用於治療骨質疏鬆症的甲狀旁腺激素類似物的製作方法

2023-06-07 00:23:46 3

專利名稱：用於治療骨質疏鬆症的甲狀旁腺激素類似物的製作方法
技術領域：
本發明涉及人體甲狀旁腺激素類似物，該藥物被發現可以有效治療骨質疏鬆症。
背景技術：
骨質疏鬆症是造成老年人，特別是老年婦女殘疾的主要原因。最近已認識到人體甲狀旁腺激素(hPTH)和某些類似物是促進骨骼生長的刺激物，其益於治療骨質疏鬆症。骨質疏鬆症是一種不斷惡化的疾病，最終導致骨骼總質量的減少和骨骼脆性的增加。這也常常導致了負載骨骼的自發骨折和精神、肉體非移動傷害的退化特徵。
絕經後的骨質疏鬆症是由於雌性激素的消失造成的，雌性激素的消失觸發了長達十多年的加速增加舊骨骼消溶與新骨質形成之間的不平衡的骨骼的轉變。並導致了負載骨骼變細、孔隙度增加和小梁的損耗。骨質疏鬆症也和甲狀腺機能亢進、甲狀旁腺功能亢進、庫興氏綜合症和某些類固醇藥物使用有關，傳統的治療方法包括在飲食中增加鈣質、雌激素治療和增加維他命D的劑量，但是主要的是具有如抑制破骨細胞吸收作用的反吸收藥物的藥劑。
甲狀旁腺激素(PTH)是由甲狀旁腺產生的，是血液中鈣含量的主要調節者。PTH是一種多肽，合成的多肽可以通過由Erickson和Merrifield公開的方法來製備，見The Protein，Neurath等人.，Eds.，AcademicPress，New York，1976，Page257，並且通過Hodges等人(1988)PeptideResearch 119或者通過Atherton，E.和Sheppard，R.C.Solid PhasePeptide Synthesis，IRI Press，Oxford，1989的方法改進。
當血清中鈣質減少到正常水平以下，甲狀旁腺釋放PTH並且鈣質水平通過骨骼鈣質的消溶、通過來自腸的鈣質的吸收、通過來自腎小管原尿的鈣的腎臟重吸收而增加。雖然連續注入的低水平的PTH能夠移去骨骼中的鈣質，但是間歇性注入同樣低劑量的PTH實際上促進了骨骼的生長。
在美國專利4086196中，Tregear描述了人體甲狀旁腺激素類似物並且聲稱根據在一次體內vitro細胞化驗的腺苷酸環化酶的刺激物，起初的27-34個胺基酸是最有效的。在美國專利4771124中，Rosenblatt公開了人體甲狀旁腺激素類似物的特徵，其中，Trp23由胺基酸苯基丙氨酸、亮氨酸、已氨酸、纈氨酸、酪氨酸、β-萘胺，α-萘胺替代作為一種PTH對抗劑。這些改進的hPTH類似物也去掉了2和6終端胺基酸，導致了在治療骨質疏鬆症中失去了促效藥大部分活性。這些類似物設計為PTH和與PTH有關的肽的抑制劑。這些類似物被宣稱可能對於治療與某些腫瘤有關的過量血鈣有用。
在1993年4月15日公布的WO93/06845中，Pang等人描述了包括hPTH類似物Arg25、Lys26、Lys27替代物，其帶有大量胺基酸，包括丙胺基酸、天冬醯胺酸、天冬氨酸、半胱氨酸、穀氨酸鹽、穀氨酸、氨基乙酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色氨酸、酪氨酸或纈氨酸。他們同時宣稱該類似物對骨質疏鬆症的治療有效並且對血壓和平滑肌的影響很小，但沒有提供來自動物或人體試驗的支持數據。
其它公開所關注hPTH類似物的參考文獻是Condon和Morze的PCT專利WO9851324，Chorev等人的美國專利5747456，和Rosenblatt等人的美國專利5717062。這些參考文獻公開了一些涉及13-17和26-30環化的單環和雙環環化物。
PTH通過兩個第二信使系統----Gs-蛋白質活性腺苷酸環化酶(AC)和Gq-蛋白質活性磷脂酶Cβ的活性進行控制。後者導致一種由胞結合蛋白質激酶Cs(PKC)活性的刺激。在一老鼠的骨肉瘤(RCO)細胞系中顯示，PKC活性需要PTH29-32殘基(Jouishomme等人(1994)J.Bone MineralRes.9，(1179-1189))。已經確立骨骼生長的提高，即對於治療骨質疏鬆症的效果是通過與肽序列性能的結合來增加AC活性。自然的h(PTH)-(1-34)序列已經顯示具有所有這些活性。典型的h(PTH)-(1-34)序列顯示為(A)Ser Val Ser Glu Lle Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys HisLeu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys LeuGln Asp Val His Asn Phe-OH(系列ID號1)A以下直線型類似物，hPTH-(1-31)-NH2，僅具有AC-刺激活性並且在切除卵巢的老鼠模形中骨骼損失的恢復中顯示是完全活性的(Rixon，R.H.等人(1994)J.Bone Miner.Res.9，1179-1189；Whitfield等人(1996)，Calcified Tissue Int.58，81-87；Willick等人，U.S.Patent No.5556940 issued 17 September 1996)Ser Val Ser Glu Lle Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys HisLeu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys LeuGln Asp Val-NH2(系列ID號2)B上述分子B可能有一個自由羥基未端替代說明中的氨基未端。

發明內容
本發明的目的是生產新型PTH類似物，其具有較大的新陳代謝的穩定性，提高的骨骼恢復活性，提高的AC活性並且有很小的臨床副作用。
根據本發明的一個方面，提供了新型的人體甲狀旁腺激素(hPTH)類似物，及其配藥學上容許的鹽，其具有胺基酸序列R-NH-Val-Ser-Glu-Lle-Gln-Leu-R8-His-Asn-Leu-Gly-R13-R14-R15-R16-R17-R18-Glu-Arg-Val-R22-Trp-Leu-R25-R26-R27-Leu-Y(系列ID號7)其中，R＝氫或任何直線型或支鏈型羥基，醯基或芳香基團，R1＝Ser，Ala或Aib，R8＝Met，Nle或一種自然發生的疏水性胺基酸，R13＝Lys，Orn，Glu，Asp，Cys或Hcys(碳環化合物)，R14＝His或一種水溶性的胺基酸，R15＝Leu或一種水溶性的胺基酸，R16＝Asn或一種水溶性的胺基酸，R17＝Ser，Glu，Asp，Lys，Orn，Cys，Hcys(碳環化合物)或一種水溶性的胺基酸，R18＝Met，Nle或一種自然發生的疏水性胺基酸，R22＝G1u，Lys，Orn，Cys，Asp或Hcys(碳環化合物)，R25＝Arg或His，R26＝Lys，Orn，Glu，Cys，Asp或Hcys，R27＝Lys，Leu或一種自然發生的疏水性或極性胺基酸，X＝OR或NHR，Y＝X，Gln-X，Gln-Asp-X或Gin-Asp-Val-X，如果當Y＝X或Y＝Gln-X，一對或兩對胺基酸R13，R17及R22，R26環化和當Y＝Gln-Asp-X或Y＝Gln-Asp-Val-X，兩對胺基酸R13，R17和R22，R26環化時，所述胺基酸對的每個胺基酸都有一條側鏈能夠形成一個內醯胺或者一個側鏈之間的二硫化物鏈橋。
根據本發明的優選的方面，新型的hPTH類似物及其配藥學上容許的鹽具有胺基酸序列R-NH-Ser-Val-Ser-Glu-Lle-Gln-Leu-R8-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-R18-Glu-Arg-Val-R22-Trp-Leu-R25-R26-R27-Leu-Y(系列ID號8)其中，R＝氫或任何直線型或支鏈型羥基，醯基或芳香基團，R8＝Met或Nle，R18＝Met或Nle，R22＝Glu，Asp，Lys，Orn，Cys或Hcys，R25＝Arg或His，R26＝Glu，Asp，Lys，Orn，Cys或Hcys，R27＝Lys，Leu，Ala或Nle，Y＝X或Gln-X，X＝OR或NHR，當胺基酸對R22和R26發生環化後，所述胺基酸對的每個胺基酸都有一條側鏈能夠形成一個內醯胺或者一個側鏈之間的二硫化物鏈橋。
根據本發明的優選方面，新型的雙環hPTH類似物及其配藥學上容許的鹽具有胺基酸序列RNH-Ser-Val-Ser-Glu-Lle-Gln-Leu-R8-His-Asn-Leu-Gly-R13-His-Leu-Asn-R17-R18-Glu-Arg-Val-R22-Trp-Leu-R25-R26-R27-Leu-Y(系列ID號9)其中，R＝氫或任何直線型或支鏈型羥基，醯基或芳香基團，R8＝Met或Nle，R13＝Lys，Orn，Glu，Asp，Cys或Hcys，R17＝Lys，Orn，Glu，Asp，Cys或Hcys，R18＝Met或Nle，R22＝Glu，Asp，Lys，Orn，Cys或Hcys，R25＝Arg或His，R26＝Lys，Orn，Glu，Asp，Cys或Hcys，R27＝Lys，Leu，Nle或一種自然發生的疏水性或極性胺基酸，Y＝X，Gln-X，Gln-Asp-X或Gln-Asp-Val-X，X＝OR或NHR，當兩個胺基酸對R13、R17和R22、R26發生環化後，每個胺基酸殘基R13和R17都有一條側鏈能夠形成一個內醯胺或者一個側鏈之間的二硫化物鏈橋。
鹽的例子包括無機酸鹽和如蟻酸，醋酸，酒石酸，檸檬酸的有機酸鹽，無機酸鹽鹼基如鈉和氨，和有機酸鹽鹼基如三乙胺、乙胺和甲胺。
根據本發明的另一特徵，通過內醯胺的形成發生環化作用，包括所選胺基酸對如殘餘基22和26的側鏈耦合。同時也可能發生其它類型的環化作用，如包含類似物Cys22-Cys26的Cys之間的二硫化物橋的形成。
許多胺基酸替代物也被發現是有效的。Lys27可以用Leu或各種別的自然發生的疏水性或極性殘餘基取代。另一種因素是殘餘基適合受體情況如何。Ala並不和Leu一樣具有疏水性。Lys和Tyr總的認為是極化的，但是和受體有疏水性的相互影響。例如，Lys能夠拆疊以使疏水性部分與疏水性殘餘基或部分殘餘基在PTH受體中相互作用，並且其側鏈NH2官能團仍然暴露在溶劑當中。對於Lys而不是優選的Leu的可能替代物包括極性殘餘基如鳥氨酸和瓜氨酸，疏水性殘餘基如丙胺酸、已氨酸、異氨酸和酪氨酸或者任何直線型或側鏈上有2-10個碳的支鏈α-氨基脂肪酸，和任何一個在脂肪鏈的末端具有極性或帶電荷基團的類似物。極性或帶電荷基團的例子包括氨基、羧基、乙醯胺基、胍基和醯脲基。雖然Len27好像是最好的替代物，但是許多其它Pos27的替代物也保留近乎全部活性，並且也有值得讚賞的特徵，如提高的蛋白水解穩定性或水溶性。Lle、已氨酸、Met和鳥氨酸可能是最活躍的。
我們已經顯示雖然任何至少包含PTH的N-端的28個殘餘基的類似物都有腺苷酸環化酶刺激活性(Neugebauer，W.，Barbier，J.R.，Sung，W.L.，Whitfield，J.F.，Willick，G.E.(1995)，「溶解結構和腺苷酸環化酶-C端刺激活性截短了人體甲狀旁腺素類似物」，Biochemistry，348835-8842)，直線型自然序列中完全的合成代謝活性至少需要N-端的31個殘餘基(whitfield，J.F.，Morley，P.，Willick，G.E.，Ross，V.，Barbier，J.R.，Isaaces，R.J.，and Ohannessian，Barry L.，(1996)，「在切除卵巢的老鼠中，股小梁骨骼的生長刺激物依靠新型的甲狀旁腺激素片斷，hPTH(1-31)NH2(Ostabolin)」，Calcif.Tissue Int.5881-87)，並且，合成代謝的刺激物很可能帶有hPTH(1-30)NH2，但是，僅僅比帶有(1-31)類似物的劑量大一些(whitfield，J.F.，Morley，P.，Willick，G.E.，Maclean，S.，Ross，V.，Barbier，J.R.，and Isaacs，R.J.，(1999)，「在切除卵巢的老鼠中，股小梁骨骼的生長刺激物依靠人體甲狀旁腺激素hPTH(1-30)NH2)」，Calc.Tiss.Int.，65143-147)，這樣我們料想，較短的直線型類似物hPTH(1-28)和hPTH(1-29)也僅僅含有弱的合成代謝活性。HPTH(1-28)NH2的低活性將在以下例子中顯示。
進一步，我們現在已經有證據包括在以下例子中帶有Leu的替代物Lys-27和在殘餘基22和26之間的內醯胺的形成將腺苷酸環化酶激活活性引到與hPTH(1-34)相當的水平上，並且將合成代謝(骨骼生長刺激)活性引到與hPTH(1-34)相當的水平上。
NMR研究已經顯示，即使一個由CD發現是典型的高度螺旋狀的肽也具有許多非螺旋的結構。這樣，一個受體結合肽激素的結構，如PTH，不能從它在溶解狀態下的自由結構中可靠地推斷。結合肽激素類似物已被用於限制對肽可用的構態的數目。hPTH序列的檢查顯示了在穩定或不穩定α-螺旋的殘餘基17-29上的3種可能的鹽橋。這些是在Glu22和Lys26及Lys26和Asp30之間，他們都可能穩定α-螺旋，但在Lys27和Asp30之間，其不能穩定α-螺旋。在這些殘餘對之間的內醯胺的形成將在螺旋範圍內限制hPTH的可能的結構。進一步，其中的兩個可能穩定α-螺旋結構的內醯胺Glu22-Lys26和Lys26-Asp30位於α-螺旋的兩性分子部分的極化面上。第三個內醯胺Lys27-Asp30可能至少部分破壞α-螺旋的穩定性並且包括一個殘餘基Lys27，該內醯胺位於由殘餘基21-31所束縛的兩性分子螺旋的疏水面上。如果Lys或Orn取代位置25的Arg，Glu或Asp取代Gln29，在位置25和29之間內醯胺的環化也能夠發生。
用Leu替代Lys27導致了在兩性分子螺旋的疏水面上的更多疏水殘餘基。這就導致了在ROS細胞系中的腺苷酸環化酶激發活性的提高。通過那些現有技術，以上討論的這些替代物很可能導致具有同樣或提高的活性。
替代物和內醯胺結構的組合效果可能穩定了α-螺旋，而且提高了生物活性，並且使這個分子的區域不致於蛋白酶解降解。儘管一些肽酶能夠使肽水解，但在C-端的氨基化合物的存在作為優選，其原因是可能進一步保護肽不致於超蛋白酶解(exoproteolytic)降解。(Leslie，F.M.andGoldstein，A.(1982)Neuropeptides 2，185-196)。
已經發現，能夠有效地製造其它胺基酸替代物。特別地，根據日本專利公告61-24598，我們已經用自然發生的疏水殘餘基Nle取代了在位置8，18上的氧化敏感Met殘餘基。根據Nakagawa等人的美國專利5393869，其它的疏水殘餘基如Leu、Ile、Val、Phe和Trp也可能是有用的。
反轉的內醯胺也有可能。例如，我們已經顯示了一個22-26的轉變如Lys22-Glu26轉變的效力。所以類似的其它內醯胺之間的轉換可能有效地取得，如13-17內醯胺的轉換。
在Nakagawa等人的美國專利5393869和Fukuda等人的美國專利5434246中，報告一些替代hPTH類似物有顯著的AC活性，並且已經提高了對蛋白水解侵蝕的穩定性。特別地
1.Ser-1代替Aib(α-氨基異丁酸)；2.Lys-27代替Gln(報告有2.5×AC活性)；3.據該報告，代替Lys的殘餘基14，15，16，17的全部或部分活性提高達8×(這個可能由於殘餘基在水中溶解度的增加。在Vivo中，這些對於胰島素酶將更不穩定)。他們宣稱，這四肽中(包括殘餘基14-17)至少有一個水溶性的胺基酸。可能性包括His-14或Lys-14；Leu-15，Lys-15或Arg-15；Asn-16，Orn-16，Hci-16，Asp-16，Arg-16，Lys-16，D-Dlys-16，Ser-16或Gly-16；和Ser-17，Lys-17，Asp-17，Arg-17或Glu-17。因為我們的內醯胺，特別是在位置27上帶有Leu或者另一個疏水胺基酸，能夠成為微溶的和難溶的，所以可以預料，在內醯胺中同樣的替代物是有用的。
4.Arg25代替His使蛋白酶侵蝕最小化；現有技術中，雖然1-28hPTH環被優選，但從此處顯示的數據來看，環1-29片斷將也有可能是有效的。特別是，在文獻中沒有證明其它胺基酸的存在將影響激素的生物特性，也沒有證實美國申請系列號08/904760中包括1-30到1-34的數據，該專利的公開在此處一併作為參考。
已經發現具有兩個環的類似物在激活腺苷酸環化酶的細胞培養基中是十分活躍的。一種類似物包括的內醯胺環在殘餘基22和26之間而另一種類似物包括的內醯胺環在殘餘物13和17之間。一個例子是帶有兩個獨立環Glu22-Lys26和Lys13-Glu17的hPTH分子和一個優選的Leu27替代物。這種類似物，即使在AC-刺激物中不是很活躍，但是在如口服時是優選的。
根據本發明的類似物可以由下述已知程序來製備，並且可以用於刺激骨骼生長，骨骼恢復，在許多情況下促進骨骼癒合，如治療骨質疏鬆症和通常的骨折。


圖1顯示了自然hPTH的結構，殘餘基1-34.(序列號1)；圖2顯示了hPTH-NH2的結構，殘餘基1-31.(序列號2)；圖3顯示了〔Leu27〕cyclo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-28)-NH2的結構(序列號3)；圖4顯示了〔Leu27〕cyclo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-29)-NH2的結構(序列號4)；圖5顯示了〔Glu17，Leu27〕cyclo(Lys13-Glu17，Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-NH2的結構(序列號5)；圖6顯示了〔Glu17，Leu27〕cyclo(Lys13-Glu17，Glu22-Lys26)-hPTH-(1-28)-NH2的結構(序列號6)；圖7顯示了按照小梁骨骼厚度表達的，根據本發明(1-28)環化類似物的合成代謝活性；圖8顯示了按照小梁骨骼厚度表達的，根據本發明雙環化類似物的合成代謝活性。
具體實施例方式
激素類似物的製備由R.B.Merrifield開發的固相肽的合成技術(「固相肽合成」，Advances in Enzymology 32，221-296，1969)廣泛而成功地用於多肽的合成如甲狀旁腺激素，該技術在此處一併作為參考。其策略是基於附著固體支持物上肽的末端帶有羧基的胺基酸。然後，以高產出率連續加入胺基酸。N端α-氨基可以通過將其移開而不從固體支撐物移開肽來得到保護。此處用到的化學藥劑包括改進的Merrifield方法，稱作Fmoc方法。Fmoc(fluorenylmethoxycarbonyl)基團能夠在弱鹼條件下去除，留下了鹼基穩定側鏈保護基團和未動過的支撐物連接。這種技術由E.Atherton和R.C.Sheppard描述，見「固相肽合成一個實用的方法」，IRL Press，N.Y.，在此處一併作為參考。
本發明的類似物可以由恆溫哺乳動物在其需要時服用，特別是人通過注射、點滴、或者直腸用法，或者通過吸入或口服來服用。類似物傳統上以注射劑量形式計算，按照容許的配藥經驗的規定以每單位劑量約1到300mg的量與傳統的賦形劑(vechicle，excipent)、結合劑、保護劑、穩定劑、色素(color)、劑(agent)及其類似物複合。
對於注射用法，通過一個超精確的30個刻度的注射針頭根據病情進行1到2ml無痛皮下注射1到2年，一天至多注射一次，注射的物質將在水狀液的、等滲的、無菌的溶液或者懸浮液中(注意選擇一種保護劑如酚類或者一種溶解劑如已二胺四乙基酸(EDTA))包含本發明的其中一種。在運用容許的賦形劑和溶劑中是水，弱酸水，林格液和等滲的氯化鈉溶液。此外，傳統上也用無菌不揮髮油作為溶劑或懸浮介質。人造單甘油脂，二甘油脂，脂肪酸(如油酸)可以用作可注入藥物製備的不揮髮油。
對於直腸用法，本發明的類似物以栓劑的形式來製備，其通過與一種適合的非刺激性賦形劑如可可油或聚乙二醇混合。
對於局部的使用，本發明的類似物可以以軟膏、膠狀物、液劑、懸浮劑或皮膚粘性膏藥的形式來製備。
對於吸入用法，能夠通過如公告號W094/07514的PCT專利(此處其公開文本一併作為參考)所述的方法來製備。
每日用量不超過每公斤體重0.05mg的量或者大約70公斤體重3.5mg的量，其用法依賴於特殊成分的活性、年齡、體重、性別及治療對象的情況。
眾所周知，和載體物質結合產生一種單一劑量的活躍成份的量，根據治療者和特別的服用模式是不同的。實施例第一實施例[Leu27]cyclo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-28)-NH2和[Leu27]cyclo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-29)-NH2的合成；這個肽通過如Barbier，J.R.，Neugebauer，W.，Morley，P.，Ross，V.，Soska，M.，Whitfield，J.F.和WilLLLick.G(1997)所述來合成，結合的人體甲狀旁腺激素類似物的生物活性和二級結構是受體結合區域的環化內醯胺(J.Med chem.40，1373-1380)。將被環化的殘餘基Glu22和Lys-26分別被正交地保護作烯丙基酯和異構(alloc)派生物。環化作用在加入殘餘物17後發生。產品通過C18矽柱上的色譜儀(Vydac)所提純的純度大於97％，在0.1％三氟乙酸的水溶液中，乙醯乙酸的生理梯度以每分鐘1％的速度洗脫。所監測的分子重量在下面表1中顯示出。第二實施例〔Glu17，Leu27〕cyclo(Lys13-Glu17，Glu22-Lys26)hPTH(1-31)NH2的合成；這種合成物是在和實施例1的類似物的類似方法中獲得。Lys-13由異構(alloc)基團保護，Glu-17作為烯丙基酯被保護。在加入殘餘基17以後首次環化完成，並且殘餘基13和17之間的環化在全部合成完成之後進行，但是在支撐樹脂的裂解和側基團(非Lys-13和Glu-17)的破壞之前。監測的分子重量在下表1中示出。
表1

第三實施例腺苷酸環化酶激活活性24孔平板中ROS17/2細胞的4-5天培養基中腺苷酸環化酶活性可以從細胞ATP庫中〔3H〕-cAMP的形成速率來估計，見Jouishomme，H.；Whitfied，J.F.；Gagon，L.；Maclean，S.；Isaacs，R.；Chakravarthy，B.；Durkin，J.；Neugebauer，W.；Willick，G.；Rixon，R.H.Further Definition ofthe Protein Kinase C Activation Domain of the Parathyroid Hormone.J.Bone Miner.Res.1994，9，943-949。該細胞ATP庫在暴露到hPTH或其類似物之前標以〔3H〕-adenine。作為需要獲得半最大活性(ED50％)的類似物的濃度，腺苷酸環化酶活性在下表2中示出。
表2

第四實施例在切除卵巢老鼠模型中用於治療骨質疏鬆的〔Leu27〕c(Glu22-Lys26)hPTH(1-28)NH2的合成代謝活性一般，假切除卵巢的和切除卵巢的Sprague-Dawley老鼠(3個月大，性成熟)從Charles River Breeding Laboratories(St.Constant，QC，Canada)購買。它們自由分組，每7-8個分成一組。(注射賦形劑注射的、假切除卵巢的、以每100g體重5納摩爾hPTH-(1-28)NH2注射切除卵巢的、以每100g體重25納摩爾hPTH-(1-28)NH2，注射切除卵巢的、以每100g體重5納摩爾〔Leu27〕cyclo(Glu22-Lys26)hPTH-(1-28)NH2注射切除卵巢的)。動物用Purina鼠食(1.0％鈣，0.6％磷)餵養。這個實施例使用了一種預防的治療方案，其中溶解在酸性鹽賦形劑(0.15摩爾氯化鈉水溶液含有0.001的鹽酸)的肽的皮下注射是在一個重要的小梁損失已經開始之前在切除卵巢之後的第二個星期末啟動，然後連續6個星期，每星期6天，每天1次(即，在切除卵巢之後的第8個星期末)。在實驗的結尾，股骨和L5椎骨從安樂死動物中除去並清潔。將椎骨和股骨的末端部分減去它們的骺，放入10％的醋酸緩衝的福馬林溶液1個星期，然後在5％的三氯乙酸的溶液中攪拌脫鹽9-12天，然後脫水、清潔並包入石蠟中。8-μm厚的脫水、清潔並包裹石蠟的L5椎骨的系列橫截面和10-μm厚的包裹石蠟的末端股骨部分的系列縱截面用一個Leica RM-2035切片機切割，並且在55℃下Sanderson’s快速染色劑進行2分鐘的染色(Surgipath Medical Industries Inc.，Winnipeg，MB，Canada)。
對於在椎骨和末端股骨中刺激小梁生長的hPTH片斷的功能通過測量小梁的厚度可以估計(面積μm2/約80次測量的每根骨頭周長μm)。小梁面積和周長用一個來自Imaging research Inc.(St.Catherine’s，ON，Canada)的M4攝像系統來測量。用於判斷的軟體是Imaging Research’smorphometry Version 3.01.7。所有的組織形態度量測量都是由同一「盲」觀測者觀測末端股骨和L5椎骨來取得。
股骨的數據表達為方法±SEMs，統計比較通過變量的單向分析方法(ANOVA)來取得。Scheffe的實驗用作多次比較並且重要的是P＜0.05。
圖7顯示了假切除卵巢的，切除卵巢的和用5納摩爾/每100克體重的直線型hPTH(1-28)NH2(直線型(1-28))或者〔Leu27〕c(Glu22-Lys26)hPTH(1-28)NH2(環型(1-28))處理過的切除卵巢的小梁厚度。運用直線型分子的骨骼恢復比用環化的類似物需要25納摩爾/100g體重(數據未示出)的更大的劑量。第五實施例在切除卵巢(OVX)的老鼠的末端股骨刺激小梁生長的〔Glu17，Leu27〕cyclo(Lys13-Glu17，Glu22-Lys26)hPTH(1-31)NH2的功能。
被切除卵巢或者假切除卵巢的老鼠在切除卵巢後(OVX)第9個星期末和第15個星期末之間每天進行賦形劑的皮下注射。注射量是5納摩爾/100g體重。切除卵巢的老鼠每天收受賦形劑(OVX)，5納摩爾(直線型)hPTH(1-31)NH2，5納摩爾(環型)(Leu27)cyclo(Glu22-Glu26)hPTH(1-28)NH2，5納摩爾(雙環型)(Glu17，Leu27)cyclo(Lys13-Glu17，Glu22-Lys26)hPTH(1-31)NH2的皮下注射。股骨被脫鹽並用Sanderson的快速骨骼染色劑染色。如圖8所示，在提高所剩小梁的厚度方面雙環類似物(Glu17，Leu27)cyclo(Lys13-Glu17，Glu22-Lys26)hPTH(1-31)NH2比其對應單環類似物(Leu27)cyclo(Glu22-Glu26)hPTH(1-28)NH2要好。並且兩者都要比直線型分子hPTH(1-31)NH2要好。這種提高與其親緣AC-刺激活性並不相關，但是很可能緣於對蛋白水解侵蝕的高度穩定性和注射一側轉移的高度性能。
雙環hPTH(1-28)NH2，hPTH(1-29)NH2和hPTH(1-30)NH2與線型和單環形式相比也可能有改進的生物活性。
參考文獻下面公開的參考文獻在此參照結合。(1)Caulfield，M.P.；McKee，R.L.；Goldman，M.E.；Duong，L.T.；Fisher，J.E.；Gay，C.T.；DeHaven，P.A.；Levy，J.J.；Roubini，E.；Nutt，R.F.；Chorev，M.；Rosenblatt，M.The Bovine Renal Parathyroid Hormone(PTH)ReceptorHas Equal Affinity for 2 Different Amino Acid Sequences-The ReceptorBinding Domains of PTH and PTH-Related Protein Are Located Within the14-34 Region.Endocrinology 1990，127，83-87.(2)Neugebauer，W.；Barbier，J.-R.；Sung，W.L.；Whitfield，J.F.；Willick，G.E.Solution Structure and Adenylyl Cyclase Stimulating Activities of C-TermigalTruncated Human Parathyroid Hormone Analogues Biochemistry 1995，34，8835-8842.(3)Gardella，T.J.；Wilson，A.K.；Keutmann，H.T.；Oberstein，R.；Potts，J.T.；Kronenberg，H.M.，and Nussbaum，S.R.Analysis of ParathyroldHormone′s Principal Receptor-Binding Region by Site-Directed Mutagenesisand Analog Design.Endocrinology 1993，132，2024-2030.
序列表110瓊-勒內·巴比爾保羅·莫利詹姆斯·惠特菲爾德戈登·威利科120用於治療骨質疏鬆的甲狀旁腺激素類似物。13010688-1B14014115008/904,7601511997-08-011609170PatentIn Ver.2.0210121134212PRT213Homo sapiens4001Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His20 25 30Asn Phe210221131212PRT213Homo sapiens220223這個序列具有一個氨基團C-端(NH2)。4002Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn15 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val20 25 30210321128212PRT213Homo sapins220223環Glu22-Lys26，和該序列具有一個氨基團C-端(NH2)。4003Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu20 25210421129212PRT213Homo sapiens220223環Glu22-Lys26，和這個序列具有一個氨基團C-端(NH2)。4004Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln20 25210521131212PRT213Homo sapiens220223環Gys13-Glu17，環Glu22-Lys26，和這個序列具有一個氨基團C-端(NH2)。4005Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Glu Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30210621128212PRT213Homo sapiens220223環Lys13-Glu17，環Glu22-Lys26，和這個序列具有一個氨基團C-端(NH2)。4006Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Glu Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu20 25210721131212PRT213Homo sapiens220222(1)223Ser，Ala or Aib220222(8)223Met，Nle或一個自然發生的疏水胺基酸220222(13)223Lys，Orn，Glu，Asp，Cys or Hcys220222(14)223His或一個水溶胺基酸220222(15)223Leu或一個水溶胺基酸220222(16)223Asn或一個水溶胺基酸220222(17)223Ser，Glu，Asp，Lys，Orn，Cys，Hcys或一個水溶胺基酸220222(18)223Met，Nle或一個自然發生的疏水胺基酸220222(22)223Glu，Lys，Orn，Cys，Asp or Hcys220222(25)223Arg or His220222(26)223Lys，Orn，Glu，Cys，Asp or Hcys220222(27)223Lys，Leu，或一個自然發生胺基酸220223這個多肽也可以包含一個其中C-端帶有Gln或Gln-Asp的序列，並且這個序列也可以具有一個C-端NHR(R＝氫或任何直線型或支鏈烷基、醯基或芳烴基團)4007Xaa Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15Xaa Xaa Glu Arg Val Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Leu Gln Asp Val20 25 30210821129212PRT213Homo sapiens220222(8)223Met or Nle220222(18)223Met or Nle220222(22)223Glu，Asp，Lys，Orn，Cys or Hcys220222(25)223Arg or His220222(26)223Glu，Asp，Lys，Orn，Cys or Hcys220222(27)223Lys，Leu，Ala，or Nle220223這個多肽也可以包括一個其中C-端帶有Leu的序列，並且這個序列也可以具有一個C-端NHR(R＝氫或任何直線型或支鏈烷基、醯基或芳烴基團)4008Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Xaa Glu Arg Val Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Leu Gln20 25210921131212PRT213Homo sapiens220222(8)223Met or Nle220222(13)223Lys，Orn，Glu，Asp，Cys or Hcys220222(17)223Lys，Orn，Glu，Asp，Cys or Hcys220222(18)223Met or Nle220222(22)223Glu，Asp，Lys，Orn，Cys or Hcys220222(25)223Arg or His220222(26)223Lys，Orn，Glu，Asp，Cys or Hcys220222(27)223Lys，Leu，Nle或一個自然發生的疏水的或極化的胺基酸220223這個多肽也可以包括一個其中C-端帶有Gln或Gln-Asp的序列，並且這個序列也可以具有一個C-端NHR(R＝氫或任何直線型或支鏈烷基、醯基或芳烴基團)4009Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Xaa His Leu Asn1 5 10 15Xaa Xaa Glu Arg Val Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Leu Gln Asp Val20 25 306/權利要求
1.人體甲狀旁腺激素(hPTH)類似物或其配藥學上容許的鹽，其具有胺基酸序列R-NH-R1-Val-Ser-Glu-Lle-Gin-Leu-R8-His-Asn-Leu-Gly-R13-R14-R15-R16-R17-R18-Glu-Arg-Val-R22-Trp-Leu-R25-R26-R27-Leu---Y(系列ID號7)其中，R＝氫或任何直線型或支鏈型羥基，醯基或芳香基團，R1＝Ser，Ala或Alb，R8＝Met，Nle或一種自然發生的疏水性胺基酸，R13＝Lys，Orn，Glu，Asp，Cys或Hcys，R14＝His或一種水溶性的胺基酸，R15＝Leu或一種水溶性的胺基酸，R16＝Asn或一種水溶性的胺基酸，R17＝Ser，Glu，Asp，Lys，Orn，Cys，Hcys或一種水溶性的胺基酸，R18＝Met，Nle或一種自然發生的疏水性胺基酸，R22＝Glu，Lys，Om，Cys，Asp或Hcys(碳環化合物)，R25＝Arg或His，R26＝Lys，Orn，Glu，Cys，Asp或Hcys，R27＝Lys，Leu或一種自然發生的疏水性或極性胺基酸，Y＝X，Gln-X，Gln-Asp-X或Gln-Asp-Val-X，X＝OR或NHR，如果當Y＝X或Y＝Gln-X，一對或兩對胺基酸R13，R17及R22，R26環化和當Y＝Gln-Asp-X或Y＝Gln-Asp-Val-X，兩對胺基酸R13，R17及R22，R26環化時，所述胺基酸對的每個胺基酸都有一條側鏈能夠形成一個內醯胺或者一個側鏈之間的二硫化物鏈橋。
2.根據權利要求1的類似物，其中環化作用是內醯胺型的。
3.根據權利要求2的類似物，其包括一個R22-R26內醯胺。
4.根據權利要求3的類似物，其包括一個Glu22-Lys26內醯胺。
5.根據權利要求1的類似物，其中R是H，X是NH2。
6.根據權利要求5的類似物，其中R27是Lys或Leu。
7.人體甲狀旁腺激素(hPTH)類似物或其配藥學上容許的鹽，其具有胺基酸序列R-NH-Ser-Val-Ser-Glu-Lle-Gin-Leu-R8-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-R18-Glu-Arg-Val-R22-Trp-Leu-R25-R26-R27-Leu-Y(系列ID號8)其中，R＝氫或任何直線型或支鏈型羥基，醯基或芳香基團，R8＝Met或Nle，R18＝Met或Nle，R22＝Glu，Asp，Lys，Orn，Cys或Hcys，R25＝Arg或His，R26＝Glu，Asp，Lys，Orn，Cys或Hcys，R27＝Lys，Leu，Ala或Nle，Y＝X或Gln-X，和X＝OR或NHR，當胺基酸對R22和R26發生環化後，所述胺基酸對的每個胺基酸都有一條側鏈能夠形成一個內醯胺或者一個側鏈之間的二硫化物鏈橋。
8.根據權利要求7的類似物，其中R27是Lys或Leu。
9.根據權利要求8的類似物，其包括一個R22-R26內醯胺。
10.根據權利要求9的類似物，其具有系列ID號3。
11.根據權利要求9的類似物，其具有系列ID號4。
12.人體甲狀旁腺激素(hPTH)類似物，或其提供的配藥學上容許的鹽，其具有胺基酸序列RNH-Ser-Val-Ser-Glu-Lle-Gin-Leu-R8-His-Asn-Leu-Gly-R13-His-Leu-Asn-R17-R18-Glu-Arg-Val-R22-Trp-Leu-R25-R26-R27-Leu---Y(系列ID號9)其中，R＝氫或任何直線型或支鏈型羥基，醯基或芳香基團，R8＝Met或Nle，R13＝Lys，Orn，Glu，Asp，Cys或Hcys，R17＝Lys，Orn，Glu，Asp，Cys或Hcys，R18＝Met或Nle，R22＝Glu，Asp，Lys，Orn，Cys或Hcys，R25＝Arg或His，R26＝Lys，Orn，Glu，Asp，Cys或Hcys，R27＝Lys，Leu，Nle或一種自然發生的疏水性或極性胺基酸，Y＝X，Gln-X，Gln-Asp-X或Gln-Asp-Val-X，X＝OR或NHR，當兩個胺基酸對R13和R17及R22和R26發生環化後，每個胺基酸殘基R13和R17都有一條側鏈能夠形成一個內醯胺或者一個側鏈之間的二硫化物鏈橋，並且每個胺基酸殘基R22和R26都有一條側鏈能夠形成一個內醯胺或者一個側鏈之間的二硫化物鏈橋。
13.據權利要求12的類似物，其中R27是Lys或Leu。
14.根據權利要求13的類似物，其包括一個Glu22-Lys26內醯胺。
15.根據權利要求12的類似物，其具有系列ID號5。
16.根據權利要求12的類似物，其具有系列ID號6。
17.恆溫動物需要時服用的複合物，包括根據權利要求1的人體甲狀旁腺激素(hPTH)類似物結合配藥學上容許的載體或賦形劑。
18.對於需要治療的恆溫動物的治療方法，包括對於恆溫動物的服用方法和根據權利要求1的人體甲狀旁腺激素(hPTH)類似物的治療有效量。
19.根據權利要求18的方法，其中類似物具有系列ID號3。
20.根據權利要求18的方法，其中類似物具有系列ID號4。
21.根據權利要求18的方法，其中類似物具有系列ID號5。
22.根據權利要求18的方法，其中類似物具有系列ID號6。
全文摘要
本發明涉及能夠提高骨質恢復、生物活性的人體甲狀旁腺激素(hPTH)類似物。所述類似物有在胺基酸對13,17和22和26之間環化的單環(1－28)或(1－29)類似物,或者雙環(1－28)或(1－31)類似物。單環類似物在胺基酸對R22和R26環化。雙環類似物在胺基酸對R13、R17和R22、R26之間環化。同時描述了用於替代其它胺基酸的天然殘餘基的多種替代物。例如自然Lys
文檔編號C07K14/635GK1377371SQ00813217
公開日2002年10月30日 申請日期2000年9月21日 優先權日1999年9月22日
發明者瓊－勒內·巴比爾, 保羅·莫利, 詹姆斯·惠特菲爾德, 戈登·E·威利科 申請人:加拿大國家研究院