北冬蟲夏草菌絲體發酵工藝的製作方法

2023-06-07 10:11:21

專利名稱：北冬蟲夏草菌絲體發酵工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及人工分離培養冬蟲夏草菌絲技術，具體地說是一種採用生物發酵培養北冬蟲夏草菌絲粉體的方法。
北冬蟲夏草，也稱蛹蟲草，與冬蟲夏草同屬麥角菌科，蛹蟲草是冬蟲夏草的模式種。成分、藥用價值同冬蟲夏草，是我國傳統的藥用食用佳品。1757年始載於《本草從新》，《藥性考》，均記載＂入肺，腎二經＂。古醫書更有許多記載，味甘、性溫、止血化痰、秘精益氣、專保命門、陰陽雙補、壯水生金等等。到近代人們對蟲早夏草有了更多的認識，《現代實現中藥》記載適於肺結核、老人衰弱、貧血虛弱等症。近年通過大量藥理試驗證明，具有降壓降脂作用，臨床用於心律失常，尤其北冬蟲夏草含有核苷類抗菌素(3′-脫氧腺苷)，能抗癌、抑菌，增強免疫功能。
天然蟲草生長環境特殊，生長周期長，加之人工過量採集，自然環境破環，產量逐年下降。為滿足市場需要，擴大藥源，除人工種殖外，採用大規模培養冬蟲草菌絲體是解決藥源的有效途徑，一直是有關部門極為關注和急待解決的問題。
本發明的目的是提供一種採用液體深層發酵大規模培養北冬蟲夏草菌絲的方法，以解決藥源緊缺的局面，滿足需求。
北冬蟲夏草生長環境及形態特徵採自長白山延山山脈地區向陽坡，針闊葉混交林地帶，海拔200～400m，棕色森林上，土壤肥沃，疏鬆，土表層為黑褐色腐殖土，土壤溫度15～20％，土壤pH6.0左右，蛹體大部距土表5～10cm土層中，子實體多發生在6～8月，8月下旬柘死。頭孢菌寄生在蟲、蛹或繭上，其子座大部從寄主的頭部或近腹部長出1～3個，長短不一，3～7cm，扁平，金黃色，頭部長橢園型1-1.5×0.3-0.5cm，在解剖鏡下能觀察到有許多為乳頭狀的子囊殼外突。本新鮮北冬蟲夏草子實體能育部位分離得到純菌，經回接感染試驗培育出與自然形態特徵一致的子座，鑑定為頭孢黴屬(cephalosporium)，蛹草頭孢(Cephlosporium militaris，Kobaysi)。
本發明的工藝方法是將取自新鮮北冬蟲夏草子實體並獲得的蛹草頭孢菌種，在PDA斜眷面培養基上恆溫培養7天製成斜面菌種；菌種接入含培養基的搖瓶內振蕩3～4天；經純度檢查6～10％，並種含培養基的種子罐內，於罐溫25～27℃、風量1∶0.4、攪速180～200rpm、罐壓0.05MPa條件下，培養38～45小時；以接種量為6～10％進入發酵罐，罐溫25～27℃、風量1∶0.1，罐壓0.05MPa，攪拌速130～140rpm培養55～65小時；然後脫水、乾燥製成幹菌體。其工藝流程為保存菌種→斜面菌種→種子瓶→種子罐→發酸罐→脫水→乾燥→粉碎→分析→儲存。
菌株特徵在PDA培養基上，三天可見白色絨毛狀菌稱，七天後可長滿斜面，兩周後可長出厚菌膜，見光可產生黃色素，有時在斜面上長出4～5cm的子座。菌絲有隔，在固體斜面上7天產生分生孢子，在液體培養基上，40小時開始產生分生孢子，孢子橢圓型或長橢圓型。
本發明給出的方法所製備菌絲體其營養和藥用價值均同於天然北冬早夏蟲，緩解了該藥源緊缺的局面，可滿足部分需求。本工藝設計合理，產品純度高，無雜質影響。
本發明的詳細敘述斜面菌種培養由保存的菌種移至馬鈴薯(PDA)斜面培養基，置於25℃恆溫處培養7天，低溫保存，備用。PDA斜面培養基配方20％馬鈴薯汁100ml，加入白糖2g，蛋白腖1g，MgSO40.05g，KH2PO40.1g，VB110mg，瓊脂2g，pH7.0。
搖瓶種子培養300ml三角瓶裝100ml培養基，120℃，滅菌20分鐘。一隻斜面菌種接三瓶25-27℃，振蕩(100-120rpm)培養，時間3-4天。搖瓶培養基配方a.葡萄糖2％，白糖1％，蛋白腖1％，酵母膏1％，MgSO400.05％，NH4Cl0.2％，pH7.0。b.白糖3％，蛋白腖2％，MgSO40.06％，KH2PO40.1％，VB10.01％。
種子罐種子培養將搖瓶培養4天左右的種子經檢查純度後，於無菌條件下並種，接種量為6-10％於罐內，罐溫為25-27℃，風量1∶0.4，攪拌速度180-200rpm，罐壓0.05MPa，培養438～45小時。種子罐培養基配方白糖3％，蛋白腖1.5～2.0％，MgSO40.06％，KH2PO40.1％，VB10.01％，pH7.0。
發酵培養接種量8-10％，罐溫25-27℃，風量1∶0.1左右，罐壓0.05MPa，攪拌速度130-140rpm，培養時間60小時左右。發酵罐培養基與種子罐同。
菌絲體的收集與乾燥發酵培養後，用SS型三足式離心機離心脫水(SS600，1400rpm，瀋陽化工學院機械廠出品，依菌體性質應用板框過濾效果較佳，本單位無此設備，以離心脫水代替板框過濾)，離心30分鐘，於60～70℃乾燥，菌體含水量控制在8-9％左右。
分析檢驗與儲存乾燥菌體粉碎過篩後測定D-甘露醇、總氮、腺苷、麥角甾醇、多糖、蟲草素、維生素、微量元素等項，幹菌體置於通風乾燥處保存發酵過程控制正常發酵情況下，發酵過程中，培養基滅菌後pH為6.8，接菌後隨菌體的生長pH下降至5.0-5.5；糖濃度下降至1％左右，菌體生長對數期耗糖最快；發酵到55小時左右菌量最高。同時考查了發酵過程中菌絲體的D-甘露醇及粗多糖含量的變化，如下表所示，D-甘露醇含量隨發酵時間延長緩慢下降，在43-67小時的範圍內幾乎不變；而菌體多糖隨發酵時間延長呈上升的趨勢。
發酵過程中菌體收率及部分指標的變化發酵時間菌粉收率 D-甘露醇含量粗多糖含量(hr) (g/L) (％) (％)碘量法019 8.042 6.350 6.031 9.550 6.190 8.843 13.378 5.856 9.655 14.624 5.799 11.267 15.026 5.777 12.1工藝穩定性試驗結果根據1200立升連續試驗5批次的結果，確定工藝條件如下採用三級發酵流程，搖瓶投料量為100ml/300ml三角瓶，接種量為一隻斜面接三瓶100-120rpm振蕩培養4-5天；種子罐投料量為70L/100L，接種量6～10％左右，溫度25-27℃，風量1∶0.38-0.4，罐壓0.05MPa，攪拌速度180-200rpm，種齡40-50小時；發酵罐投料800L/1200L，接種量6～10％左右，罐溫25-27℃，風量1∶0.1，攪拌速度130-140rpm，罐壓0.05MPa，發酵時間60小時左右。在上述條件下，菌體收率1.1-1.65％，D-甘露醇5.0％以上，粗蛋白24.08-26.07％，多糖11.0-14.0％，麥角甾醇平均6.0mg/g以上，腺苷0.68～1.1mg/g，胺基酸20％以上，VB10.43mg/100g，VB20.446mg/100g，VB120.92ppm，微量元素(ppm)Cu9.1，Zn63，Fe85，Mn14，Mg1104，Ca3106，Cd＜0.001，Pb＜0.01，脂肪酸含硬脂酸、軟脂酸，其中油酸、亞油酸、亞麻酸等含量佔脂肪酸總量的65％以上，SOD46.1U/g。
權利要求
1.一種北冬蟲夏草菌絲體發酵工藝，其特徵是將取自新鮮北冬蟲夏草子實體並獲得的蛹草頭孢菌種，在PDA斜面培養基上恆溫培養7天製成斜面菌種；菌種接入含培養基的搖瓶內振蕩3～4天；經純度檢查並種含培養基的種子罐內，於罐溫25～27℃、風量1∶0.4、攪速180～200rpm、罐壓0.05MPa條件下培養38～45小時；送接種量為6～10％，罐溫25～27℃、風量1∶0.1，罐壓0.05MPa，攪速130～140rpm發酵罐內培養55～65小時；然後脫水、乾燥製成幹菌體。
2.按照權利要求1所述的北冬蟲夏草菌絲體發酵工藝，其特徵是其工藝流程為保存菌種→斜面菌種→種子瓶→種子罐→發酸罐→脫水→乾燥→粉碎→分析→儲存。
3.按照權利要求1所述的北冬蟲夏草菌絲體發酵工藝，其特徵是斜面培養基配方20％馬鈴薯汁100ml，加入白糖2g，蛋白腖1g，MgSO40.05g，KH2PO40.1g，VB110mg，瓊脂2g，pH7.0。
4.按照權利要求1所述的北冬蟲夏草菌絲體發酵工藝，其特徵是搖瓶種子培養基配方300ml三角瓶裝100ml培養基，120℃，滅菌20分鐘。一隻斜面菌種接三瓶，25-27℃，振蕩(100-120rpm)培養，時間3-4天。搖瓶培養基配方a.葡萄糖2％，白糖1％，蛋白腖1％，酵母膏1％，MgSO40.05％，NH4Cl0.2％，PH7.0。b.白糖3％，蛋白腖2％，MgSO40.06％，KH2PO40.1％，VB10.01％。
5.按照權利要求1所述的北冬蟲夏草菌絲體發酵工藝，其特徵是種子罐培養基配方白糖3％，蛋白腖1.5～2.0％，MgSO40.06％，KH2PO40.1％，VB10.01％，pH7.0。
全文摘要
本發明是一種採用生物發酵培養北冬蟲夏草菌絲粉體的方法。將取自新鮮北冬蟲夏草子實體並獲得的蛹草頭孢菌種，在FDA斜面培養基上恆溫培養7天製成斜面菌種；菌種接入含培養基的搖瓶內振蕩；經純度檢查並種含培養基的種子罐內培養38～45小時；送發酵罐內培養55～65小時；然後脫水、乾燥製成幹菌體。本發明給出的方法所製備菌絲體其營養和藥用價值均同於天然北冬早夏蟲，緩解了該藥源緊缺的局面，可滿足部分需求。
文檔編號C12N1/14GK1148623SQ9611945
公開日1997年4月30日 申請日期1996年10月4日 優先權日1996年10月4日
發明者蘇鳳巖, 黃榮年, 李維光 申請人:海南兆隆實業有限公司