一種固定化酵母細胞的微膠囊製備方法

2023-06-07 06:57:56 2

專利名稱：一種固定化酵母細胞的微膠囊製備方法
技術領域：
本發明涉及一種微膠囊製備方法，具體地說涉及一種固定化酵母細胞的微膠囊的製備方法。
背景技術：
細胞固定化技術是早在20世紀70年代發展起來的一門新興的生物技術[文獻1Kierstan M，Bucke C.The immobilization of microbial cells，subcellular organelles，and enzymes in calcium alginate gels.BiotechnolBioeng 1977 Mar；19(3)387-97]，是現代生物工程領域的重要內容之一。其實質就是利用物理或化學方法將游離細胞固定在一定的空間內，作為生物催化劑而連續使用。細胞固定化技術優於游離細胞主要體現在(1)可提高反應器中的細胞濃度，使反應速度加快，容積生產效率提高；(2)細胞可連續使用；(3)抗汙染能力強；(4)可連續發酵，產物分離方便；(5)便於放大和實現自動化。因此，細胞固定化技術目前愈來愈廣泛地應用於食品與發酵工業中。
酵母細胞是釀造工業及基因工程技術中使用最廣泛的一類微生物，因此，研究酵母細胞的固定化具有很好的應用價值和前景。酵母細胞固定化方法主要有共價偶聯法、吸附法和包埋法。其中，包埋法以其簡便、易於放大、細胞活性保持好等優勢而被廣泛採用。常用的包埋載體可以是天然材料，如海藻酸鹽、明膠、褐藻膠，K-角叉菜，或合成高分子材料，如聚丙烯醯胺，聚乙烯醇等。其中，褐藻膠，K-卡拉膠、明膠存在強度差、使用壽命短等缺點；聚丙烯醯胺單體有神經毒性，不利於微生物活細胞生長；聚乙烯醇製備過程中需要高無機鹽濃度對微生物生長不利。目前，應用較多的是海藻酸鹽固定化酵母細胞[文獻2L.Kurillova，P.Gemeiner，A.Vikartovska，H.Mikova，M.Rosenberg and M.Ilavsky.Calciumpectate gel beads for cell entrapment.6.morphology of stabilized andhardened calcium pectate gel beads with cells for immobilized biotechnology.J.microencapsulation，2000，17(3)279-296]，但存在著海藻酸鈣顆粒較大(mm級)[文獻3Viktor A.Nedovic，Bofana Obradovic，Ida Leskoosek-Cukalovic，Oliivera Trifunovic，Radofica Pesic，Branko Bugarski.Electrostatic generationof alginate microbeads loaded with brewing yeast.Process biochemistry 2001，37(1)17-22]，影響溶質在固定化細胞凝膠中的擴散；易發生細胞洩漏[文獻4Yoshimitsu Uemura，Naoki Hamakawa，Hidekazu Yoshizawa，HirokiAndo，Kazuya Ijichi，and Yasuo Hatate.Effect of calcium alginate coating onthe performance of immobilized yeast cells in calcium alginate beads.Chem.Eng.Comm.2000，1771-14]，和培養過程中細胞損失較大等問題。

發明內容
本發明針對上述問題提出在製備出小粒徑海藻酸鈣微膠珠的基礎上，進一步處理製備成一種新型的酵母細胞固定化技術-海藻酸鈉/聚賴氨酸微膠囊。與傳統的海藻酸鈣固定化技術相比，本發明用大功率微膠囊製備儀[文獻5馬小軍，任吉倫，何洋。大功率高壓脈衝微膠囊製備儀。中國發明專利00253538.6]製備出粒徑在500μm以下的微膠珠，產量為700ml/h，再在膠珠表面通過離子絡合反應瞬間形成一層聚賴氨酸微膠囊膜，最後用檸檬酸鈉溶液將微膠囊內部海藻酸鈣凝膠液化，使微膠囊內成液體環境[文獻6馬小軍，解玉冰，周麗，虞星炬，袁權，李昌臣，郝莉，賀欣，孫綿方。APA生物微膠囊的製備條件與膜強度的關係。中華器官移植雜誌，1995，16(4)156-157]。本發明的製備工藝特點是1)條件溫和，製備過程中酵母細胞損失很少，細胞活性保持100％；2)由於聚賴氨酸微膠囊膜的存在，與海藻酸鈣膠珠相比，酵母細胞在培養過程中細胞洩漏明顯減少；3)由於微膠囊粒徑小，降低了溶質的擴散距離；4)微膠囊內為液體環境，消除凝膠部分的死區，改善通透性，有利於溶質在固定化細胞中的擴散；5)用大功率微膠囊製備儀可以實現大規模製備酵母細胞的固定化載體本發明的原理是在原有海藻酸鹽固定化細胞的基礎上，通過大功率微膠囊製備儀，使均勻混合有酵母細胞的海藻酸鈉溶液在高壓靜電場作用下，形成粒徑在100-500μm可控，分布均勻的液滴，與鈣溶液固化形成微膠珠。並在微膠珠表面通過離子絡合反應瞬間形成一層聚賴氨酸微膠囊膜。再用檸檬酸鈉溶液置換出海藻酸鈣凝膠中的鈣，使微膠囊內液化成液體環境。
本發明的製備方法中，其主要製備步驟為1)通過大功率微膠囊製備儀，將均勻混合有酵母細胞的海藻酸鈉溶液在高壓靜電場作用下，形成液滴；本發明所採用的酵母細胞包括啤酒酵母、熱帶假絲酵母、畢氏酵母等各種用於食品加工業的酵母細胞及各種能夠表達外源基因的基因工程酵母細胞。
本發明所採用的海藻酸鈉濃度在8-30g/L；本發明所述的液滴其粒徑在100-500μm可控，分布均勻，且具有良好的單分散性。
2)步驟1的液滴與鈣溶液固化形成海藻酸鈣微膠珠，並與聚賴氨酸溶液反應成膜，在微膠珠表面形成一層聚賴氨酸微膠囊膜；本發明所採用的氯化鈣濃度在0.05-0.3mol/L；本發明反應成膜時間在5-60分鐘，膜厚在5-50μm範圍內可控；本發明所採用的聚賴氨酸分子量在1-10萬，聚賴氨酸溶液濃度在0.1-10g/L，pH在7.0-7.4。
3)用檸檬酸鈉溶液將步驟2製得的微膠囊內部海藻酸鈣凝膠液化，使微膠囊內成液體環境；本發明所採用的檸檬酸鈉溶液濃度在0.01-0.10mol/L。
本發明提供的方法是在全生理條件下製備，其製備過程條件溫和pH7.0-7.4；4-30℃；無剪切及振蕩。製備過程中酵母細胞活性100％保持。
本發明系統中製備的固定化酵母細胞的聚賴氨酸微膠囊在培養過程中細胞的洩漏率低於10％。
本發明製備的微膠囊粒徑小於通常的固定化載體，且微膠囊內部為液體環境，極大改善了固定化載體的傳質問題，使培養過程中囊中心區的酵母細胞仍然存活，保證酵母細胞的有效利用率。而且，由於微膠囊在原有海藻酸鈣膠珠的基礎上覆蓋一層聚賴氨酸微膠囊膜，減少了培養過程中酵母細胞洩漏現象的發生，提高酵母細胞固定化發酵的產率。另外，本發明提供的製備方法其產率高達700ml/h，初步實現規模化。


圖1為本發明的製備過程示意圖。
圖2為不同分子量蛋白質在本發明製備的海藻酸鈉-聚賴氨酸微膠囊中的擴散曲線具體實施方式
例1有關本發明的製備過程請參照圖1。將懸浮培養處於對數生長期的酵母菌GS115離心收集菌體，與15g/L的海藻酸鈉溶液均勻混合。在大功率微膠囊製備儀的高壓電場作用下滴入100mmol/L的氯化鈣溶液中進行凝膠化反應30分鐘，製備出粒徑在300μm海藻酸鈣凝膠珠，然後與0.5g/L的聚賴氨酸溶液成膜反應10分鐘，生理鹽水清洗3遍後55mmol/L檸檬酸鈉溶液液化10分鐘，生理鹽水清洗3遍後製備出聚賴氨酸微囊化酵母菌，囊膜厚度25μm。整個製備過程均在生理條件下完成，製備過程中酵母細胞存活率100％保持。
例2將製備好的含有酵母細胞的海藻酸鈉-聚賴氨酸微膠囊與海藻酸鈣微膠珠置於YPD培養液中，搖瓶培養，28℃，180rpm，培養24小時後，計算酵母細胞洩漏率。結果表明，聚賴氨酸微膠囊組細胞的洩漏率比海藻酸鈣微膠珠組降低3倍以上。
例3圖2給出了不同分子量蛋白在海藻酸鈉-聚賴氨酸微膠囊的擴散曲線圖，由圖可以判斷，低於1萬Da的分子在海藻酸鈉-聚賴氨酸微膠囊中可以自由擴散，不影響囊內酵母菌營養的供應和代謝產物的排出。
比較例文獻3採用靜電液滴法製備出粒徑在250-2000μm的固定化酵母細胞的海藻酸鈣膠珠。雖然解決了小粒徑問題，但產率低(僅25.2ml/h)。本發明製備的固定化酵母細胞的海藻酸鈣膠珠粒徑在100-500μm範圍可控，且產率高達700ml/h。
文獻4通過製備雙層海藻酸鈣凝膠來減少細胞洩漏，雖然在解決細胞洩漏問題上有一定的效果，但製備的膠珠粒徑在3mm，大粒徑載體在培養過程中，載體中心部分的酵母細胞由於受傳質阻力影響無法獲得充分的營養供應。本發明製備的固定化酵母細胞的聚賴氨酸微膠囊既減少了細胞洩漏，又通過小粒徑(可控制在100-500μm範圍)和內部液體環境解決了傳質問題。
權利要求
1.一種固定化酵母細胞的微膠囊製備方法，其主要步驟為a)通過大功率微膠囊製備儀，將均勻混合有酵母細胞的海藻酸鈉溶液在高壓靜電場作用下，形成液滴；b)步驟a的液滴與鈣溶液固化形成海藻酸鈣微膠珠，並與聚賴氨酸溶液反應成膜，在微膠珠表面形成一層聚賴氨酸微膠囊膜；c)用檸檬酸鈉溶液將步驟b製得的微膠囊內部海藻酸鈣凝膠液化，使微膠囊內成液體環境；所述海藻酸鈉濃度在8-30g/L；所述氯化鈣濃度在0.05-0.3mol/L；所述聚賴氨酸分子量在1-10萬，聚賴氨酸溶液濃度在0.1-10g/L，pH在7.0-7.4；所述檸檬酸鈉溶液濃度在0.01-0.10mol/L。
2.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟a中所述的酵母細胞包括啤酒酵母、熱帶假絲酵母或畢氏酵母及基因工程酵母菌。
3.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟a中所述的液滴其粒徑在100-500μm。
4.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟b中所述的海藻酸鈣凝膠珠與聚賴氨酸溶液反應成膜時間在5-60分鐘。
5.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟b中所述的聚賴氨酸微膠囊膜厚為5-50μm。
全文摘要
一種固定化酵母細胞的海藻酸鈉－聚賴氨酸微膠囊製備方法，在原有海藻酸鹽固定化細胞的基礎上，通過大功率微膠囊製備儀，使均勻混合有酵母細胞的海藻酸鈉溶液在高壓靜電場作用下，形成粒徑在100－500μm可控，分布均勻的液滴，與鈣溶液固化形成微膠珠。並在微膠珠表面通過離子絡合反應瞬間形成一層聚賴氨酸微膠囊膜。再用檸檬酸鈉溶液置換出海藻酸鈣凝膠中的鈣，使微膠囊內液化成液體環境。本發明是在全生理條件下製備，其製備過程條件溫和pH5.0－7.4；4－30℃；無剪切及振蕩。製備過程中酵母細胞活性100％保持。在培養過程中細胞的洩漏率低於10％。
文檔編號C12N11/02GK1616658SQ20031011815
公開日2005年5月18日 申請日期2003年11月10日 優先權日2003年11月10日
發明者馬小軍, 於煒婷, 謝威揚 申請人:中國科學院大連化學物理研究所