0.2uL，濃度為10μmol/L的探針0.4uL，cDNA模板0.6μL，最後用ddH2O補至20μL。雙重螢光定量PCR反應體系：以牛ISG15基因和內參基因β-Actin為例，2×PremixExTaqMix10μL，濃度為10μmol/L的牛ISG15基因和內參基因β-Actin的上下遊引物各0.2uL(10μmol/L)，濃度為10μmol/L的牛ISG15基因和內參基因β-Actin對應的探針0.4uL，cDNA模板0.6μL，最後用ddH2O補至20μL。於CFXConnect螢光定量PCR儀擴增，反應條件為：95℃預變性30秒；95℃變性15秒，61℃退火併延伸30秒，40個循環，在每個循環的61℃退火併延伸階段收集螢光信號。實時分析軟體計算每個血液樣本的循環閾值(Ct)，參見圖3所示，比較相同血液樣本單重螢光定量PCR檢測與雙重螢光定量PCR檢測時的△Ct。根據步驟S604中的檢測標準：即將ISG15(X1)和RSAD2(X2)基因的相對表達量代入公式P＝1/[1+e-(-6.53+2.830X1+0.866X2)]，當P大於0.680時為妊娠。對所有血液樣本進行判斷，並且與實驗室廣泛使用的SYBOGreen技術檢測血液樣本中單個牛ISG15基因和單個牛RSAD2基因的表達來進行妊娠診斷進行準確性比較。其中表1為單重螢光定量PCR檢測ISG15和RSAD2基因的檢測結果，表2為雙重螢光定量PCR檢測ISG15和RSAD2基因的檢測結果。表1：單重螢光定量PCR檢測ISG15和RSAD2基因的Ct值樣本ISG15RSAD2β-ActinΔCt(ISG15)ΔCt(RSAD2)126.0229.1922.913.116.28226.3629.7321.414.948.32326.8329.4219.567.279.86433.1835.5526.117.079.44531.1731.6723.008.178.67629.1832.2721.417.7710.85表2：雙重螢光定量PCR檢測ISG15和RSAD2基因的Ct值結論：從表2中可以看出，同一樣本在進行雙重螢光定量PCR檢測時，在牛ISG15基因和內參基因β-Actin以及牛RSAD2基因和內參基因β-Actin這兩種組合下，內參基因β-Actin的Ct很穩定，差值小於0.6，說明本次試驗的重複性比較好。比較表1和表2，結果顯示，相同血液樣本雙重螢光定量PCR檢測比單重螢光定量PCR檢測的Ct值高0～2.36，但是，相同血液樣本雙重螢光定量PCR檢測與單重螢光定量PCR檢測的ΔCt(牛ISG15基因)值相差-0.84～0.02，ΔCt(牛RSAD2基因)值相差-1.23～0.04，表明雙重螢光定量PCR反應的過程中，目的基因與內參基因的引物特異性較高，之間的相互競爭小；目的基因與內參基因的螢光探針交叉幹擾比較小，整體結果顯示，雙重定量PCR檢測方法比較穩定。3、利用雙重螢光定量PCR進行妊娠診斷的準確性檢測對經直腸檢查確定為妊娠牛(19頭)和空懷牛(17頭)的血液樣本進行了擴增，擴增曲線如圖4和圖5所示。以2-△ΔCt表示血液樣本中目的基因mRNA相對表達量，根據本發明的早期妊娠診斷方法，對36頭奶牛的樣本進行了檢測。利用雙重螢光定量PCR方法檢測經直腸檢查確定為妊娠的19頭牛，結果為：18頭為妊娠，1頭為空懷，妊娠牛檢測的準確性為94.73％；利用雙重螢光定量PCR方法檢測經直腸檢查確定為空懷的17頭牛，結果為16頭為空懷，1頭為妊娠，空懷牛的準確性為94.12％。結論：本發明應用於奶牛的早期妊娠診斷，檢測的靈敏性與單重螢光定量PCR技術一致，檢測的準確性為94.12％，能滿足奶牛生產中對於妊娠診斷的要求。本發明不局限於上述實施方式，對於本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為本發明的保護範圍之內。本說明書中未作詳細描述的內容屬於本領域專業技術人員公知的現有技術。當前第1頁1 2 3