篩選含有外源融合基因HIV/env/IFNα-2b的重組痘苗病毒的方法

2023-06-06 21:08:21 1

專利名稱：篩選含有外源融合基因HIV/env/IFNα-2b的重組痘苗病毒的方法
技術領域：
本發明屬於基因工程疫苗生物技術領域，涉及篩選含有外源融合基因HIV/env/ IFNa -2b的重組痘苗病毒的方法。
背景技術：
愛滋病(AcquiredImmunodeficiency Syndrome，AIDS)是本世紀以來對人類威脅 最嚴重的傳染病。愛滋病病毒對人體免疫功能的破壞所產生難以治癒的感染和腫瘤已經威 脅了人類社會的生存和發展。特別是愛滋病在傳播蔓延過程中一個最引人關注的現象是， 全球愛滋病病毒新感染者中，青少年佔一半以上。目前，尚未有能從根本上徹底治療和預防 愛滋病的有效藥物。現行的各種治療措施都是嘗試性的。由於愛滋病主要是和免疫系統有 關的疾病，因而獲得可靠的免疫預防保護是從根本上解決愛滋病流行傳播的關鍵。人獲得 性免疫缺陷病毒(HIV)作為反轉錄RNA慢病毒，是傳播AIDS的主要病原體。外膜蛋白(env) 是HIV的主要結構蛋白之一，含有5個高變區(V1-V5)和5個恆定區。V4-V5為抗原表位與 靶細胞結合區，V3區介導病毒進入靶細胞，C3-C4區參與CD4受體結合併影響病毒的嗜性。 許多體外突變體實驗均表明該區的胺基酸替換或缺失可導致env蛋白對CD4+細胞的結合 能力降低，這表明位於該區域的胺基酸殘基為CD4+受體結合所必需，在HIV感染的過程中 起著關鍵性的作用。有關HIV疫苗的研製多數是圍繞著外膜蛋白(env)展開的，而本項發 明利用HIV外膜蛋白(env)基因片段，構建在真核細胞表達的融合基因。表達的蛋白產物 即可作為抗原進行免疫預防和治療，又可作為診斷試劑篩查感染人群。

發明內容
本發明的目的是提供一種分子生物學領域的操作技術，通過構建一個基因重組表 達質粒，篩選出一株含有外源融合基因HIV/env/IFNa _2b的重組痘苗病毒。本發明是通過如下技術方案實現的將編碼人幹擾素a -2b的基因序列與編碼人HIVenv基因融合，構建讀框吻合的外 源融合基因片斷，並克隆到痘苗病毒表達載體PJ16中，構建了含有HIVenv和IFN a -2b外 源融合基因的重組表達質粒pJ16enV/IFNa _2b，並在真核細胞中忠實地翻譯了原有的基 因序列，連續穩定地表達了 env/IFNa -2b融合蛋白，pJ16enV/IFNa -2b基因表達產物在體 外能與HIVenv陽性血清發生特異性反應，具備免疫原性和免疫反應性，無返祖現象。為研 究愛滋病病毒結構蛋白的抗原性，提供了一個獲得愛滋病病毒外膜蛋白的途徑。為研究艾 滋病感染者的檢測診斷試劑與免疫預防治療提供重要的理論依據。本發明的技術解決方案包括以下步驟1. pJ16env/IFN a -2b 基因重組與鑑定在無菌條件下製備大腸桿菌感受態細胞，置-70°C超低溫冰箱凍存，用於轉化質 粒。採用CaCl2轉化的方法，將含有目的基因的載體質粒轉入E. coliHB101、JM109、DH-5a、JMlOl中，在含50 μ g/ml Amp的LB液體培養基中37°C振搖培養24h，分別以質粒小量提取、質粒大量提取方法製備含有目的基因的載體和表達載體，以5V/cm的電壓在瓊脂糖凝 膠上電泳以及用限制性內切酶的酶切反應鑑定目的基因和載體，當溴酚藍電泳至適當位 置後，用長波紫外燈觀察並記錄結果或拍照保存，採用分光光度計測定法檢測260nm和 280nm的光密度OD值，計算提取質粒的濃度，置_20°C冰箱中保存，備用於連接反應。DNA 目的基因片斷與載體的回收根據實驗目的和DNA分子量大小分別採用凍融法、DEAE-81纖 維素膜電泳回收法、低熔點瓊脂糖凝膠回收法與透析袋法。酶切DNA片段的3』凹端補平 與線性質粒DNA的5'端去磷分別採用dNTP、Klenow大片段與牛小腸鹼性磷酸酶(CIP) 分別置室溫、37°C、55°C、75°C反應，將3』凹端補平與5'端去磷的線性質粒DNA用適量 T4 DNA連接酶(0. 5weiSS單位)置16°C水浴過夜或25°C lh。進行連接反應。重組子的 篩選和鑑定採用酶切法。挑選酶切結果與理論預計值相同者進一步用兩種以上內切酶消 化，所有酶切結果均與預計完全相同者，即為目的重組質粒。結果構建了內含目的基因片 段 env (nt6220-nt8887)與 IFN α -2b (nt290_nt813)，分子量約為 9. 893kb 的重組表達質粒 pJ16env/IFNa -2b。2. pJ16env/IFN a -2b在真核細胞中表達與鑑定真核細胞表達是以野生型痘苗病毒為介導轉基因，採用脂質體轉染細胞法，使 pJ16env/IFNa-2b在細胞內與野生型痘苗病毒發生同源重組具體操作是分別在35mm平 皿中培養的RK、BHK21以及Cos-7細胞中感染野生型痘苗病毒，感染MOI (Multiplicity of infection)為0. 1的野生型病毒，於37°C、5% CO2反應Ih後與包裹脂質體的質粒進行共 轉染，同時設未感染病毒的正常細胞和未加轉染試劑的痘苗病毒感染細胞為對照。培養48h 後，以血凝素基因(HA)為報告基因，篩選純化含目的基因pJ16enV/IFNa-2b的重組痘苗病 毒。本實驗經加入預先處理好的雞紅細胞後鏡下觀察，由於野生型病毒具有完整的HA基 因，所以非重組病毒感染的細胞有HA基因蛋白表達的血凝素而能吸附雞紅細胞。肉眼觀察 可見病毒蝕斑呈紅色片狀，光鏡下可見大量雞紅細胞被吸附在病變細胞的表面。重組病毒 由於外源基因片段的插入使HA失活，其感染的細胞不能表達血凝素，故喪失了吸附雞紅細 胞的能力。肉眼觀察與非重組病毒蝕斑有明顯差異，鏡下觀察無雞紅細胞吸附，蝕斑內的細 胞多數崩解、脫落，僅剩下少量細胞融合、擁擠成堆、斑內形成空洞。結果利用HA特性，篩選 純化出VJ16enV/IFNa -2b重組痘苗病毒株，經過3 4代的純化直至穩定表達HA-斑為 止，48h後收毒。以細胞培養法擴增重組痘苗病毒，以間接免疫螢光分析(IFA)、Dot-ELISA、 SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)與蛋白印跡(Westernblotting)方法鑑定pJ16env/ IFNa-2b目的基因在真核細胞中的表達產物，確定其分子量。結果VJ16enV/IFNa-2b重組 痘苗病毒株表達的env蛋白能被HIV血清所識別，分別能與1 300倍稀釋後的HIV陽性 血清發生較強的特異性呈色反應，其分子量為IOOkDa,與預計理論上的計算值相符合。3. pJ16env/IFNa-2b表達產物的免疫原性和免疫反應性研究將篩選純化的vJieenv/IFNa _2b重組痘苗病毒接種於體外培養的單層細胞，培 養約30h左右，收取感染細胞，測定病毒PFU值，調整病毒的滴度使其達到IO8PFU,用弗氏 佐劑製備樣品，採用足墊和腹腔兩種免疫途徑免疫小鼠，加強免疫3次，飼養60天後，眼球 取血，無菌製備脾淋巴細胞，採用HIV間接ELISA試劑盒檢測免疫小鼠血清HIV抗體，在 DG5030型酶聯免疫檢測儀上依次讀取490nm下的光密度值(OD49tl)。流式細胞儀FACS檢測3000個細胞，所得數據進行統計學分析。結果表明含有pJieenv/IFNa _2b基因的重組痘苗 病毒株能表達目的蛋白。重組痘苗病毒表達產物免疫小鼠後，體液免疫檢測結果表明，重組 痘苗病毒表達產物免疫小鼠後可以激發小鼠體內產生高滴度的抗體水平，含IFN α -2b結 構基因組與不含IFNa _2b結構基因組之間比較，前者提高了重組顆粒化抗原的免疫原性。 流式細胞儀檢測3000個T淋巴細胞中標記的陽性細胞表明小鼠體內產生了細胞免疫。統計 學分析，多組間比較作方差分析，組間比較用t檢驗。t = χ - μ /S χ。重組病毒基因表達產 物的生物活性研究採用淋巴細胞轉化實驗與CTL殺傷活性實驗，結果表明，env/IFNa _2b 融合基因在痘苗病毒中共表達產物能提高實驗小鼠的體液免疫與細胞免疫，具備免疫原性 與免疫反應性。本發明的實用意義愛滋病是由於HIV感染破壞機體免疫系統的CD+4T淋巴細胞， 致使機體免疫力下降，導致各種機會性感染和腫瘤，但HIV究竟以什麼方式破壞人體的免 疫系統仍是一個沒有解決的問題。因此，愛滋病的治療應該考慮到抗HIV的病原治療，提高 機體的免疫力抵抗力。那麼尋找使用愛滋病病毒中那種結構蛋白才能作為有效保護性抗原 是保護CD+4細胞不受侵犯，抑制HIV在體內擴散，是從根本上達到有效治療愛滋病的目的。 另一方面，愛滋病病毒的最大特點是持續存在著潛伏複製轉換和抗原性漂移，也給HIV的 藥物治療和免疫預防帶來巨大的障礙。我們的研究正是圍繞上述兩方面的問題展開的，利 用分子克隆技術將淋巴因子編碼基因IFNa-2b與env基因的抗原決定簇融合，以提高抗原 性，降低毒性，保護CDT淋巴細胞不受侵犯，從而抑制HIV在體內的擴散，最終達到有效防治 愛滋病的目的。為研究愛滋病基因疫苗免疫預防治療提供了一個獲得愛滋病病毒外膜蛋白 的途徑和重要的理論實驗依據。


圖1為重組表達質粒pJ16env/IFNa -2b的構建 圖2為重組質粒酶切鑑定
具體實施例方式實施例1 重組表達質粒pJ16env/IFNa -2b的構建圖(見附圖1)實施例2 重組質粒酶切鑑定圖(見附圖2)。
權利要求
篩選含有外源融合基因HIV/env/IFNα-2b的重組痘苗病毒的方法，其特徵在於包括以下步驟①pJ16env/IFNα-2b基因重組與鑑定在無菌條件下製備大腸桿菌感受態細胞，置-70℃超低溫冰箱凍存，用於轉化質粒，採用CaCl2轉化的方法，將含有目的基因的載體質粒轉入E.coliHB101、JM109、DH-5α、JM101中，在含50μg/ml Amp的LB液體培養基中37℃振搖培養24h，分別以質粒小量提取、質粒大量提取方法製備含有目的基因的載體和表達載體，以5V/cm的電壓在瓊脂糖凝膠上電泳以及用限制性內切酶的酶切反應鑑定目的基因和載體，當溴酚藍電泳至適當位置後，用長波紫外燈觀察並記錄結果或拍照保存，採用分光光度計測定法檢測260nm和280nm的光密度OD值，計算提取質粒的濃度，置-20℃冰箱中保存，備用於連接反應，DNA目的基因片斷與載體的回收；分別採用凍融法、DEAE-81纖維素膜電泳回收法、低熔點瓊脂糖凝膠回收法與透析袋法；酶切DNA片段的3』凹端補平與線性質粒DNA的5′端去磷分別採用dNTP、Klenow大片段與牛小腸鹼性磷酸酶分別置室溫、37℃、55℃、75℃反應，將3』凹端補平與5′端去磷的線性質粒DNA用0.5weiss單位的T4DNA連接酶置16℃水浴過夜或25℃1h；進行連接反應；重組子的篩選和鑑定採用酶切法；挑選酶切結果與理論預計值相同者進一步用兩種以上內切酶消化，所有酶切結果均與預計完全相同者，即為目的重組表達質粒pJ16env/IFNα-2b；②pJ16env/IFNα-2b在真核細胞中表達與鑑定真核細胞表達是以野生型痘苗病毒為介導轉基因，採用脂質體轉染細胞法，使pJ16env/IFNα-2b在細胞內與野生型痘苗病毒發生同源重組具體操作是分別在35mm平皿中培養的RK、BHK21以及Cos-7細胞中感染野生型痘苗病毒，感染MOI為0.1的野生型病毒，於37℃、5％CO2反應1h後與包裹脂質體的質粒進行共轉染，同時設未感染病毒的正常細胞和未加轉染試劑的痘苗病毒感染細胞為對照；培養48h後，以血凝素基因為報告基因，篩選純化含目的基因pJ16env/IFNα-2b的重組痘苗病毒；利用HA特性，篩選純化出vJ16env/IFNα-2b重組痘苗病毒株，經過3～4代的純化直至穩定表達HA-斑為止，48h後收毒；以細胞培養法擴增重組痘苗病毒，以間接免疫螢光分析、Dot-ELISA、SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳與蛋白印跡方法鑑定pJ16env/IFNα-2b目的基因在真核細胞中的表達產物，確定其分子量。③pJ16env/IFNα-2b表達產物的免疫原性和免疫反應性將篩選純化的vJ16env/IFNα-2b重組痘苗病毒接種於體外培養的單層細胞，培養約30h左右，收取感染細胞，測定病毒PFU值，調整病毒的滴度使其達到108pFU，用弗氏佐劑製備樣品，採用足墊和腹腔兩種免疫途徑免疫小鼠，加強免疫3次，飼養60天後，眼球取血，無菌製備脾淋巴細胞，採用HIV間接ELISA試劑盒檢測免疫小鼠血清HIV抗體，在DG5030型酶聯免疫檢測儀上依次讀取490nm下的光密度值(OD490)，流式細胞儀FACS檢測3000個細胞，所得數據進行統計學分析。
2.根據權利要求1所述的篩選含有外源融合基因HIV/env/IFNa_2b的重組痘苗病毒 的方法，其特徵在於重組痘苗病毒vJ16env/IFNa -2b表達產物為將vJ16env/IFNa -2b表 達的蛋白產物以適當比例加入弗氏佐劑，製成具有刺激機體產生免疫反應的蛋白抗原。
3.根據權利要求1所述的篩選含有外源融合基因HIV/env/IFNa_2b的重組痘苗病毒的方法，其特徵在於所述的DNA目的基因片斷與載體的回收根據實驗目的和DNA分子量大 小分別採用凍融法、DEAE-81纖維素膜電泳回收法、低熔點瓊脂糖凝膠回收法與透析袋法。
4.根據權利要求1所述的篩選含有外源融合基因HIV/env/IFNa_2b的重組痘苗病 毒的方法，其特徵在於所述的重組表達質粒pJ16enV/IFN α _2b內含目的基因片段env/ IFN α -2b (nt6220_nt8887)與 IFN α -2b (nt290_nt813)，分子量約為 9. 893kb。
5.根據權利要求1所述的篩選含有外源融合基因HIV/env/IFNa_2b的重組痘苗病毒 的方法，其特徵在於VJ16enV/IFNa _2b重組痘苗病毒株表達的env蛋白能被HIV血清所 識別，分別能與1 300倍稀釋後的HIV陽性血清發生較強的特異性呈色反應，其分子量為 IOOkDa0
6.根據權利要求1所述的篩選含有外源融合基因HIV/env/IFNa_2b的重組痘苗病毒 的方法，其特徵在於含目的基因pJieenv/IFNa _2b的重組痘苗病毒經加入預先處理好的 雞紅細胞後鏡下觀察，由於野生型病毒具有完整的HA基因，所以非重組病毒感染的細胞有 HA基因蛋白表達的血凝素而能吸附雞紅細胞。肉眼觀察可見病毒蝕斑呈紅色片狀，光鏡下 可見大量雞紅細胞被吸附在病變細胞的表面。重組病毒由於外源基因片段的插入使HA失 活，其感染的細胞不能表達血凝素，故喪失了吸附雞紅細胞的能力。肉眼觀察與非重組病毒 蝕斑有明顯差異，鏡下觀察無雞紅細胞吸附，蝕斑內的細胞多數崩解、脫落，僅剩下少量細 胞融合、擁擠成堆、斑內形成空洞。
全文摘要
本發明屬於基因工程疫苗生物技術領域，提供了篩選含有外源融合基因HIV/env/IFNα-2b的重組痘苗病毒的方法。本方法根據HIV外膜蛋白的抗原表位存在中和抗體決定簇，與靶細胞結合後影響病毒攻擊CD4+嗜性的作用原理，構建了重組表達質粒pJ16env/IFNα-2b，採用脂質體轉染法，以野生型痘苗病毒為介導轉基因，使pJ16env/IFNα-2b與野生型痘苗病毒發生同源重組，利用HA特性，篩選純化出vJ16env/IFNα-2b重組痘苗病毒株，使env/IFNα-2b融合基因與痘苗病毒在真核細胞中共表達.小鼠實驗表明env/IFNα-2b融合基因與痘苗病毒共表達產物能提高實驗小鼠的體液免疫與細胞免疫，表達的蛋白產物可以作為抗原進行免疫預防。本項發明為研究愛滋病病毒結構蛋白的抗原性，提供了一個獲得愛滋病病毒外膜蛋白的重要途徑。
文檔編號G01N33/569GK101846679SQ20091001086
公開日2010年9月29日 申請日期2009年3月25日 優先權日2009年3月25日
發明者於寧, 王洪軍, 邢安輝 申請人:邢安輝;王洪軍;於寧